CN107607645B - 一种同时检测鱼肉中多种类兽药残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测鱼肉中多种类兽药残留的方法。该方法选择乙腈：甲醇：水的体积比为3：1：1内含1%乙酸（v/v）以及10mM EDTA‑Na₂的混合溶液作为提取溶剂对样品进行前处理，净化操作由一次低温放置处理和两次低温高速离心组成，以除去大多数共萃取的蛋白质和脂质杂质，最后利用超高效液相色谱串联Orbitrap高分辨质谱在正负两种离子化模式下完成所有目标物的定性检测和定量分析。本发明可同时测定鱼肉中80种，涵盖12类常见渔用兽药化合物，实现了鱼肉中兽药化合物的高灵敏、广谱、快速、高通量的普查。简便高效的前处理流程，保证了多类别多残留化合物的提取效率。超高效液相色谱串联Orbitrap高分辨质谱表现出的良好选择性以及灵敏度，可以在较低水平下完成对样品中潜在目标物的筛查定量。

Description

一种同时检测鱼肉中多种类兽药残留的方法

技术领域

本发明涉及一种食品中药物残留的检测方法，具体涉及一种基于高分辨质谱同时检测鱼肉中12大类共80种兽药残留的方法，属于药物残留检测技术领域。

背景技术

水产养殖业作为国民经济发展的重要领域之一，近几十年来在世界范围内得到了极大的发展。毫无疑问，兽药在其中发挥了很重要的作用。***粮食及农业组织FAO在2016年发布的世界渔业和水产养殖状况报告指出：在2014年，世界鱼类消费量已经达到了每人每年20kg的新纪录，同时渔业养殖供给消费者的供应量也第一次超过了野生捕获，并且这一趋势还将继续延续。但是，渔业养殖采用的也是类似于其他行业的密集或半密集的养殖方式，在很小的空间范围内，养殖大量的鱼类，这就大大增加了传染病发生和传播的风险。而各种兽药所展示出的疾病预防、治疗功效以及促进生长、提高产品性能的功效使得兽药已经成为了鱼类养殖日常水环境或者饲料中的重要一类添加物质。不适当的给药以及已经普及的亚治疗性给药，可能就会使消费市场上的鱼肉中含有一定浓度的兽药残留。

鱼肉中的兽药残留对于公众的饮食健康是个极大的威胁。抗菌类兽药就是最常见的兽药种类之一，除了一些例如β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、酰胺醇类、大环内酯类、林可酰胺类、肽类、多烯类等天然的抗生素类药物，也有许多的人造抗生素药物例如：磺胺类、喹诺酮类、硝基咪唑类、硝基呋喃类等。但是，诸多的抗菌类药物没有一种是专门针对水产养殖专门设计开发出来的，其中绝大多数兽药化合物是在所有的动物养殖领域被广泛使用的，这就容易造成抗性细菌和抗性基因沿着食物链在动物界产生和传播。最终这些抗性基因也许就会传入到人体病原菌体内。另一方面，出现在可食用鱼肉组织中的兽药残留物就会成为消费者食物的一部分，这将会是消费者健康的重大潜在威胁，例如一些过敏性个体将引发剧烈的过敏反应，如果长期低剂量的接触某种药物残留也会引发慢毒性甚至是三致。为了避免上述情形的发生，兽药化合物的使用必须要受到政府部门相关法律法规的严格管控。

为了控制食物中的兽药残留，相关的法律法规需要做三方面的工作：列出需要受到限定的化合物；给出官方的允许残留量；提供指导性的分析测定方法。其中，以欧盟为例，其拥有非常完整的食物安全管理体系，并且建立了一系列的管控法规。(EC)No 470/2009就给出了针对确定动物源性食物中药学活性物质残留限量的程序。后来，出于简单化的目的，欧盟颁布了(EU)No 37/2010直接明了的给出了动物源性食品中药学活性物质最高残留限量及其分类。其中列出了两个独立的表：一个针对允许使用的物质，包含在(EEC)No 2377/90中的附录I、II和III，另一个针对禁用的物质，包含在(EEC)No 2377/90中的附录IV。此外，欧盟还颁布了2002/657/EC号决议，专门针对分析测定方法的性能指标和结果的解释。

