CN111110921A - 一种组织工程后板层角膜的体外构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种组织工程后板层角膜的体外构建方法，包括角膜种子细胞的人角膜基质细胞和人角膜内皮细胞，与带有后弹力层的脱细胞猪角膜基质作为组织工程角膜载体支架，其特征是首先在上述支架中接种角膜基质种子细胞构建出组织工程后板层角膜的基质层部分，再在其后弹力层上接种角膜内皮种子细胞，即构建出组织结构和功能与正常后板层角膜相近的组织工程后板层角膜。本发明攻克了人角膜内皮细胞在体外无法增殖的国际难题，角膜内皮细胞形成密度极高、连接紧密的单层内皮结构高达3400‑3600个细胞/mm2；接种角膜基质细胞采用注射接种法，既大大缩短了体外培养时间，又能保持载体支架结构的完整性。因此可满足高质量需求和低成本实现批量生产而得以推广应用。

Description

一种组织工程后板层角膜的体外构建方法
技术领域
本发明属于再生医学组织工程领域的构建技术，具体涉及一种组织工程后板层角膜的体外构建方法。
背景技术
角膜位于眼球最前端，是人体唯一的免疫赦免区，无血管而呈现透明状，为眼睛提供大部分屈光力。角膜的组织结构由外到内依次为角膜上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层。其中角膜内皮层由单层、扁平、连接紧密的六角形内皮样细胞镶嵌而成，对维持角膜的透明度及正常厚度起着关键作用，并具有角膜-房水屏障功能。角膜中没有血管，只能经内皮层从房水中获取养分/氧气或透过泪液为上皮部分供养/氧。人角膜内皮细胞在成年后丧失了***能力，且以每年0.3%~0.6%的比例死亡。局部细胞损伤后只能依靠邻近细胞的增大、扩展和移行来填补缺损区，以维持角膜内皮层的单层形态和功能。因此，在体外持续扩增培养人角膜内皮细胞是非常困难的，目前还属于国际难题。此外，白内障等手术损伤、长期高眼压（青光眼）、成形玻璃体持续接触角膜内皮、持续重度虹膜炎和严重虹膜前粘连等均可引起大量角膜内皮细胞的损伤与快速死亡，一旦角膜内皮细胞密度低于维持内皮生理功能的临界密度(600~800个/mm2)，角膜将出现不可逆病变，最终将引起角膜内皮失代偿；角膜基质层由200~250层规则排列的胶原板层和散在分布于其中的角膜基质细胞组成，在维持角膜厚度和透明度方面作用重大。在角膜受到深度创伤和感染时，往往会伤及深层角膜基质层和内皮层，即后板层角膜，轻者引起角膜水肿和角膜内皮失代偿，重者甚至致盲。就目前后板层角膜损伤的治疗方法主要是通过角膜基质层和内皮层分别进行多次的角膜移植手术，不仅增加了手术创伤和感染的风险，而且在角膜愈合以及移植区瘢痕残留方面尚存在诸多问题。因此，体外构建可用于移植的组织工程后板层角膜，以彻底解决供体角膜材料严重匮乏的现状，为治疗该类疾病开辟新的途径或材料构件是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种组织工程后板层角膜的构建方法，即在体外构建组织工程后板层角膜，以弥补现有技术和材料的不足。
本发明是基于我实验室已成功建立的非转染人角膜基质细胞系和人角膜内皮细胞系，并从中筛选出核型正常且结构功能正常的人角膜基质细胞和人角膜内皮细胞，且成功解决了组织工程后板层角膜规模化构建所需足量正常种子细胞的来源问题。以及2014年樊廷俊等利用动物角膜成功制备出了透明性好、结构致密、机械性强、与角膜种子细胞生物相容性好、易于角膜种子细胞贴附和生长、适于批量生产的组织工程角膜载体支架（ZL201410459064.8）。就此尽早建立一种利用以角膜基质细胞和角膜内皮细胞作为种子细胞与上述载体支架进一步在体外构建组织工程后板层角膜，并且实现组织工程后板层角膜规模化生产及临床应用，是造福全世界角膜内皮层和基质层异常患者的关键。因此本发明是在已有技术的基础上，先后利用人角膜基质细胞和人角膜内皮细胞，或由角膜缘干细胞诱导分化而来的角膜基质样细胞和角膜内皮样细胞，并接种于载体支架，实现体外构建出组织工程后板层角膜。
