CN110702758B - 一种增强鳞状细胞癌抗原在电化学发光检测时的发光强度的方法 - Google Patents

一种增强鳞状细胞癌抗原在电化学发光检测时的发光强度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种增强鳞状细胞癌抗原在电化学发光检测时的发光强度的方法，主要包括电化学发光传感器的构建步骤，该构建步骤包括：配制一定浓度的SCCA溶液，并将该SCCA滴加到聚合物分子印迹修饰电极上孵育，孵育完成后水洗，然后再在电极上滴加Fe‑MIL‑88‑NH2@ZnSe/Ab/BSA复合物并孵育，孵育完成后水洗，晾干，即为电化学发光传感器；使用上述制得的电化学发光传感器置于含有共反应剂的PBS缓冲液中进行电化学发光检测，即可有效增强SCCA在电化学发光检测时的发光强度。本发明构建的电化学发光传感器选择性好、灵敏度高，将其用于电化学发光检测SCCA时，有效增大方法的线性范围并提高检测灵敏度。

Description

一种增强鳞状细胞癌抗原在电化学发光检测时的发光强度的 方法
技术领域
本发明涉及一种增强鳞状细胞癌抗原在电化学发光检测时的发光强度的方法，属于生物检测技术领域。
背景技术
***是全球常见的女性癌症。鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinomaantigen,SCCA)是一种亚型糖蛋白，分子量大约为45到55kDa，首次从子宫颈鳞癌组织中分离得到(Wu L,Hu Y F,Sha Y H,Li W R,Yan T T,Wang S,Li X,Guo Z Y,Zhou J,Su XR.An“in-electrode”-type immunosensing strategy for the detection of squamouscell carcinoma antigen based on electrochemiluminescentAuNPs/g-C3N4nanocomposites[J].Talanta,2016,160:247-255.)。最初，SCCA被发现是一种良好的特异性抗原用于宫颈鳞状细胞癌的诊断与监测。后来，SCCA被发现与其他类型的癌症有关，包括肺癌、头颈部癌症，黑素瘤，肝细胞癌等。到目前为止，针对血清中SCCA的检测，已经制定了多种免疫检测方案，如酶联免疫吸附法(ELISA)，放射免疫检测法(RIA)，化学发光免疫分析法(CLIA)，光电化学免疫分析法，以及电化学免疫分析法等。在现有的分析方法中，某些方法需要昂贵的实验设备和较高的技术要求，另一些方法则比较繁琐，不利于快速分析。电化学发光分析方法具有分析速度快、操作简单、成本低、试剂用量少、检测灵敏度高等优点，广泛应用于临床诊断(Ma H M,Zhao Y H,Liu Y Y,Zhang Y,Wu D,Li H,Wei Q.A compatiblesensitivity enhancement strategy for electrochemiluminescenceimmunosensorsbased on the biomimetic melanin-like deposition[J].Analytical Chemistry,2017,89:13049-13053.Wang H,Pu G Q,Devaramani S,Wang Y F,Yang Z F,Li L F,Ma X F,LuX Q.Bimodal electrochemiluminescence of g-CNQDs in the presence of doublecoreactants for ascorbic acid detection[J].Analytical Chemistry,2018,90:4871-4877.)。
分子印迹聚合物(molecular imprinted polymer,MIPs)对识别目标分子具有较高的特异性。MIPs中印迹的结合位点在形状和大小上与模板分析物互补。分子印迹聚合物广泛应用于检测有机小分子，蛋白质和生物标志物。受到海洋贻贝生物粘附原理的启发，Messersmith和他的同事发现多巴胺(Dopamine,DA)在碱性条件下可以自发聚合，可以在多种底物上形成具有潜在反应活性的聚多巴胺(Polydopamine,PDA)涂层(Wang J L,Li B C,Li Z J,Ren K F,Jin L J,Zhang S M,Chang H,Sun Y X,Ji J.Electropolymerizationof dopamine for surface modification of complex-shaped cardiovascular stents[J].Biomaterials,2014,35:7679-7689.)。PDA由于其结构简单、生物相容性好等优点，近年来在生物材料表面改性方面引起了广泛的关注和研究。