液相色谱-质谱法(LC-MS)是鱼肉中兽药残留检测最为常用的检测手段。因为其具有较高的灵敏性和选择性，可以在食品基质中完成痕量甚至超痕量水平上的定性、定量分析。考虑到成本效应，虽然微生物学技术和生物学技术拥有非常简便的操作和非常低廉的花费，但是一些额外需要的确证手段使他们失去了研究的吸引力。为了节约成本，仪器分析的发展研究更趋向于多残留同时检测，一次进样去完成对多个目标物的检测，超高效液相色谱(UHPLC)也可以提供更短的分析时间、更高的分辨率和灵敏度。所以近年来，有许多研究围绕使用LC-MS对食物中的多残留进行同时检测探究。但是，已发表的报道中，绝大多数研究都仅仅只能针对某类或者几类化合物种类进行，关于鱼肉中兽药多残留检测，更是极少有目标物种类数能够达到十个以上。并且，他们基本上都是基于液相色谱串联三重四极杆质谱等低分辨质谱进行的定性定量分析，这就需要针对每个目标物进行参数优化，当上百种化合物一起进行分析研究时，这就会是一个非常麻烦的工作。相比之下，通过Orbitrap高分辨质谱的全扫描模式进行的数据采集就完全不需要对每个目标物进行特殊优化处理，并且还可以对非目标物进行分析，采集的图谱也可以保留数年以方便对样品进行回顾性的分析。此外，高分辨质谱(HRMS)在检测的选择性及灵敏度方面的突出优势可以使在不降低方法灵敏度的前提下大大简化前处理步骤成为可能。以上所有的证据都指向HRMS在多目标物残留分析中是一个非常有前途的选择，并且这一点也已经得到了许多专家学者的认同。

因为目标物化学结构以及理化性质的巨大差异性，样品前处理成为了多残留同时检测分析的最大挑战。这里需要一个合适的提取方法去保证所有的目标物都可以被有效的从样品基质中提取出来，另一方面，还需要适当的净化手段去排除共萃取干扰物质。鱼肉中包含大量的蛋白质、脂肪和其他的干扰物质，当使用质谱为检测器时，它们不仅会影响仪器的选择性，还会导致检测信号的增强或减弱，尤其是电喷雾(ESI)模式下，即引发基质效应(ME)，它的更深层次机理成因还有待进一步研究了解。Croley等人2012的研究已经证明了，对于基质效应，仅仅是依赖质谱的分辨率是不够的，因为共萃取物质的信号抑制作用将会影响质量检测的准确度，也会使音噪比降低导致假阴性结果。此外，这些共萃取物质也会污染仪器，堵塞管道。

关于样品前处理的方法，已有的研究报道了许多方案，其中大多数所使用的都是液液萃取之后使用固相萃取(SPE)去净化的方式。但该方法过程复杂，需要消耗较多量的有机试剂，需要相关的萃取装置，耗材，并且在柱洗脱的过程中也容易造成一定程度的目标物流失。除此之外，也有一些报道通过研究分散固相微萃取(dSPE)的处理方式以期降低成本，提高效率，但依旧需要一些额外的试剂耗材，氮吹、复溶等繁琐的操作。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种简单、快速并且灵敏度高的用于同时检测鱼肉中12大类共80种兽药残留的方法。

针对鱼肉这一复杂基质，本发明在QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safe)方法上进行充分的优化改良，在保证较低的基质效应的同时，提升了萃取溶剂的提取效率，省去盐析、氮吹、复溶等一些容易引起目标物流失或影响方法稳定性的操作，对比设计出了最为简单实用且足够有效的净化方法，调节优化了各项液相、高分辨质谱的仪器参数，最终开发出一种非常简单高效的多兽药残留同时检测分析方案：选择乙腈：甲醇：水的体积比为3：1：1内含1％乙酸(v/v)以及10mM EDTA-Na₂的混合溶液作为提取溶剂，净化操作由一次低温放置处理和两次低温高速离心组成，以除去大多数共萃取的蛋白质和脂质杂质，最后利用超高效液相色谱串联Orbitrap高分辨质谱(UHPLC-HRMS)在正负两种离子化模式下完成所有目标物的定性检测和定量分析。