本发明的方法：包括已有的作为角膜种子细胞的人角膜基质细胞和人角膜内皮细胞，以及带有后弹力层的脱细胞猪角膜基质作为组织工程角膜载体支架，其特征是首先在上述载体支架中接种角膜基质种子细胞构建出组织工程后板层角膜的基质层部分，再在上述构建的基质层部分的后弹力层上接种角膜内皮种子细胞，即构建出组织结构和功能与正常后板层角膜相近的组织工程后板层角膜。
上述角膜基质种子细胞和角膜内皮种子细胞可以由角膜缘干细胞诱导分化而来的角膜基质样细胞和角膜内皮样细胞替代。
其中上述基质层部分的构建是首先用载体支架复水溶液对组织工程角膜载体支架进行复水，然后用构建专用培养液A将人角膜基质细胞制成角膜基质细胞悬液，再将该细胞悬液注射入经载体支架复水溶液复水后的载体支架中，再加入构建专用培养液A后进行体外培养，然后更换构建专用培养液B继续培养，得到组织工程后板层角膜的基质层部分；再用构建专用培养液C将人角膜内皮细胞制成角膜内皮细胞悬液后，将该细胞悬液接种于上述组织工程后板层角膜的基质层部分的后弹力层上进行体外培养，再将构建专用培养液C更换为构建专用培养液D进行培养，然后更换新的上述构建专用培养液D继续培养，即得组织结构和功能与正常后板层角膜相近的组织工程后板层角膜。
上述角膜基质细胞悬液的制备方法：先取人角膜基质细胞或由角膜缘干细胞诱导分化而来的角膜基质样细胞，用含15%-20%小牛血清的DMEM/F12培养液培养至长满单层，再用0.25%胰蛋白酶溶液进行消化、离心收集细胞沉淀，最后再用构建专用培养液A重悬细胞沉淀，即得均质的角膜基质细胞悬液。
上述角膜基质细胞悬液的细胞浓度范围是2×105-6×105个细胞/mL。
上述角膜基质层部分的体外构建的具体步骤方法：用微量注射器吸取上述角膜基质细胞悬液，将细胞悬液沿角膜基质板层方向平行且均匀地注射6-9针，每针1-2μL，然后加入1mL构建专用培养液A，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中进行培养，然后每隔12-24小时更换构建专用培养液B一次，持续培养48-96小时后，即得角膜基质层部分。
上述角膜内皮细胞悬液的制备方法：先取人角膜内皮细胞或由角膜缘干细胞诱导分化而来的角膜内皮样细胞，用含15%-20%小牛血清的DMEM/F12培养液培养至长满单层，再用0.25%胰蛋白酶溶液进行消化、离心收集细胞沉淀，最后再用构建专用培养液C重悬细胞沉淀，即得均质的角膜内皮细胞悬液。
上述角膜内皮细胞悬液的细胞浓度范围是3×105-5×105个细胞/mL。
上述角膜内皮细胞的接种和培养方法：将上述角膜基质层部分的后弹力层面朝上平铺于已置入48孔培养板中，在该后弹力层上接种悬浮于构建专用培养液C中的1mL角膜内皮细胞悬液，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中12小时后，吸出48孔板中的构建专用培养液C，然后在上述48孔培养板中加入1mL构建专用培养液D，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中进行体外培养，然后每隔12-24小时更换构建专用培养液D一次，持续培养72-120小时后，即得组织工程后板层角膜。
上述载体支架复水溶液是含有10mg/mL妥布霉素的DMEM/F12培养液。
上述构建专用培养液A的配方：含有15%胎牛血清、0.2-0.4mg/mL纤连蛋白和0.01-0.02mg/mL碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养液。
上述构建专用培养液B的配方：含有15%小牛血清、0.3-0.5mg/mL凝血酸、0.1-0.5mg/mL ε-氨基己酸、1-5mg/mL抗坏血酸和1-5μg/mL基质金属蛋白酶抑制剂BB-94的DMEM/F12培养液。
上述构建专用培养液C的配方：含有10%胎牛血清、0.2-0.4mg/mL纤连蛋白、0.01-0.02mg/mL碱性成纤维细胞生长因子和0.01-0.02mg/mL表皮细胞生长因子的DMEM/F12培养液。
上述构建专用培养液D的配方：含有20%小牛血清、0.2-0.4mg/mL氨基葡萄糖盐酸盐、0.1-0.5mg/mL ε-氨基己酸、30-50ng/mL人骨形态发生蛋白7、1-5mg/mL抗坏血酸和1-5μg/mL基质金属蛋白酶抑制剂BB-94的DMEM/F12培养液。
