CN111122551B - 一种三通道电化学发光传感器及其在细胞检测上的应用 - Google Patents

一种三通道电化学发光传感器及其在细胞检测上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种三通道电化学发光传感器及其在细胞检测上的应用，所述传感器包括以聚苯胺为基底的工作电极、Ag/AgCl电极和电化学发光分析仪；其中，三支工作电极和三支Ag/AgCl电极分别***三个独立的电解池中，并以并联的方式与电化学发光分析仪连接；其中，一支工作电极修饰鲁米诺功能化的金纳米颗粒，提供参比信号，同时对另外两支工作电极上的细胞分别进行Ru(bpy)3 2+和g‑C3N4标记，提供两个检测信号；最后，根据检测信号和参比信号之间的比值对细胞进行测定；本发明在一次电位循环扫描过程中，获得三个独立的电化学发光信号，同时提供了两种检测目标细胞的方法。本发明的电致化学发光三通道设计简单，提高了检测通量，操作简便，实用性强。

Description

一种三通道电化学发光传感器及其在细胞检测上的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种三通道电化学发光传感器及其在细胞检测上的应用。
背景技术
电化学发光(ECL)融合了电化学和化学发光的优点。由于其背景干扰低、设备简单以及时空可控性良好，ECL已经成为药物分析、免疫分析、环境分析以及临床诊断等领域强有力的分析方法。但在应用ECL技术检测癌细胞的时候，往往存在一定的局限性。比如，一方面由于癌细胞有多个特征标记物，而目前多数报道都是基于单一标志物的检测，癌细胞诊断的可靠性不高；另一方面，利用标记到细胞表面的单一ECL探针来进行细胞检测，但是由于某些分析环境和ECL仪器感光效率的变化，单一ECL信号的的绝对值也会有所变化，可能产生一定的测量误差，尤其是在低含量分析时。因此，很难建立ECL信号稳定且检测结果可信的细胞分析方法。
由于细胞导电性差，细胞与电极之间的空间小，使得细胞在电极上存在着严重的空间位阻，造成细胞下方ECL探针不能充分反应，难以提供不受细胞影响的参比信号，这就限制了比率型ECL技术在细胞检测方面的应用。
发明内容
本发明解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种三通道电化学发光传感器及其在细胞检测上的应用。
为解决上述问题，本发明的技术方案如下：
一种三通道电化学发光传感器包括三个并联电化学发光电解池***和电化学发光检测***；
所述并联电化学发光电解池***由三套工作电极和Ag/AgCl电极组成，并联接入电化学发光分析仪；
所述工作电极是聚苯胺水凝胶修饰的玻碳电极，连接电化学发光分析仪的工作端口；
所述Ag/AgCl电极同时连接电化学发光分析仪的参比端口和辅助端口。
三个并联电化学发光电解池***中，其中一支工作电极提供参比信号，另外两支工作电极提供分析信号，依据分析信号与测量信号的比值来对细胞的浓度的进行检测。
优选地，具体检测方法为：
步骤1，电极修饰：
步骤1.1、首先分别用聚苯胺水凝胶修饰玻碳电极A、B、C，制得GCEA/PAniH、GCEB/PAniH、GCEC/PAniH；
步骤1.2、将GCEB/PAniH上的聚苯胺负载鲁米诺功能化的金纳米颗粒(Lu-AuNPs)，再特异性捕获MCF-7细胞；
步骤1.3,、将GCEA/PAniH、GCEC/PAniH/FA特异性捕获标记有g-C3N4和RuSiO2 NPs的MCF-7细胞；
步骤2，电化学发光信号的采集：
将步骤1制得的负载有细胞的GCEA/PAniH、GCEB/PAniH和GCEC/PAniH电极分别接入所述三通道电化学发光传感器的三个并联电化学发光电解池***中，采集g-C3N4、Lu-AuNPs和RuSiO2的ECL信号，分别为ECLA、ECLB和ECLC；
步骤3，细胞检测分析
以g-C3N4和RuSiO2的ECL为分析信号的ECL为分析信号，Lu-Au NPs的ECL为参考信号，拟合ECLA/ECLB和ECLC/ECLB与细胞浓度的关系，得出线性回归方程；
