CN111122267A - 一种植物组织半薄切片的制作方法 - Google Patents

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金文杰
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Abstract

本发明公开了一种植物组织半薄切片的制作方法。所述植物组织半薄切片的制作方法包括如下步骤：选取植物组织依次经固定、脱水、预渗透、渗透、包埋、切片、烤片、脱树脂和染色；采用钢刀片进行所述切片；依次采用番红和固绿进行所述染色。本发明利用石蜡切片中常用的钢刀片为切片刀具，扩大了树脂切片的使用范围。本发明染色使用番红‑固绿复染的方法，与甲苯胺蓝染液相比，番红价格低于甲苯胺蓝的价格，储存要求也不高，在室温下即可保存，配置过程简便易行，不易产生沉淀，不同的组织结构呈现不同的颜色，可以更加明显的体现出组织的不同结构和成分，提高了切片的质量和图像效果。

Description

一种植物组织半薄切片的制作方法
技术领域
本发明涉及一种植物组织半薄切片的制作方法，属于生物技术领域。
背景技术
树脂半薄切片是一种应用非常广泛的形态学研究技术，常用于透射电镜样品制备中的超薄切片组织定位。与石蜡切片相比，树脂半薄切片的制作程序和步骤有所简化，周期较短，且切片的厚度更薄，一般厚度仅为2～7μm，因此，半薄切片图像的清晰度及分辨率优于石蜡切片，且视野大于超薄切片，有利于获得高质量的光镜图像。从取材到染色涉及到多个步骤，任何环节出现问题都会影响到样片制备质量甚至导致样品制备失败。一种好的染色方法即可将树脂半薄切片技术的优势和特点更加完美的体现出来。甲苯胺蓝是常用的一种人工合成染料，植物半薄切片制备过程中常用的染色剂属于醌亚胺染料类，其中的阳离子有染色作用，组织细胞的酸性物质与其中的阳离子结合而被染色，故其染色为单一染色，缺乏层次，没有对比度，同时甲苯胺蓝染色剂溶液易沉淀变性，以上这些会影响半薄切片的质量和图像效果。因此，针对现有技术中甲苯胺蓝染色和玻璃刀价格昂贵等缺点，需要提供一种新的植物组织半薄切片的制作方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物组织半薄切片的制作方法，本发明方法采用常用钢刀切取半薄切片，并采用番红-固绿复染，能够以满足不同的组织切片和染色要求，获得高质量的半薄切片和图像效果。
本发明所提供的植物组织半薄切片的制作方法，包括如下步骤：
选取植物组织依次经固定、脱水、预渗透、渗透、包埋、切片、烤片、脱树脂和染色；
采用钢刀片进行所述切片；
依次采用番红和固绿进行所述染色。
上述的制作方法中，所述固定步骤可采用常规方法，如在2.5％戊二醛固定液中24h以上，抽真空，使组织和细胞充分固定；然后采用0.1M PBS缓冲液漂洗固定后的组织(如叶片)3遍，每次20min；再用蒸馏水漂洗2遍，每次20min，充分洗去固定液。
上述的制作方法中，所述脱水的步骤如下：采用50～100％的乙醇水溶液进行逐级脱水，且采用50～95％的乙醇水溶液进行脱水一次，每个梯度放置1h；采用100％乙醇水溶液进行脱水两次，每次放置1h；
如依次采用50％、70％、80％、90％、95％和100％的乙醇水溶液逐级脱水，具体可采用50％的乙醇水溶液脱水1h，70％的乙醇水溶液脱水1h，80％的乙醇水溶液脱水1h，90％的乙醇水溶液脱水1h，95％的乙醇水溶液脱水1h，100％的乙醇水溶液脱水两次，每次1h，为防止在纯乙醇中过度脱水，因此在纯乙醇中不得放置超过2h。
上述的制作方法中，所述预渗透采用的预渗透液由体积比为1：1的Technovit和乙醇组成；
所述渗透液由Technovit和HardenderⅠ组成，两者的配比为100mLTechnovit：1gHardenderⅠ；
所述预渗透的时间为2.5～4h，所述渗透的时间为20～24h。
上述的制作方法中，所述切片得到的切片的厚度为3～7μm；切片过程中，全程配带橡胶或丁腈手套，防止手上的汗液将包埋块软化，这样在切片过程中容易形成粉末。切片过程中如果出现卷曲，是由于包埋块尖头过大造成的，故其尖头越小越好。切片过程中切一片，用尖头镊子夹取切片边缘置于滴有蒸馏水的载玻片上，并用牙签缓缓的将其拉平。
上述的制作方法中，所述烤片可在常规条件下进行；由于切片过薄，用牙签将切片慢慢置于滴有水滴的载玻片上，在显微镜下初步观察其组织结构完整后置于60℃的电热板上进行烤片。
上述的制作方法中，所述脱树脂可在常规条件下进行；将观察好可用的切片置于装有无水乙醇的染色缸中静置5min，进行切片脱树脂处理。
上述的制作方法中，采用所述番红进行静置染色的时间为12～16h；
所述番红染色后还包括采用水进行清洗脱色3～5次的步骤；
采用所述固绿进行静置染色的时间为40～60min；
所述番红染色后还包括采用水进行清洗脱色4～6次的步骤；
本发明方法适用的植物组织可为叶片、根或茎秆。
所述植物优选为高粱。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明利用石蜡切片中常用的钢刀片为切片刀具，扩大了树脂切片的使用范围。
(2)染色使用番红-固绿复染的方法，与甲苯胺蓝染液相比，番红价格低于甲苯胺蓝的价格，储存要求也不高，在室温下即可保存，配置过程简便易行，不易产生沉淀，不同的组织结构呈现不同的颜色，可以更加明显的体现出组织的不同结构和成分，提高了切片的质量和图像效果。
(3)应用本发明的方法，不仅可以应用于高粱的叶片组织，可被进一步应用于其他植物的叶片、根和茎秆组织，在植物组织切片的应用观察中发挥着重要的作用。
附图说明
图1为本发明对高粱叶片番红固绿复染半薄切片流程。
图2为高粱叶片半薄切片(×20)的显微镜照片。
图3为高粱幼根半薄切片(×20)的显微镜照片。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如图1所示，为本发明对高粱叶片番红固绿复染半薄切片的流程图：
(1)取材：可选取不同生长阶段除去叶脉部分，大小为0.6cm×0.6cm的叶片；
(2)固定：将所取的叶片固定在2.5％戊二醛固定液中24h以上，抽真空，使组织和细胞充分固定；
(3)漂洗：用0.1M PBS缓冲液漂洗固定后的叶片3遍，每次20min；再用蒸馏水漂洗2遍，每次20min，充分洗去固定液；
(4)脱水：用50％、70％、80％、90％、95％、100％的乙醇逐级脱水，50％的乙醇1h，70％的酒精1h，80％的酒精1h，90％的酒精1h，95％的酒精1h，100％的酒精脱水两次，每次1h，为防止在纯乙醇中过度脱水，因此在纯乙醇中不得放置超过2h。
(5)预渗透液和渗透液的配置：预渗透液组成为1/2Technovit+1/2 100％乙醇；渗透液由100mL Technovit+1g HardenderⅠ组成，配好后可在4℃放置4周。如果制样硬度不够，在渗透液配置过程中可增加HardenderⅠ的用量。
(6)预渗透：脱水后的叶片置于预渗透液中室温静置3小时。
(7)渗透：将预渗透的材料转入渗透液中，渗透24小时。
(8)包埋液的配置：包埋液由1.5mL+0.1mL HardenderⅡ组成，必须现配现用。如果制样硬度不够，在渗透液配置过程中可适量增加HardenderⅡ的用量。
(9)包埋：将新鲜配置的包埋液加入到21孔的包埋板中，每孔加入300μL；用尖头镊子将渗透好的叶片组织放入样品孔中，用牙签调整样品的方向和位置，立即转入烘箱中，温度为45℃，固化5天以上。
(10)修块：将固化好的包埋块用2000目的砂纸进行修块，露出组织后，在体式显微镜下观察，并将其侧面修整为锥形。
(11)半薄切片：将修整好的包埋块用LEICA RM2265切片机进行半薄切片，切片刀选择钢刀片，切片厚度为4μm。操作过程中一定要全程配带丁腈手套，防止手上的汗液将包埋块软化，这样在切片过程中容易形成粉末。切片过程中如果出现卷曲，是由于包埋块尖头过大造成的，故其尖头越小越好。
(12)烤片：由于切片过薄，用牙签将切片慢慢置于滴有水滴的载玻片上，在显微镜下初步观察其组织结构完整后置于60℃的电热板上进行烤片。
(13)脱树脂：将观察好可用的切片置于装有无水乙醇的染色缸中静置5min，进行切片脱树脂处理。
(14)染色：将脱树脂后的切片转移至装有番红的染色缸中静置染色，染色时间为15.5h，染色后将切片置于超纯水的染色缸中清洗脱色3遍，每次1.5min；将番红染色清洗后的切片置于装有固绿的染色缸中静置染色，染色时间为50min，染色后将固绿染色的切片置于超纯水的染色缸中清洗脱色5遍，每次2.0min。染色后的切片即可在显微镜下观察。
按照上述方法得到高粱叶片半薄切片(×20)和高粱幼根半薄切片(×20)的显微镜照片，分别如图1和图2所示，可以看出，高粱叶片和根部组织结构清晰。