金属有机骨架(metal-organic frameworks,MOFs)是一种由金属离子和有机配体组成的多孔材料，在气体储存、催化、传感和分离等领域有着广泛的应用。Fe-MIL-88MOFs是一种易于合成、尺寸可控及水溶性好的MOF(Xie S B,Ye J W,Yuan Y L,Chai Y Q,YuanR.Amultifunctional hemin@metal-organic framework and its application toconstruct an electrochemical aptasensor for thrombin detection[J].Nanoscale,2015,7:18232-18238.)。同时Fe-MIL-88MOFs也是一类晶体微孔材料，可以作为装载量子点的载体。但目前尚未见有以Fe-MIL-88-NH2金属有机骨架装载ZnSe量子点所得复合物再结合电沉积分子印迹技术构建电化学发光传感器从而增强鳞状细胞癌抗原在电化学发光检测时的发光强度的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能够有效增强鳞状细胞癌抗原在电化学发光检测时的发光强度的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种增强鳞状细胞癌抗原在电化学发光检测时的发光强度的方法，主要包括电化学发光传感器的构建步骤，该电化学发光传感器的构建步骤包括：配制一定浓度的鳞状细胞癌抗原溶液，并将该鳞状细胞癌抗原溶液滴加到聚合物分子印迹修饰电极上孵育，孵育完成后水洗，然后再在电极上滴加Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab/BSA复合物并孵育，孵育完成后水洗，晾干，晾干后的电极即为电化学发光传感器；
使用上述制得的电化学发光传感器置于含有共反应剂的PBS缓冲液中进行电化学发光检测，即可有效增强鳞状细胞癌抗原在电化学发光检测时的发光强度；其中，
所述的聚合物分子印迹修饰电极按下述方法进行制备：将工作电极置于含有鳞状细胞癌抗原的多巴胺溶液中，用循环伏安法扫描以在工作电极上使聚合物分子印迹形成膜，取出，水洗，然后再将电极上的鳞状细胞癌抗原洗脱，再水洗，晾干，得到聚合物分子印迹修饰电极；
所述的Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab/BSA复合物按下述方法进行制备：先获得在Fe-MIL-88-NH2金属有机骨架负载ZnSe量子点的Fe-MIL-88-NH2@ZnSe复合物，然后将其置于EDC溶液中孵育，之后向其中加入鳞状细胞癌抗原相应的抗体(Ab)并孵育，孵育完成后离心，收集沉淀，即为Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab复合物，再用牛血清白蛋白(BSA)封闭该复合物的非特异性结合位点，即得到Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab/BSA复合物，所得复合物保存于PBS缓冲液中，备用；
上述方法中涉及的PBS缓冲液为浓度为0.1～0.12mol/L、pH＝7.3～7.5的PBS缓冲液。
上述方法中，所述的EDC为1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基碳化三亚胺)，所述的BSA为牛血清白蛋白，所述的PBS缓冲液优选为浓度为0.1mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液，所述的工作电极可以是玻碳电极(GCE)或金电极等常用工作电极。
在上述电化学发光传感器的构建步骤中，优选是配制浓度为1ng/mL的鳞状细胞癌抗原溶液，将鳞状细胞癌抗原溶液滴加到聚合物分子印迹修饰电极上孵育的时间优选为40～60min，而后续在电极上滴加Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab/BSA复合物后孵育的时间则优选为50～90min。
本申请人的试验结果表明，上述方法中所述的含有共反应剂的PBS缓冲液，其中共反应剂在PBS缓冲液中的浓度为0.09～0.11mol/L，优选为0.1mol/L。所述的共反应剂可以是适合ZnSe量子点的现有常规共反应剂，如过氧化氢或过硫酸钾等，优选为过硫酸钾。在进行电化学发光检测的条件优选为：光电倍增管高压为800V、扫描电位为0～-2.0V，扫描速率为0.1V/s。