将待检测的细胞进行步骤1和步骤2的操作，将获得的ECLA、ECLB和ECLC代入步骤3所得的线性回归方程，即可实现细胞检测分析的目的。
优选地，所述步骤1.1的具体方法为：
混合溶液A:2ml H2O、0.921mL质量分数为50％的植酸水溶液和0.458mL苯胺；溶液B:0.286g过硫酸铵溶于1ml H2O中；溶液A和B放入冰箱冷却至4℃；5μLA和B混合溶液迅速滴涂在洁净的GCE上。
优选地，所述步骤1.2的具体方法为：
将活化后的叶酸滴加到GCEB/PAniH上制得GCEB/PAniH/FA，然后滴涂Lu-Au NPs，然后再同B组细胞悬液一起在37℃下孵育；所述B组细胞悬液为HA-RuSiO2、EGF-g-C3N4与经多聚甲醛处理后的细胞共同孵育制得，其中HA-RuSiO2为透明质酸(HA)修饰的氨基化三联吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米颗粒(RuSiO2 NPs)，EGF-g-C3N4为表皮生长因子(EGF)修饰的g-C3N4。
优选地，所述步骤1.3的具体方法为：
将活化后的叶酸分别滴加到GCEA/PAniH、GCEC/PAniH上制得GCEA/PAniH/FA、GCEC/PAniH/FA，然后再分别同A、C组细胞悬液一起在37℃下孵育；所述A组细胞悬液为EGF-g-C3N4与经多聚甲醛处理后的细胞共同孵育制得，所述C组细胞悬液为HA-RuSiO2与经多聚甲醛处理后的细胞共同孵育制得，其中HA-RuSiO2为透明质酸(HA)修饰的氨基化三联吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米颗粒(RuSiO2 NPs)，EGF-g-C3N4为表皮生长因子(EGF)修饰的g-C3N4。
优选地，所述电化学发光电解池***的电解液均为含有K2S2O8、PBS和TPA的电解质溶液。
优选地，所述步骤2采用循环伏安法在0.7V～-1.4V电位范围内进行电位扫描，扫描速度控制在0.1V·s-1，采集g-C3N4、Lu-Au NPs和RuSiO2的ECL信号。
优选地，所述线性回归方程为：ECLA/ECLB＝(7.943×10-5)Ccell+0.5429和ECLC/ECLB＝(9.391×10-4)Ccell+0.1953。
相对于现有技术，本发明的优点如下，
本发明在一次电位循环扫描过程中，获得三个独立的电化学发光信号，同时提供了两种检测目标细胞的方法；
本发明的电致化学发光三通道设计简单，提高了检测通量，操作简便，实用性强；
本发明建立ECL信号稳定且检测结果可信的细胞分析方法，该检测方法检测迅速、响应灵敏；
本发明的检测方法中，ECLA/ECLB和ECLC/ECLB与细胞分别在5.0×102～2.5×104cellsmL-1和5.0×102～5.0×104cells mL-1浓度范围内在呈良好的线性关系，检出限均能达到200cells mL-1。
附图说明
图1：三通道电化学发光传感器示意图；
图2：g-C3N4(A)、RuSiO2 NPs(B)和L-Au NPs(C)的TEM图；PAniH(D)和负载由L-AuNPs的PAniH(D)的SEM图；
图3：A图为随MCF-7细胞浓度变化的ECL曲线图(1到11：5.0×102,1.0×103,2.5×103,5×103,7.5×103,1.0×104,2.5×104,5×104,7.5×104,1.0×105and 2.5×105cells·mL-1)；B图为ECLA/ECLB相对于MCF-7细胞浓度的校正曲线；C图为ECLC/ECLB相对于MCF-7细胞浓度的校正曲线。
具体实施方式
实施例1：
1)药品和仪器信息：
鲁米诺、苯胺、植酸、三丙胺(TPA)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、过硫酸钾(K2S2O8)、透明质酸(HA)、三(2,2’-双吡啶基)三氯化钌(II)六水化物(Ru(bpy)3Cl2·6H2O)、叶酸(FA)、乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)，羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自Sigma-Aldrich(USA)公司。四氯金酸氢三水合物(HAuCl4·3H2O)由上海源业生物科技有限公司合成。三聚氰胺、过硫酸铵((NH4)2S2O8)、triton X-100、正硅酸四乙酯(TEOS)、氨溶液(NH3·H2O,25％)和1-己醇从阿拉丁实业有限公司(中国上海)获得。表皮生长因子(EGF)购自美国Cell Signaling Technology公司。所有的溶液都用去离子水。