本发明中的种子细胞来自非转染的人角膜基质细胞、人角膜内皮细胞，或者由角膜缘干细胞诱导分化而来的角膜基质样细胞和角膜内皮样细胞，在技术上应保证该细胞生长状态良好、无任何致瘤性风险，能通过连续传代为组织工程后板层角膜的规模化体外构建提供出足量正常的种子细胞；又利用发明人已授权专利中的制备方法获得载体支架，该载体支架未使用任何有毒的化学试剂和药品，安全性高、抗原性小，复水后的载体支架具有透明性好、结构致密完整、机械性强、与角膜种子细胞生物相容性好、易于种子细胞附着、迁移和生长、生产成本低等特点，可满足组织工程后板层角膜批量构建所需要的足量载体支架材料。
本发明采用构建专用培养液能够最大程度地模拟人角膜内皮细胞所处的生理环境，因此攻克了人角膜内皮细胞在体外无法增殖的国际难题；接种角膜基质细胞采用注射接种法，不仅大大缩短了体外培养的时间，而且较直接接种法能够更好的保持载体支架结构的完整性。最终构建出的组织工程后板层角膜中，角膜基质细胞在载体支架中的分布相当均匀，角膜内皮细胞形成密度极高、连接紧密的单层内皮结构（高达3400-3600个细胞/mm2，相当于0-3岁儿童）。因此可满足对组织工程后板层角膜的高质量需求和低成本，从而实现批量生产而得以推广应用。
显然本发明的构建工艺科学合理，所构建出的组织工程后板层角膜在形态结构和透明度上与正常的人后板层角膜相似，并具有正常后板层角膜的生物学功能，对新西兰兔和家猫进行角膜后板层移植发现，分别能够保持移植眼角膜2个月以上的透明，表明本发明所构建出的组织工程后板层角膜可完全作为捐献角膜的替代物用于角膜内皮层和深层基质层异常的修复。
具体实施方式
一种组织工程后板层角膜的体外构建方法，包括作为角膜种子细胞的人角膜基质细胞和人角膜内皮细胞，以及带有后弹力层的脱细胞猪角膜基质作为组织工程角膜载体支架，其特征是首先在上述载体支架中接种角膜基质种子细胞构建出组织工程后板层角膜的基质层部分，再在上述构建的基质层部分的后弹力层上接种角膜内皮种子细胞，构建出组织结构和功能与正常后板层角膜相近的组织工程后板层角膜。
上述角膜基质种子细胞和角膜内皮种子细胞可以由角膜缘干细胞诱导分化而来的角膜基质样细胞和角膜内皮样细胞替代。即由角膜缘干细胞诱导分化而来的角膜基质样细胞和角膜内皮样细胞可以作为上述角膜基质种子细胞和角膜内皮种子细胞。因为两者都是具有角膜种子细胞的特性，因此基本上可以利用同样的方法和培养液。
由于上述组织工程后板层角膜包括角膜基质层部分和角膜内皮层部分，即可利用人角膜基质细胞和人角膜内皮细胞，或由角膜缘干细胞诱导分化而来的角膜基质样细胞和角膜内皮样细胞作为种子细胞，先后接种于保留有后弹力层的载体支架上，具是可以体外构建成功优质的组织工程后板层角膜。
本发明涉及的各种溶液的配制方法：
1、载体支架复水溶液的配制：取常规配制的DMEM/F12培养液80mL，加入1g妥布霉素，完全溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，补加上述的DMEM/F12培养液至100mL，即为载体支架复水溶液。
2、构建专用培养液A的配制：取常规配制的无菌DMEM/F12培养液85mL，加入15mL胎牛血清，即为构建专用培养液A；
本发明为了提高人角膜基质细胞在载体支架中的附着效果，又将上述构建专用培养液A的配方上添加了20-40mg纤连蛋白；又，为了保持人角膜基质细胞的活性，将上述构建专用培养液A的配方上添加了1-2mg碱性成纤维细胞生长因子；
3、构建专用培养液B的配制：取常规配制的DMEM/F12培养液80mL，加入30-50mg凝血酸，完全溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，并加入15mL小牛血清，补加上述DMEM/F12培养液至100mL，即为构建专用培养液B；
本发明为了提高人角膜基质细胞在载体支架中的附着和迁移效果，又将上述构建专用培养液B的配方上添加了10-50mg ε-氨基己酸；为了促进人角膜基质细胞分泌更多的细胞外基质成分，又将上述构建专用培养液B的配方上添加了0.1-0.5g抗坏血酸；为了抑制载体支架的轻度降解，又将上述构建专用培养液B的配方上添加了0.1-0.5mg基质金属蛋白酶抑制剂BB-94 。