在上述制备聚合物分子印迹修饰电极的方法中，涉及的ZnSe量子点可参照现有文献进行合成(Mo G C,He X X,Zhou C Q,Ya D M,Feng J S,Yu C H,Deng B Y.Sensitivedetection of hydroquinone based on electrochemiluminescence energy transferbetween the exited ZnSequantum dots and benzoquinone[J].Sensors and ActuatorsB,2018,266:784-792.)，涉及的Fe-MIL-88-NH2金属有机骨架可参照现有文献或自行设计合成，优选按下述方法进行合成：
将聚乙烯吡咯烷酮(PVP)分散于由N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和乙醇组成的混合溶剂(DMF和乙醇的体积比为2～4：1～3)中(PVP与混合溶剂的用量比按0.2g：20～40mL计算)，得到混合液A；同时，将FeCl3·6H2O和2-氨基对苯二甲酸(2-NH2-BDC)(FeCl3·6H2O和2-NH2-BDC的质量比为1：1)分散于DMF(DMF的用量按每16.25mg FeCl3·6H2O和16.5mg 2-NH2-BDC共用5～10mL)计算中，得到混合液B；将混合液A和混合液B混合均匀得到混合液C(混合液A和混合液B的混合比例为控制所得混合液C中PVP、FeCl3·6H2O和2-NH2-BDC的质量比为0.2g：16.25mg：16.25mg)中，将混合液C超声(超声优选为30～40min)后转移到反应釜中于80～120℃(优选为100℃)条件下反应18～22h(优选为20h)，反应完成后，反应物冷却到室温，之后离心(离心时的转速为8000～10000rpm，时间为5～10min)，洗涤(通常用DMF洗涤)后干燥(通常在60～80℃下烘干)，即得到Fe-MIL-88-NH2(形貌呈八面体结构)。其中：FeCl3·6H2O中的Fe3+为中心离子，2-NH2-BDC为配体，DMF为溶剂，PVP为活化剂(或者说是塑型剂)。
在上述制备聚合物分子印迹修饰电极的方法中，所述多巴胺溶液的浓度为7.5～12.5mmol/L，优选为10mmol/L。鳞状细胞癌抗原是以分散于PBS缓冲液中的形式再置于多巴胺溶液中，所述鳞状细胞癌抗原在多巴胺溶液中的浓度为990～1010ng/mL，优选为1000ng/mL。在用循环伏安法扫描时，扫描电位范围为-0.5～0.5V，扫描圈数为30～50圈，优选扫描圈数为40圈。可以采用现在常规溶液将电极上的鳞状细胞癌抗原洗脱，如醋酸-十二烷基硫酸钠溶液(其中醋酸为溶剂，十二烷基硫酸钠为溶质，醋酸浓度为0.1mol/L，十二烷基硫酸钠的浓度为5wt％)，或者是盐酸-十二烷基硫酸钠溶液(其中盐酸为溶剂，十二烷基硫酸钠为溶质，盐酸浓度为0.1mol/L，十二烷基硫酸钠的浓度为0.5wt％)等。
在上述制备Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab/BSA复合物的方法中，所述EDC溶液的浓度为100～110mmol/L，优选为100mol/L。所述Fe-MIL-88-NH2@ZnSe复合物在EDC溶液中的浓度为1.15～1.25mg/mL，优选为1.2mg/mL。
与现有技术相比，本发明首次采用Fe-MIL-88-NH2金属有机骨架装载的ZnSe量子点再结合电沉积分子印迹技术以加速ZnSe与共反应剂的电子转移速率，有效提高ZnSe量子点的电化学发光强度，从而构建得到选择性好、灵敏度高的电化学发光传感器，将其用于电化学发光检测SCCA时，通过有效增强电化学发光强度而增大方法的线性范围并提高方法的检测灵敏度。
附图说明
图1为ZnSe量子点、金属有机骨架Fe-MIL-88-NH2和聚合物分子印迹修饰电极的电镜图及ZnSe量子点的粒径分布图，其中图1(a)为ZnSe量子点的透射电镜图，图1(b)为金属有机骨架Fe-MIL-88-NH2的扫描电镜图，图1(c)为聚合物分子印迹修饰电极的扫描电镜图，图1(d)为ZnSe量子点的粒径分布图。
图2为Fe-MIL-88-NH2@ZnSe复合物的扫描电镜图和能谱分析图，其中图2(a)为Fe-MIL-88-NH2@ZnSe复合物的扫描电镜图，其中图2(b)为Fe-MIL-88-NH2@ZnSe复合物的能谱分析图。
图3为多巴胺和SCCA电聚合的循环伏安曲线，其中a为第1圈的循环伏安曲线，b为第5圈的循环伏安曲线，c为第10圈的循环伏安曲线，d为第20圈的循环伏安曲线，e为第30圈的循环伏安曲线，f为第40圈的循环伏安曲线。
图4为不同修饰电极的循环伏安曲线，其中a为裸GCE的循环伏安曲线，b为聚合物分子印迹修饰电极的循环伏安曲线，c为聚合物分子印迹修饰电极洗脱模板分子SCCA的循环伏安曲线，d为聚合物分子印迹修饰电极重新连接上模板分子SCCA的循环伏安曲线。
图5为不同修饰电极的电化学阻抗谱，其中a为裸GCE的电化学阻抗谱，b为聚合物分子印迹修饰电极的电化学阻抗谱，c为聚合物分子印迹修饰电极洗脱模板分子SCCA的电化学阻抗谱，d为聚合物分子印迹修饰电极重新连接上模板分子SCCA的电化学阻抗谱。