MPI-E检测***(西安瑞迈)用于电化学发光分析。扫描电子显微镜(SEM)表征使用Hitachi S-4800。透射电子显微镜(TEM)使用JEOL-2100。紫外可见吸收光谱在NANODROP2000c分光光度计上获得。
细胞和细胞实验所需试剂由南京凯基生物技术有限公司提供。人乳腺癌细胞(MCF-7)、用DMEM培养基培养。DMEM成分：10％胎牛血清，4.5g·L-1的葡萄糖，0.584g·L-1的谷酰胺，3.7g·L-1的碳酸氢钠，0.11g·L-1丙酮酸钠，80U·mL-1的青霉素和80mg·mL-1链霉素。
2)聚苯胺水凝胶修饰电极的制备：
混合溶液A:2ml H2O、0.921mL植酸(50％w/w在水中)和0.458mL苯胺(5mmol)。溶液B:0.286g过硫酸铵(1.25mmol)溶于1ml H2O中。溶液A和B放入冰箱冷却至4℃。5μLA和B混合溶液迅速滴涂在洁净的GCE上。混合溶液在3分钟内聚合交联形成聚苯胺水凝胶(PAniH)，在4℃冰箱放置30分钟后，将电极浸泡在去离子水中30分钟，去除多余的离子和有机物，室温干燥后得到聚苯胺水凝胶修饰电极(GCE/PAniH)。用聚苯胺对三个工作电极进行修饰，用以克服细胞在电极上的空间位阻。
3)羧基化g-C3N4的合成：
三聚氰胺在马弗炉中加热到550℃，升温速度控制在2.3℃·min-1，加热4h。产品冷却至室温，然后研磨成粉末。称取1g g-C3N4粉末，加入到100mL 4M HNO3中，在120℃温度下加热回流24h，冷却后以12000rpm转速进行离心，获得酸化的g-C3N4，然后用去离子水洗涤至pH 7.0。最后，在烘箱中干燥12h，温度控制在35℃，最终得到羧基化的g-C3N4。将200mg的上述g-C3N4超声分散于100mL去离子水中，然后以8000rpm转速离心15min，除去大块状g-C3N4。随后，将上清液加热浓缩，然后用去离子水稀释至5.0mL备用。如图2A所示，g-C3N4呈现200nm左右大小的片状结构。
4)氨基化三联吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米颗粒(RuSiO2 NPs)的合成：
首先，将1.77mLTriton X-100与7.5mL环己烷和1.8mL正己烷在25℃下混合。搅拌30分钟后，将340μL0.04M Ru(bpy)3 2+添加到此混合溶液中。经过30min的搅拌后，加入100μLTEOS。搅拌5min后，加入60μLof NH3·H2O引发的聚合反应。25℃下搅拌24min，得到RuSiO2NPs。然后，加入2mL丙酮到混合溶液中，超声10min以打破乳液。用乙醇沉淀洗涤三次，再用去离子水洗涤一次，去除残留的表面活性剂分子和多余的Ru(bpy)3 2+。最后，用乙醇分散到4mL。取1mL RuSiO2 NPs溶液，并用乙醇稀释到5mL，随后加入400μLAPTES，30℃下搅拌反应8h，分别用乙醇和去离子水洗涤2次，去除多余的APTES。最终制备成氨基功能化的RuSiO2NPs，室温下密闭保存，以备后续实验使用。如图2B所示，RuSiO2NPs呈现70nm左右大小的球形结构。
5)鲁米诺功能化的金纳米颗粒(Lu-Au)的合成：
将100mL的HAuCl4(0.01％w/w)溶液加热至沸腾。剧烈搅拌的同时，迅速加入1.8mL0.01M的鲁米诺溶液。煮沸30min，直到溶液变成酒红色后停止反应。Lu-Au胶体在室温下再保存20min，4℃保存。如图2C所示，Lu-Au呈现20nm左右大小的球形结构。
6)ECL探针g-C3N4和RuSiO2 NPs的生物功能化：