本发明的具体技术方案包括以下步骤：

(1)样品前处理：

将切块的鱼肉样品冷冻后再进行均质，取均质后的样品按质量体积比1:5加入提取溶液，使用涡旋仪涡旋后使用垂直的振荡器震荡，然后离心分离；取离心液放置在-20℃冰箱中冷冻30min，取出后再次离心，直接取上层溶液过微孔滤膜，待仪器检测分析。

(2)空白基质标准溶液的配制：

将经过反复确认没有任何目标残留物的样品作为空白样品，按照所述步骤(1)进行样品前处理，得到空白样品基质提取液，并以此为溶剂配制系列浓度梯度(至少5个)的基质标准工作溶液。

(3)标准添加样品的制备提取：

取一定量经过确认的空白样品，添加一定浓度的目标物，然后将其放在室内黑暗环境下静置15min以保证目标物与样品的充分渗透分散，然后按照步骤(1)进行标准添加样品前处理，此质控样品用于计算方法回收率。

(4)超高效液相色谱串联Orbitrap高分辨质谱分离测定：

将经过步骤(1)处理的样品提取液、步骤(2)所得到的系列浓度梯度基质标准工作溶液以及步骤(3)所得到的标准添加溶液进行超高效液相色谱串联Orbitrap高分辨质谱上机测定，通过分析标准溶液，确认各个目标物的色谱峰(保留时间RT，母离子及其特征子离子的精确质量数)。

(5)结果分析：

分析系列基质标准工作溶液，以各个目标物的色谱峰面积对其相应的浓度作回归直线分析，获取标准工作曲线，然后，对比相同浓度的标准添加溶液和基质标准溶液，以回收率评价该批样品前处理的质量；最后分析样品提取溶液，根据RT偏差和母离子以及特征子离子的精确质量数偏差(RT偏差0.1min以内，母离子以及特征子离子的精确质量数偏差在5ppm以内)确定是否有目标物被检出；若有目标物的色谱峰被检出，根据标准工作曲线进行定量分析。

步骤(1)中提取溶液为：乙腈：甲醇：水，3：1：1，v/v/v，内含1％乙酸(v/v)和10mMEDTA-Na₂。

步骤(4)中超高效液相色谱流动相的使用为：正离子模式：A：含0.1％(v/v)甲酸水溶液，B：甲醇；负离子模式：A：超纯水，B：乙腈。

液相色谱使用的梯度洗脱程序为：

步骤(4)中超高效液相色谱使用的色谱柱为反相色谱柱：Acquity UPLC BEH C18(100mm×2.1mm×1.7μm,Waters,Milford,USA)，柱温为35℃。

步骤(4)中Orbitrap高分辨质谱离子源参数如下：

a)离子化方式：HESI；

b)鞘气流速：40；

c)辅助气流速：10；

d)辅助气加热温度：300℃；

e)毛细管温度：320℃；

f)喷雾电压：正离子模式：3.5kV，负离子模式：-2.9kV；

g)S-lens RF：正离子模式：50，负离子模式：-50。

步骤(4)中Orbitrap高分辨质谱采用全扫描/数据依赖性二级扫描(Full MS/dd-MS²)的数据采集方式，具体参数如下：

a)全扫描数据采集分辨率设置为70000(FWHM,m/z 200)，正负离子模式的全扫描范围分别为140-1000m/z和150-400m/z，AGC Target为1e6，最大注入时间(Max IT)设为100ms。

b)dd-MS²进行二级碎片采集确认时，分辨率设为17500(FWHM,m/z 200)，离子选择窗口设为2.0m/z，AGC Target为2e5，Max IT为50ms，高能碰撞诱导解离(HCD)归一化碰撞能量(NCE)设置为20，40，60。

步骤(4)中所有目标物的分子式，保留时间，母离子、定性子离子的精确质量数以及线性范围，相关系数见表1。

表1所有目标物的分子式，保留时间，母离子、定性子离子精确质量数及其线性范围

本发明的有益效果如下：

本发明针对鱼肉这一复杂基质，得到了一种简单、快速高效的兽药多残留分析方法，在使用很少的化学试剂，没有固相萃取或是玻璃元件等装置的前提下，最大化的节约资源，降低成本，提升效率。同时，本发明优化探索了UHPLC-HRMS的各项仪器条件参数，依据该仪器条件下表现出的良好选择性以及灵敏度，可以在较低水平下完成对样品中潜在目标物的筛查定量。