图6为不同修饰电极的电化学发光强度-扫描时间曲线，其中a为裸GCE的电化学发光强度-扫描时间曲线即背景基线，b为MIP-SCCA@ZnSe/Ab/GCE(即仅负载量子点及SCCA同时经BSA封闭的玻碳电极)的电化学发光强度-扫描时间曲线，c为MIP-SCCA-Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab/ASB/GCE(即负载了Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab/BSA复合物及SCCA的电极)的玻碳电极的电化学发光强度-扫描时间曲线。
图7为多巴胺浓度与电化学发光传感器电化学发光强度的关系曲线。
图8为滴加鳞状细胞癌抗原溶液后的孵育时间与电化学发光传感器电化学发光强度的关系曲线。
图9为鳞状细胞癌抗原浓度与电化学发光传感器电化学发光强度的关系曲线，其中a为0.0001ng/mL,b为0.001ng/mL,c为0.01ng/mL,d为0.1ng/mL,e为1ng/mL,f为10ng/mL,g为100ng/mL。
图10为电化学发光强度与鳞状细胞癌抗原浓度对数的关系曲线。
图11为采用本发明构建的电化学发传感器用于检测1ng/mL SCCA(在含有0.1mol·L-1K2S2O8的PBS缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.4)溶液中)，400s内进行10次循环扫描的电化学发光强度。
图12为采用本发明构建的电化学发传感器在4℃下分别保存1周、2周、3周和4周后，继续用于检测1ng/mL SCCA(在含有0.1mol·L-1K2S2O8的PBS缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.4)溶液中)的电化学发光强度柱形图。
图13为采用本发明构建的电化学发传感器检测空白、牛血清白蛋白(BSA)，癌胚抗原(CEA)和CA15-3以及甲胎蛋白(AFP)的电化学发光强度柱形图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
1.实验方法
1.1试剂
硒粉(Aladdin试剂公司)；硼氢化钠(上海天莲精细化工有限公司)；3-巯基丙酸(MPA)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基碳化三亚胺)(EDC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、FeCl3·6H2O、2-氨基对苯二甲酸(2-NH2-BDC)、多巴胺(DA)(Aladdin试剂公司)、氯化锌、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙醇(广东汕头西陇化工股份有限公司)；十二烷基硫酸钠、牛血清白蛋白(BSA)(北京索莱宝科技有限公司)；醋酸(广东光华科技股份有限公司)；鳞状细胞癌抗原(SCCA)、mouse anti-SCCA antibody、甲胎蛋白(AFP)、CA15-3、癌胚抗原(CEA)(北京博奥森生物技术有限公司)。
1.2仪器
MPI-B型多参数化学分析检测***(西安瑞迈分析仪器有限公司)；CHI660电化学工作站(上海辰华)；电化学检测采用三电极***：工作电极为3mm玻碳电极；参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂丝电极；SK3310HP型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；Vario Micro Cube场发射环境扫描电子显微镜(德国Elementar公司)；SeikoSPA400扫描探针显微镜/原子力显微镜(日本精工)；Tecnai G2 F20 S-TWIN场发射透射电镜(美国FEI公司)。
1.3 ZnSe量子点的制备
取33.7mg Se和32.4mg NaBH4分散到10mL H2O中，在氮气保护下0℃反应1h。122.2mg ZnCl2和174μL MPA(3-巯基丙酸)分散到50mL H2O中，用1mol·L-1NaOH调节pH到11，用氮气除氧30min。将新制的无氧NaHSe溶液加入到除过氧的Zn-MPA溶液中，105℃下回流8h，得到ZnSe纳米粒子。产物用10000rpm离心分离，无水乙醇洗涤3次，纯化的50mg ZnSe分散到10mL水中放置在4℃冰箱中避光保存。
1.4 Fe-MIL-88-NH2@ZnSe的合成