Claims (8)

1.一种植物组织半薄切片的制作方法，包括如下步骤：
选取植物组织依次经固定、脱水、预渗透、渗透、包埋、切片、烤片、脱树脂和染色；
采用钢刀片进行所述切片；
依次采用番红和固绿进行所述染色。
2.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于：所述切片得到的切片的厚度为3～7μm。
3.根据权利要求1或2所述的制作方法，其特征在于：采用所述番红进行染色的时间为12～16h；
所述番红染色后还包括采用水进行清洗脱色3～5次的步骤。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制作方法，其特征在于：采用所述固绿进行染色的时间为40～60min；
所述番红染色后还包括采用水进行清洗脱色4～6次的步骤。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制作方法，其特征在于：所述脱水的步骤如下：采用50～100％的乙醇水溶液进行逐级脱水，且采用50～95％的乙醇水溶液进行脱水一次，每个梯度放置1h；采用100％乙醇水溶液进行脱水两次，每次放置1h。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制作方法，其特征在于：所述预渗透采用的预渗透液由体积比为1：1的Technovit和乙醇组成；
所述渗透液由Technovit和HardenderⅠ组成，两者的配比为100mLTechnovit：1gHardenderⅠ；
所述预渗透的时间为2.5～4h，所述渗透的时间为20～24h。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的制作方法，其特征在于：所述植物组织为叶片、根或茎秆。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的制作方法，其特征在于：所述植物为高粱。
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