本发明同时测定鱼肉中12大类80种兽药残留的方法与现有的技术不同之处在于：

采用新的超高液相色谱-高分辨质谱(Orbitrap)法同时测定鱼肉中80种，涵盖12类常见渔用兽药化合物，与现有技术中仅检测某类几个或是几类化合物的方法有较大区别，该方法适用于更广泛的筛查检测工作，可以实现鱼肉中兽药化合物的高灵敏、广谱、快速、高通量的普查。本研究在广泛适用性的基础上，开发出更为简便高效的前处理流程，保证了多类别多残留化合物的提取效率，这是现有技术不能解决的问题。

经摸索后，本发明使用提取液中含有20％比例的水分，不仅利于一些亲水性化合物的提取而且还利于在后续的净化步骤中沉淀脂质类杂质，而适当比例的甲醇对于某些化合物(林可霉素、克林霉素、四环素类)的提取也是必须的，使用1％的乙酸酸化提取溶液可以实现对12类目标物最大限度地增强提取效率(过高不利于大环内酯类和磺胺类目标物的提取，过低不利于喹诺酮类、四环素类、三苯甲烷染料类的提取效率，也不利于在实际样品检测过程中，酸解样品，提取目标物)。

本发明经过优化对比后采用Acquity UPLC BEH C18亚微米细径色谱柱，在该流动相体系下，所有目标物的色谱峰形对称性最佳，整体响应值最高，成功分离了6组同分异构体，80种目标物的色谱峰内采集点数(20-50个数据采集点)保证了方法的重现性。本发明建立的“一级全扫描/数据依赖性二级扫描”的高分辨质谱采集模式进行化合物定性定量分析，化合物确证识别能力相比传统单位分辨质谱的多重反应监测(MRM)模式大幅提高，并同时保证了方法的选择性和灵敏度。

附图说明

图1是样品中检出的孔雀石绿提取离子色谱图。

图2是样品中检出的恩诺沙星提取离子色谱图。

图3是样品中检出的氟苯尼考提取离子色谱图。

图4是样品中检出的诺氟沙星提取离子色谱图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例来进一步详细说明本发明。

下面的具体实施例以来自于本地(中国青岛)不同市场的42个外观新鲜健康的斑石雕样品为例进行多种类兽药残留同时检测。

(1)试剂与材料：

所有的粉状或者液体状的兽药标准物质购自Dr.Ehrenstorfer Gmbh(Augsburg,Germany)，Witega(Berlin,Germany)，Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)或者USPharmacopeia(Rockville,MD,USA)；乙腈(LC-MS级)和甲醇(LC-MS级)购自Merck(Darmstadt,Germany)；甲酸和乙酸购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)；乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-Na₂，分析纯)购自国药集团(上海，中国)；超纯水采用Milli-Q System(Millipore,Bedford,MA,USA)***制备。

依据各化合物的溶解性和稳定性使用乙腈、甲醇或者纯水配制各化合物的标准储备液(1000μg/mL)，储放在-20℃黑暗环境中，每6个月重新配置一次。考虑到β-内酰胺类的稳定性，将所有目标物分成两大组：β-内酰胺组和其他的物质组，使用甲醇配制不同浓度的两组混标工作液，储存在-20℃黑暗环境中，每周重新配置一次。

(2)样品前处理：

一共有42个外观新鲜健康的鱼肉样品来自于本地(中国青岛)的不同市场，所有的样品去皮去骨，切块后冷冻再进行均质，在分析测试前储藏在-20℃冰箱中。

称取1g(±0.01g)均质后的样品盛于15mL聚丙烯离心管中，加入5mL提取溶液(乙腈：甲醇：水，3：1：1，v/v/v，内含1％乙酸和10mM EDTA-Na₂)，旋紧盖子后使用涡旋仪(IKA,德国)涡旋1min(3200rpm)，之后使用一个垂直的振荡器(MMV-1000W,EYELA)震荡15min(320rpm)。然后离心15min(CR21GIII,HITACHI,日本，12 000rpm，4℃)，取上层液3mL转移到另一个15mL聚丙烯离心管中，将其放置在冰箱(-20℃)中30min，接着离心15min(12000rpm，4℃)。最后，取1mL上层液过尼龙微孔滤膜(0.22μm,博纳艾杰尔科技公司，中国天津)，储放于进样小瓶中待上机检测。