取0.2g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入到18mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和11mL乙醇中，随后将1mL浓度为5mg/mL的ZnSe量子点乙醇溶液逐滴加入溶液中并不断地搅拌，得到混合液A。同时，将16.25mg FeCl3·6H2O和16.5mg 2-氨基对苯二甲酸(2-NH2-BDC)分散到6mLDMF中，得到混合液B，并将混合液B与混合液A混合均匀，得到混合液C。将混合液C超声30min，然后将其转移到50mL的反应釜中100℃下反应20h。冷却到室温后，将所得的悬浊液在10000rpm下离心5min，用DMF洗涤3次，70℃下烘干即可得到Fe-MIL-88-NH2@ZnSe复合物。为了考察Fe-MIL-88-NH2形貌，在上述制备过程中，不加ZnSe量子点，其他相同，合成得到Fe-MIL-88-NH2金属有机骨架(形貌呈八面体结构)。
1.5制备聚合物分子印迹修饰电极
首先，将玻碳电极在抛光布上依次用0.3、0.05μm Al2O3粉末抛光成镜面，用乙醇冲洗，用亚沸水冲洗，氮气吹干备用。然后取5mL含有1μg/mL SCCA PBS缓冲液(0.1mol/L，pH＝8)的10mmol/L多巴胺(DA)溶液用氮气除氧15min，之后将抛光的玻碳电极浸入上述溶液中，在-0.5到0.5V的电位范围内用循环伏安法扫描40圈以形成聚合物分子印迹膜，然后将电极用水洗涤，最后浸入醋酸-十二烷基硫酸钠溶液(其中醋酸为溶剂，十二烷基硫酸钠为溶质，醋酸是浓度为0.1mol/L的醋酸，十二烷基硫酸钠的浓度为5wt％)中浸泡12h,将模板上的SCCA洗脱，再用水洗涤，室温下晾干，可得到聚合物分子印迹修饰电极。
1.6制备Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab/ASB复合物
取适量的Fe-MIL-88-NH2@ZnSe复合物置于300μL浓度为100mmol/L的EDC中(控制Fe-MIL-88-NH2@ZnSe复合物在EDC中的浓度为1.2mg/mL)在25℃下孵育20min，然后将100μL鳞状细胞癌抗原相应的抗体(Ab)加入溶液中孵育2h，离心，收集下层沉淀物，即为Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab复合物，并将其加到1mL PBS缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.4)中。接着加入20μL5wt％BSA孵育1h封闭非特异性结合位点，然后离心，收集沉淀物并将其分散于1mL缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.4)中，并将其在4℃保存备用。
1.7电化学发光传感器(本申请中也称为电沉积分子印迹免疫传感器)的构建和检测
配制一系列不同浓度的SCCA溶液(0.0001ng/mL,0.001ng/mL,0.01ng/mL,0.1ng/mL,1ng/mL,10ng/mL,100ng/mL)。
取6μL一系列不同浓度的SCCA溶液滴到聚合物分子印迹膜修饰电极上孵育40min,用水洗涤除去未结合的SCCA，然后再滴6μL Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab溶液孵育2h，用水洗涤，晾干；之后将电极在含有0.1mol/L K2S2O8的0.1mol/L PBS缓冲溶液中进行电化学发光检测。光电倍增管高压为800V，扫描电位为0～-2.0V(vs.Ag/AgCl)，扫描速率为0.1V/s。
2.结果与讨论
2.1合成材料表征
图1为ZnSe量子点的透射电镜和金属有机骨架Fe-MIL-88-NH2、聚合物分子印迹修饰电极的扫描电镜图及ZnSe量子点的粒径分布图。如图1(a)所示，为ZnSe量子点的透射电镜图，ZnSe量子点呈现分散良好的圆球颗粒；图1(b)为金属有机骨架Fe-MIL-88-NH2的扫描电镜图，由图1(b)可知，金属有机骨架Fe-MIL-88-NH2呈现非常规则的四棱锥形貌；图1(c)为聚合物分子印迹修饰电极的扫描电镜图，由图1(c)可以看出模板分子均匀地分布在分子印迹膜上；图1(d)为ZnSe量子点的粒径分布图，粒径分布范围为1.7～2.6nm，平均粒径为2.0nm。
图2为Fe-MIL-88-NH2@ZnSe复合物的扫描电镜图和能谱分析图，其中图2(a)为Fe-MIL-88-NH2@ZnSe复合物的扫描电镜图，其中图2(b)为Fe-MIL-88-NH2@ZnSe复合物的能谱分析图。由图2(a)可知，四棱锥的表面附着许多小颗粒，说明ZnSe量子点成功装载到了Fe-MIL-88-NH2的表面；由图2(b)可知，Fe-MIL-88-NH2@ZnSe复合物含有C、N、O、Fe、Zn、Se等元素，说明Fe-MIL-88-NH2@ZnSe复合物成功合成。