表皮生长因子(EGF)和透明质酸(HA)能够分别于细胞表面的表皮生长因子受体和糖蛋白CD44特异性结合，因此可以利用EGF和HA对ECL探针进行生物功能化。对于EGF-g-C3N4，首先，室温下将羧基化的g-C3N4(30mg·mL-1，1mL)在含有20mM EDC和10mM NHS的混合液中活化1h。然后，100μL 50ng·mL-1EGF与活化后的g-C3N4反应12h。接下来，以10000rpm的转速对EGF-g-C3N4进行离心10min，并用离子水洗涤三次。最后，将EGF-g-C3N4用PBS溶液(10mM,pH 7.4)稀释至1.0mL，并在4℃下保存。对于HA-RuSiO2，室温下1mL氨基化的RuSiO2NPs与含有1mM HA、20mM EDC和10mM NHS混合溶液温和反应6h。沉淀下来的RuSiO2 NPs由去离子水洗涤3次，然后分散于1.0mL的PBS溶液(10mM，pH 7.4)中，在4℃保存。
7)三通道电化学发光传感器的制备：
叶酸(FA)在含有20mM EDC和10mM NHS的混合溶液中活化12h。然后，将活化后的FA滴加到GCE/PAniH上，反应4h，FA上-COOH与PAniH上的-NH3形成酰胺键，从而将FA连接到PAniH上。用PBS将GCE/PAniH/FA上游离的FA小心淋洗除去。经4％多聚甲醛处理后的MCF-7细胞分成三组(A、B、C)，HA-RuSiO2(C组)、EGF-g-C3N4(A组)和两种ECL探针(B组)分别与MCF-7细胞一起孵育30min，对细胞进行ECL探针标记。将C组、A组细胞悬液分别滴入GCEC/PAniH/FA、GCEA/PAniH/FA上，37℃孵育1h。GCEB/PAniH/FA预先滴涂Lu-Au NPs(负载Lu-Au NPs前后的PAniH分别如图2D和E所示)，然后在同B组细胞悬液一起在37℃下孵育1h。在此步骤中，细胞通过电极上的FA与MCF-7表面的FA受体的特异性作用而被捕获到电极上。
图1为用于MCF-7细胞检测的的三通道比值ECL平台示意图。三个独立的电化学发光电解池(A，B，C)分别采用三个ECL体系(A：g-C3N4/过硫酸钾；B：鲁米诺/溶解氧；C：三联吡啶钌/三丙胺)，其中并联的三支玻碳电极作为工作电极，并联的三支Ag/AgCl电极同时作为参比电极和辅助电极。玻碳电极A、B、C首先进行聚苯胺水凝胶(PAniH)修饰，B电极上的聚苯胺负载鲁米诺功能化的金纳米颗粒(Lu-Au)，然后再特异性捕获MCF-7细胞，A和C电极特异性捕获标记有g-C3N4和RuSiO2 NPs的MCF-7细胞。一个电位循环扫描过程中，分别在-1.65V、0.7V和1.2V左右的位置处出现g-C3N4、Lu-Au和RuSiO2 NPs的ECL信号。
8)电化学发光信号的采集：
负载有细胞的GCEA/PAniH、GCEB/PAniH和GCEC/PAniH电极分别***含有0.1MK2S2O8、0.2M PBS和0.1M TPA溶液的溶液中，三支工作电极以及与之相匹配的Ag/AgCl电极均并联连接到电化学发光分析仪上。采用循环伏安法在0.7V～-1.4V电位范围内进行电位扫描，扫描速度控制在0.1V·s-1，光电倍增管电压设为600V。采集g-C3N4、Lu-Au NPs和RuSiO2的ECL信号。
9)三通道比率型电化学发光细胞传感器的应用：
本发明中，细胞表面标记的g-C3N4和RuSiO2的ECL信号随细胞浓度的增加而增加，但Lu-Au NPs信号保持稳定，如图3A所示。以g-C3N4和RuSiO2的ECL为分析信号的ECL为分析信号，Lu-Au NPs的ECL为参考信号。ECLA/ECLB和ECLC/ECLB与细胞分别在5.0×102～2.5×104cells mL-1和5.0×102～5.0×104cells mL-1浓度范围内在呈良好的线性关系(图3B和C)。线性回归方程分别为ECLA/ECLB＝(7.943×10-5)Ccell+0.5429和ECLC/ECLB＝(9.391×10-4)Ccell+0.1953，相关系数R分别为0.9803和0.9884，检出限均能达到200cells mL-1。
需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种三通道电化学发光传感器，其特征在于，包括三个并联电化学发光电解池***和电化学发光检测***；