那些经过多次反复检测后没有色谱峰信号出现在目标物期望出现的区域的样品用来当作空白样品，它们将被用在方法开发优化和评价认证过程中，在进行上述前处理操作前加入适当体积的工作标准溶液或是稀释过的工作标准溶液，室温下放置15min，以确保标准液能够与基质进行充分的混合分散。

(3)仪器条件：

色谱分离通过Dionex UltiMate 3000UHPLC⁺(赛默飞科技，美国)实现，色谱柱使用Waters Acquity UPLC BEH C18(100mm×2.1mm,1.7μm)，ESI正离子模式的流动相组成为0.1％甲酸(v/v)(A)和甲醇(B)，ESI负离子模式的流动相组成为去离子水(A)和乙腈(B)。梯度洗脱程序如下：正负离子模式下均由5％的B开始，然后在前12min内，B的含量线性提升到95％，维持4min后立即下降到5％，之后进行第二次平衡时间为4min，整个梯度共花费20min，流速控制300μL/min不变，柱温35℃，进样体积为2μL。

质谱检测分析通过Q Exactive Focus高分辨质谱检测器(赛默飞科技，美国)实现，正负离子采集模式均采用加热电喷雾电离模式(HESI)。鞘气以及辅助气分别设置为40和10，辅助气的加热温度设为300℃。毛细管温度设为320℃，电喷雾电压正负离子模式分别设置为3.5kV和-2.9kV。正负离子模式的S-lens RF分别设置为50和-50。全扫描数据采集分辨率设置为70000(FWHM,m/z 200)，依据目标物的精确分子量将正负离子模式的全扫描范围分别设为140-1000m/z和150-400m/z，AGC Target为1e6，最大注入时间(Max IT)设为100ms。dd-MS2进行二级碎片采集确认时，分辨率设为17500(FWHM,m/z 200)，离子选择窗口设为2.0m/z，AGC Target为2e5，Max IT为50ms，高能碰撞诱导解离(HCD)归一化碰撞能量(NCE)设置为20，40，60。整个质谱的检测和分析软件为Q Exactive Tune，Xcalibur 4.0以及TraceFinder 3.3(赛默飞科技，美国)。

(4)UHPLC-HRMS分析测定：

在空白样品处理前后分别加入各目标物MRL的0.5倍、1倍和1.5倍三个浓度水平的混合标准工作液，每个水平做6个品行样，用以评价该方法的回收率和重复性、精密度。在空白样品处理之前添加一系列低浓度水平的混合标准工作液(0.25-25μg/kg)用以确认该方法的测定底限。在空白样品处理之前添加各目标物MRL浓度水平的混合标准工作液，用以评价该方法的决定限和检测容量(对于没有对鱼肉基质限定MRL值的目标物，为了评价针对该物质的方法性能，假设它们的MRL值为0.01mg/kg)。表2详细给出了各目标物的平均回收率、日内日间精密度、定量底限(LOQs)、决定限(CCα)、检测容量(CCβ)，证明了该发明方法的高效性、灵敏度和稳定性，针对已经在鱼肉中设定最大允许残留量的物质，该发明均能够满足测定LOQ<MRL的要求。

表2鱼肉样品各目标物的回收率以及其他方法验证参数

^a数据来自国际药典食物中兽药最大残留限量(MRLs)及风险管控(RMRs)，最近更新2015年6月。

^b为了方便评价该物质我们假设的MRL值为10μg/kg。

^c规定食物中所有出现的磺胺类物质总量不得高于100μg/kg.

^d Commission Decision(EU)2004/25/EC：关于设定动物源食物中某些残留物质最低要求执行限制对2002/657/EC决议的补增。规定食物中孔雀石绿及隐形孔雀石绿总量的最低要求执行限制为2μg/kg。

^e Commission Decision(EU)2003/181/EC：关于设定动物源食物中某些残留物质最低要求执行限制对2002/657/EC决议的补增。

经过确认(RT偏差0.1min以内，母离子以及特征子离子的精确质量数偏差在5ppm以内)之后，绘制各个目标物的基质标准工作曲线，用以分析测定42个石斑鲷样品中可能存在的兽药残留情况。