循环伏安法是电化学活性物质在电极表面进行电化学聚合的常用方法。本实验利用循环伏安法制备聚多巴胺分子印迹膜。图3是在裸玻碳电极上电聚合10mmol/L DA和1μg/mL SCCA的循环伏安曲线。在第一个循环中(氧化峰电位为0.38V(Pa1))，表明多巴胺氧化成多巴胺醌，还原峰电位为0.08V(Pc1)和-0.29V(Pc2)是多巴胺醌和dopanechrome电对的电位。然而，随着循环圈数的增加，所有峰电流都减少，表明逐渐形成了聚多巴胺印迹膜，且该膜具有电化学惰性，阻碍了多巴胺在电极-溶液界面的电化学氧化。在电聚合过程中，SCCA与多巴胺的氨基通过氢键结合，当将SCCA模板洗脱后，在聚多巴胺印迹膜上形成印迹位点，可以识别SCCA。
图4为不同修饰电极的循环伏安曲线(检测条件：5mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6],0.1mol/L KCl，电位扫描范围：-0.2～0.6V，扫描速率为100mV/s)，其中a为裸玻碳电极的循环伏安曲线，此时Fe(CN)6 3-/4-出现了一对可逆的氧化还原峰，b为电沉积聚多巴胺分子的聚合物分子印迹修饰电极的循环伏安曲线，由于分子印迹膜和模板分子SCCA的导电性差，Fe(CN)6 3-/4-的氧化还原峰电流急剧降低。当模板分子SCCA被洗脱后，增强了Fe(CN)6 3-/4-在分子印迹膜空腔的扩散，Fe(CN)6 3-/4-的氧化还原峰电流增加(如曲线c所示)，然而，当目标分子SCCA重新连接到分子印迹膜上时，电子的转移动力学速率变慢，Fe(CN)6 3-/4-的氧化还原峰电流又降低(如曲线d所示)。
电化学阻抗是一种有效的检测方法，在聚合中用于检测修饰电极表面特征的变化。电化学阻抗谱(electrochemical impedance spectroscopy,EIS)由两部分组成，一部分是直线形的，另一部分是半圆形的。直线形部分是由扩散理论控制。半圆形的部分是由动力学控制，它的直径等于电子转移的电阻(Rct)，Rct值与样品的电化学活性成反比。阻抗图中半圆面积越小，表明该修饰电极对电子转移的阻碍作用越小，电极的导电性能越好。不同修饰电极在含有5.0mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]和0.1mol/L KCl溶液电化学阻抗谱如图5所示(检测条件：5mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6],0.1mol/L KCl，阻抗频率为0.01Hz～105Hz，振幅为5mV)，曲线a是裸玻碳电极的阻抗谱，该曲线在高频区有一个小半圆，说明裸电极的电子转移的电阻(Rct)小，曲线b是电沉积聚多巴胺分子的聚合物分子印迹修饰电极的阻抗谱，电子转移的电阻(Rct)急剧增大，这是由于聚多巴胺分子印迹膜成功修饰到电极表面，分子印迹膜和模板分子SCCA的电化学活性差，增大了电子在电极表面转移电阻。曲线c是模板分子SCCA被洗脱后的阻抗谱，电子转移的电阻(Rct)显著减少，这是由于当模板分子被洗脱后，对电子转移的阻碍作用减弱。当目标分子SCCA重新连接到分子印迹膜上，其电子转移的电阻(Rct)又增大(曲线d)，说明目标分子成功连接到电沉积聚多巴胺分子印迹膜上。
2.2不同修饰电极的电化学发光行为
聚合物分子印迹电极在1ng/mL SCCA中孵育40min形成MIP-SCCA-Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab/GCE和MIP-SCCA-ZnSe/Ab/GCE，在含0.1mol/L K2S2O8的PBS缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.4)的电解质溶液中检测其电化学发光，结果如图6所示(检测条件：0.1mol/L K2S2O8,PBS缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.4)，电位扫描范围：0～-2.0V，扫描速率为100mV/s，SCCA浓度为1ng/mL)。MIP-SCCA-Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab/GCE(曲线c)的电化学发光强度是MIP-SCCA-ZnSe/Ab/GCE(曲线b)的8倍，这是由于金属有机骨架Fe-MIL-88-NH2表面积大可以装载较多的ZnSe量子点，而且在Fe-MIL-88-NH2中含有有机配体2-氨基对苯二甲酸(2-NH2-BDC)作为一种新颖的共反应催化剂促进S2O8 2-转化为SO4 ·-从而增强量子点和S2O8 2-体系的电化学发光。
2.3条件优化