4、构建专用培养液C的配制：取常规配制的DMEM/F12培养液80mL，加入20-40mg纤连蛋白，完全溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，加入10mL胎牛血清，补加上述DMEM/F12培养液至100mL，即为构建专用培养液C。
本发明为了保持人角膜基质细胞和人角膜内皮细胞的活性，又将上述构建专用培养液C的配方上添加了1-2mg碱性成纤维细胞生长因子和1-2mg表皮生长因子；
5、构建专用培养液D的配制：取常规配制的DMEM/F12培养液80mL，加入10-50mg ε-氨基己酸、0.1-0.5g抗坏血酸和0.1-0.5mg基质金属蛋白酶抑制剂BB-94，完全溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，加入20mL小牛血清，补加上述的DMEM/F12培养液至100mL，即为构建专用培养液D。
为了使贴附在后弹力层的人角膜内皮细胞保持理想的生长状态，又将上述构建专用培养液D的配方中添加了20-40mg氨基葡萄糖盐酸盐；为了抑制体外培养的人角膜内皮细胞发生间充质转化，又将上述构建专用培养液D的配方中添加了3-5μg人骨形态发生蛋白7。
本发明的具体实施步骤：
1、载体支架的制备：用载体支架复水溶液对载体支架浸泡1-2小时进行复水处理；
2、角膜基质种子细胞的制备方法：取人角膜基质细胞或由角膜缘干细胞诱导分化而来的角膜基质样细胞，用含15%-20%小牛血清的DMEM/F12培养液在37℃进行扩增培养，待细胞长满单层后，吸出培养液，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化1-2分钟，加入此前吸出的旧培养液终止消化，1000-1500转/分离心10-15分钟，细胞沉淀用4mL构建专用培养液A悬浮均匀制成均质的角膜基质细胞悬液；经细胞计数后，用上述构建专用培养液A调整细胞浓度至2×105-6×105个细胞/mL；
3、角膜基质层部分的体外构建：用微量注射器吸取上述角膜基质细胞悬液，在每个载体支架上均匀注射6-9针，每针1-2μL；将注射细胞悬液后的载体支架后弹力层面朝上放入48孔培养板中，加入1mL上述构建专用培养液A，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，然后每隔12-24小时更换构建专用培养液B一次，持续培养48-96小时后，即为角膜基质层部分。
4、角膜内皮种子细胞的制备：取人角膜内皮细胞或由角膜缘干细胞诱导分化而来的角膜内皮样细胞，用含15%-20%小牛血清的DMEM/F12培养液在37℃进行扩增培养，待细胞长满单层后，吸出培养液，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化1-2分钟，加入此前吸出的旧培养液终止消化，1000-1500转/分离心10-15分钟，细胞沉淀用4mL构建专用培养液C悬浮均匀制成均质的角膜内皮细胞悬液；经细胞计数后，用上述构建专用培养液C调整细胞浓度至3×105-5×105个细胞/mL；
5、组织工程后板层角膜的体外构建：在上述后弹力层面接种1mL角膜内皮细胞悬液，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中12小时后，吸出构建专用培养液C，然后在48孔培养板中加1mL构建专用培养液D，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中进行培养，然后每隔12-24小时更换构建专用培养液D一次，持续培养72-120小时后，即得组织工程后板层角膜。
结合以下多个实施例进一步阐明本发明。
实施例1
将人角膜基质细胞注射入带有后弹力层的载体支架中，加入构建专用培养液A进行培养，然后更换构建专用培养液B继续培养，制得角膜基质层部分；然后将人角膜内皮细胞接种于上述所得角膜基质层部分的后弹力层上，然后更换构建专用培养液D继续培养，即得到组织结构和功能与正常后板层角膜相近的组织工程后板层角膜。