所述并联电化学发光电解池***由三套工作电极和Ag/AgCl电极组成，并联接入电化学发光分析仪；
所述工作电极是聚苯胺水凝胶修饰的玻碳电极，连接电化学发光分析仪的工作端口；
所述Ag/AgCl电极同时连接电化学发光分析仪的参比端口和辅助端口；
所述三通道电化学发光传感器的细胞检测方法为：
步骤1，电极修饰：
步骤1.1、首先分别用聚苯胺水凝胶修饰玻碳电极A、B、C，制得GCEA/PAniH、GCEB/PAniH、GCEC/PAniH；
步骤1.2、将GCEB/PAniH上的聚苯胺负载鲁米诺功能化的金纳米颗粒(Lu-Au NPs)，再特异性捕获MCF-7细胞；
步骤1.3,、将GCEA/PAniH、GCEC/PAniH/FA特异性捕获标记有g-C3N4和RuSiO2 NPs的MCF-7细胞；
步骤2，电化学发光信号的采集：
将步骤1制得的负载有细胞的GCEA/PAniH、GCEB/PAniH和GCEC/PAniH电极分别接入所述三通道电化学发光传感器的三个并联电化学发光电解池***中，采集g-C3N4、Lu-Au NPs和RuSiO2的ECL信号，分别为ECLA、ECLB和ECLC；
步骤3，细胞检测分析
以g-C3N4和RuSiO2的ECL为分析信号的ECL为分析信号，Lu-Au NPs的ECL为参考信号，拟合ECLA/ECLB和ECLC/ECLB与细胞浓度的关系，得出线性回归方程；
将待检测的细胞进行步骤1和步骤2的操作，将获得的ECLA、ECLB和ECLC代入步骤3所得的线性回归方程，实现细胞检测分析的目的。
2.如权利要求1所述的三通道电化学发光传感器，其特征在于，所述步骤1.1的具体方法为：
混合溶液A:2ml H2O、0.921mL质量分数为50％的植酸水溶液和0.458mL苯胺；溶液B:0.286g过硫酸铵溶于1ml H2O中；溶液A和B放入冰箱冷却至4℃；5μL A和B混合溶液迅速滴涂在洁净的GCE上。
3.如权利要求1所述的三通道电化学发光传感器，其特征在于，所述步骤1.2的具体方法为：
将活化后的叶酸滴加到GCEB/PAniH上制得GCEB/PAniH/FA，然后滴涂Lu-Au NPs，然后再同B组细胞悬液一起在37℃下孵育；所述B组细胞悬液为HA-RuSiO2、EGF-g-C3N4与经多聚甲醛处理后的细胞共同孵育制得，其中HA-RuSiO2为透明质酸修饰的氨基化三联吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米颗粒，EGF-g-C3N4为表皮生长因子修饰的g-C3N4。
4.如权利要求1所述的三通道电化学发光传感器，其特征在于，所述步骤1.3的具体方法为：
将活化后的叶酸分别滴加到GCEA/PAniH、GCEC/PAniH上制得GCEA/PAniH/FA、GCEC/PAniH/FA，然后再分别同A、C组细胞悬液一起在37℃下孵育；所述A组细胞悬液为EGF-g-C3N4与经多聚甲醛处理后的细胞共同孵育制得，所述C组细胞悬液为HA-RuSiO2与经多聚甲醛处理后的细胞共同孵育制得，其中HA-RuSiO2为透明质酸修饰的氨基化三联吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米颗粒，EGF-g-C3N4为表皮生长因子修饰的g-C3N4。
5.如权利要求1所述的三通道电化学发光传感器，其特征在于，所述电化学发光电解池***的电解液均为含有K2S2O8、PBS和TPA的电解质溶液。
6.如权利要求1所述的三通道电化学发光传感器，其特征在于，所述步骤2采用循环伏安法在0.7V～-1.4V电位范围内进行电位扫描，扫描速度控制在0.1V·s-1，采集g-C3N4、Lu-Au NPs和RuSiO2的ECL信号。
7.如权利要求1所述的三通道电化学发光传感器，其特征在于，所述线性回归方程为：ECLA/ECLB＝(7.943×10-5)Ccell+0.5429和ECLC/ECLB＝(9.391×10-4)Ccell+0.1953。
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