本实验主要对多巴胺浓度进行了优化，如图7所示(检测条件：0.1mol/L K2S2O8,PBS缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.4)，电位扫描范围：0～-2.0V，扫描速率为100mV/s，SCCA浓度为1ng/mL)。随着多巴胺浓度从2.5mmol/L增加到10mmol/L，聚多巴胺分子印迹膜上连接的SCCA随之增加，电化学发光强度增强。当多巴胺浓度大于10mmol/L时，电化学发光强度逐渐减弱，这是由于多巴胺浓度较大时，形成的电沉积分子印迹膜较厚，阻碍电子转移，导致电化学发光强度减弱。因此，本实验选择多巴胺浓度为10mmol/L。
分子印迹免疫传感器电化学发光强度也受电沉积分子印迹膜重新连接SCCA的孵育时间的影响，结果如图8所示(检测条件：0.1mol/L K2S2O8,PBS缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.4)，电位扫描范围：0～-2.0V，扫描速率为100mV/s，SCCA浓度为1ng/mL)。随着孵育时间的增加，电化学发光强度增强，当孵育时间为40min时，电化学发光强度达到最大，孵育时间延长，电化学发光强度不再增加，这说明电沉积分子印迹膜表面固定的SCCA已经饱和，因此，实验选择最佳的孵育时间为40min。
2.4分析性能
在最优的实验条件下，所制备的电化学发光传感器用于检测鳞状细胞癌抗原(SCCA)，结果如图9所示(检测条件：0.1mol/L K2S2O8,PBS缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.4)，电位扫描范围：0～-2.0V，扫描速率为100mV/s)。随着鳞状细胞癌抗原浓度的增大，传感器的电化学发光强度逐渐增大，在0.0001ng/mL至100ng/mL浓度范围内，电化学发光强度与鳞状细胞癌抗原浓度的对数成线性关系。由图10可知(检测条件：0.1mol/L K2S2O8,PBS缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.4)，电位扫描范围：0～-2.0V，扫描速率为100mV/s)，线性方程为IECL＝1866.6logC+8545.2，相关系数为0.9963。根据3σ(其中σ是空白的标准偏差，n＝11)进行计算，得到鳞状细胞癌抗原的检出限为31fg/mL。由上述制备的电化学发光传感器具有更宽的线性范围和更低的检出限，具体如下述表1所示。
表1：不同方法检测SCCA性能的比较
Figure BDA0002218448870000091
Figure BDA0002218448870000101
2.5电化学发光传感器的重现性
将前述制备的电化学发光传感器用于检测1ng/mL SCCA(在含有0.1mol·L-1K2S2O8的PBS缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.4)溶液中)，400s内进行10次循环扫描(检测条件：0.1mol/LK2S2O8,PBS缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.4)，电位扫描范围：0～-2.0V，扫描速率为100mV/s，SCCA浓度为1ng/mL)，电化学发光信号无明显下降(如图11所示)，相对标准偏差为2.4％，结果显示本发明所制备的电化学发光传感器具有良好的重现性。将所制备的电化学发光传感器在4℃下保存1周、2周、3周和4周，再次进行循环扫描(检测条件：0.1mol/L K2S2O8,PBS缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.4)，电位扫描范围：0～-2.0V，扫描速率为100mV/s，SCCA浓度为1ng/mL)，电化学发光信号为原始的93％(如图12所示)，表明本发明构建的电化学发光传感器具有良好的稳定性。
2.6电化学发光传感器的选择性
为了考察电化学发光传感器的选择性，申请人用所制备的电化学发光传感器检测了10ng/mL牛血清白蛋白(BSA)，癌胚抗原(CEA)和CA15-3以及甲胎蛋白(AFP)，结果如图13所示(检测条件：0.1mol/L K2S2O8,PBS缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.4)，电位扫描范围：0～-2.0V，扫描速率为100mV/s，SCCA浓度为1ng/mL)。由图13可知，除了SCCA，其他蛋白的电化学发光响应值与空白值相近，说明该电化学发光传感器具有良好的选择性。
实验例1：本发明所述方法用于实际标本样品的分析为了考察本发明构建的电化学发光传感器能否用于复杂样品分析，本申请人用该传感器对人血清样品进行分析。人血清样品来自桂林市第五人民医院，取回后不经过任何预处理直接按照前述免疫分析方法进行分析，结果如表2所示，分析测得其加标回收率为96.08％～105.1％，RSD小于7％，说明本发明构建的电化学发光传感器适用于复杂生物样品分析。