(5)实际样品检测分析结果：

在对上述来自本地(中国青岛)不同市场的42个斑石雕样品进行分析测试后，分析结果显示，其中三个样品分别检测到了28.24，10.51和9.07μg/kg的孔雀石绿，这种物质是明确规定在鱼肉中是禁止使用的药物，所以，这三个样品是不合格的阳性样品。此外，一个样品中发现了4.69μg/kg的恩诺沙星，另一个样品中发现了7.11μg/kg的氟苯尼考，但是它们的含量都低于他们各自在鱼肉中限定的最大残留量。还有两个样品中分别检测到了74.10μg/kg和5.18μg/kg的诺氟沙星，这种物质在欧盟或者国际药典相关法规中没有对鱼肉中做出明确的限量要求。还有一些样品中发现了一些痕量(<0.25μg/kg)的兽药化合物例如阿苯达唑、恩诺沙星、芬苯达唑、诺氟沙星、甲氧苄啶、土霉素以及甲砜霉素。有检出样品中目标物的提取离子色谱峰见图1-4。

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种同时检测鱼肉中多种类兽药残留的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)样品前处理：

将切块的鱼肉样品冷冻后再进行均质，取均质后的样品按质量体积比1:5加入提取溶液，所述提取溶液为体积比3：1：1的乙腈：甲醇：水溶液，内含体积比1％的乙酸和10mMEDTA-Na2；使用涡旋仪涡旋后使用垂直的振荡器震荡，然后离心分离；取离心液放置在-20℃冰箱中冷冻30min，取出后再次离心，直接取上层溶液过微孔滤膜，待仪器检测分析；

(2)空白基质标准溶液的配制：

将经过反复确认没有任何目标残留物的样品作为空白样品，按照所述步骤(1)进行样品前处理，得到空白样品基质提取液，并以此为溶剂配制系列浓度梯度的基质标准工作溶液；

(3)标准添加样品的制备提取：

取一定量经过确认的空白样品，添加一定浓度的目标物，然后将其放在室内黑暗环境下静置15min以保证目标物与样品的充分渗透分散，然后按照步骤(1)进行标准添加样品前处理；

(4)超高效液相色谱串联Orbitrap高分辨质谱分离测定：

将经过步骤(1)处理的样品提取液、步骤(2)所得到的系列浓度梯度基质标准工作溶液以及步骤(3)所得到的标准添加溶液进行超高效液相色谱串联Orbitrap高分辨质谱上机测定，通过分析标准溶液，确认各个目标物的色谱峰；

所述超高效液相色谱的色谱柱为反相色谱柱：Acquity UPLC BEH C18；

所述超高效液相色谱流动相为：正离子模式：A：含0.1％甲酸水溶液，B：甲醇；负离子模式：A：超纯水，B：乙腈；液相色谱使用的梯度洗脱程序为：

所述Orbitrap高分辨质谱离子源参数如下：

a)离子化方式：HESI；b)鞘气流速：40；c)辅助气流速：10；d)辅助气加热温度：300℃；e)毛细管温度：320℃；f)喷雾电压：正离子模式：3.5kV，负离子模式：-2.9kV；g)S-lens RF：正离子模式：50，负离子模式：-50；

所述Orbitrap高分辨质谱采用全扫描/数据依赖性二级扫描的数据采集方式，具体参数如下：

a)全扫描数据采集分辨率设置为70000，正负离子模式的全扫描范围分别为140-1000m/z和150-400m/z，AGC Target为1e6，最大注入时间设为100ms；

b)dd-MS2进行二级碎片采集确认时，分辨率设为17500，离子选择窗口设为2.0m/z，AGCTarget为2e5，Max IT为50ms，高能碰撞诱导解离归一化碰撞能量设置为20，40，60；

(5)结果分析：

分析系列基质标准工作溶液，以各个目标物的色谱峰面积对其相应的浓度作回归直线分析，获取标准工作曲线，然后，对比相同浓度的标准添加溶液和基质标准溶液，以回收率评价样品前处理的质量；最后分析样品提取溶液，根据保留时间RT偏差和母离子以及特征子离子的精确质量数偏差确定是否有目标物被检出；若有目标物的色谱峰被检出，根据标准工作曲线进行定量分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中的反相色谱柱：AcquityUPLC BEH C18的柱温为35℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(5)中控制保留时间RT偏差0.1min以内，母离子以及特征子离子的精确质量数偏差在5ppm以内。

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