表2：人血清样品中SCCA的测定结果和回收率(n＝3)
Figure BDA0002218448870000111

Claims (9)

1.一种增强鳞状细胞癌抗原在电化学发光检测时的发光强度的方法，主要包括电化学发光传感器的构建步骤，其特征在于：
所述电化学发光传感器的构建步骤，包括：配制一定浓度的鳞状细胞癌抗原溶液，并将该鳞状细胞癌抗原溶液滴加到聚合物分子印迹修饰电极上孵育，孵育完成后水洗，然后再在电极上滴加Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab/BSA复合物并孵育，孵育完成后水洗，晾干，晾干后的电极即为电化学发光传感器；
使用上述制得的电化学发光传感器置于含有共反应剂的PBS缓冲液中进行电化学发光检测，即可有效增强鳞状细胞癌抗原在电化学发光检测时的发光强度；其中，
所述的聚合物分子印迹修饰电极按下述方法进行制备：将工作电极置于含有鳞状细胞癌抗原的多巴胺溶液中，用循环伏安法扫描以在工作电极上使聚合物分子印迹形成膜，取出，水洗，然后再将电极上的鳞状细胞癌抗原洗脱，再水洗，晾干，得到聚合物分子印迹修饰电极；
所述的Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab/BSA复合物按下述方法进行制备：先获得在Fe-MIL-88-NH2金属有机骨架负载ZnSe量子点的Fe-MIL-88-NH2@ZnSe复合物，然后将其置于EDC溶液中孵育，之后向其中加入鳞状细胞癌抗原相应的抗体并孵育，孵育完成后离心，收集沉淀，即为Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab复合物，再用牛血清白蛋白封闭Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab复合物的非特异性结合位点，即得到Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab/BSA复合物，所得Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab/BSA复合物保存于PBS缓冲液中，备用；
上述方法中涉及的PBS缓冲液为浓度为0.1～0.12mol/L、pH＝7.3～7.5的PBS缓冲液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在电化学发光传感器的构建步骤中，配制浓度为1ng/mL的鳞状细胞癌抗原溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在电化学发光传感器的构建步骤中，所述鳞状细胞癌抗原溶液滴加到聚合物分子印迹修饰电极上孵育的时间为40～60min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在电化学发光传感器的构建步骤中，在电极上滴加Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab/BSA复合物后孵育的时间为50～90min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有共反应剂的PBS缓冲液中，共反应剂在PBS缓冲液中的浓度为0.09～0.11mol/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：进行电化学发光检测的条件为：光电倍增管高压为800V、扫描电位为0～-2.0V，扫描速率为0.1V/s。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于：在制备聚合物分子印迹修饰电极的方法中，所述多巴胺溶液的浓度为7.5～12.5mol/L，鳞状细胞癌抗原在多巴胺溶液中的浓度为990～1010ng/mL。
8.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于：在制备聚合物分子印迹修饰电极的方法中，在用循环伏安法扫描时，扫描电位范围为-0.5～0.5V，扫描圈数为30～50圈。
9.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于：在制备Fe-MIL-88-NH2@ZnSe/Ab/BSA复合物的方法中，所述EDC溶液的浓度为100～110mmol/L，所述Fe-MIL-88-NH2@ZnSe复合物在EDC溶液中的浓度为1.15～1.25mg/mL。
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