先取常规配制的DMEM/F12培养液80mL，加入妥布霉素1g，完全溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，补加上述DMEM/F12培养液至100mL，即为载体支架复水溶液；
用上述载体支架复水溶液对载体支架浸泡2小时进行复水处理后，作为组织工程后板层角膜载体支架备用；
再取常规配制的DMEM/F12培养液80mL，加入纤连蛋白40mg、碱性成纤维细胞生长因子1mg，完全溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，加入15mL胎牛血清，补加上述DMEM/F12培养液至100mL，制成构建专用培养液A；再取常规配制的DMEM/F12培养液80mL，加入凝血酸30mg、ε-氨基己酸50mg、抗坏血酸0.1g、基质金属蛋白酶抑制剂BB-94 0.1mg，完全溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，加入15mL小牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至100mL，制成构建专用培养液B；
然后取已有的人角膜基质细胞，用含15%小牛血清的DMEM/F12培养液在37℃进行扩增培养，待细胞长满单层后，吸出培养液，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化2分钟，加入此前吸出的旧培养液终止消化，1000转/分离心15分钟收集细胞沉淀后，用4mL上述构建专用培养液A将上述细胞沉淀悬浮均匀成角膜基质细胞悬液；经细胞计数后，用上述构建专用培养液A调整细胞浓度至6.0×105个细胞/mL；
用微量注射器吸取上述角膜基质细胞悬液，在上述载体支架上均匀注射6针，每针1μL；然后将注射细胞悬液后的载体支架放入48孔培养板中，加入1mL上述构建专用培养液A，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中进行培养，然后每隔12小时更换一次构建专用培养液B，持续培养48小时，即为体外构建的角膜基质层部分；
然后取常规配制的DMEM/F12培养液80mL，加入纤连蛋白20mg、碱性成纤维细胞生长因子1mg、表皮生长因子1mg，完全溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，加入10mL胎牛血清，补加上述的DMEM/F12培养液至100mL，制成构建专用培养液C；
再取已有的人角膜内皮细胞，用含15%小牛血清的DMEM/F12培养液在37℃进行扩增培养，待细胞长满单层后，吸出培养液，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化2分钟，加入此前吸出的旧培养液终止消化，1500转/分离心10分钟收集细胞沉淀后，用4mL上述构建专用培养液C将上述细胞沉淀悬浮均匀成角膜内皮细胞悬液；经细胞计数后，用上述构建专用培养液C调整细胞浓度至5×105个细胞/mL；
再将1mL角膜内皮细胞悬液接种于上述角膜基质层部分的后弹力层面上，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中12小时；
然后取常规配制的DMEM/F12培养液80mL，加入氨基葡萄糖盐酸盐20mg、ε-氨基己酸10mg、人骨形态发生蛋白7 3μg、抗坏血酸0.1g、基质金属蛋白酶抑制剂BB-94 0.1mg；完全溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，加入20mL小牛血清，补加上述的DMEM/F12培养液至100mL，制成构建专用培养液D；待上述的置于37℃、5%二氧化碳培养箱中12小时后，吸出构建专用培养液C，然后在48孔培养板中加入1mL 构建专用培养液D，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中进行培养，然后每隔12小时更换构建专用培养液D一次，持续培养72小时后，即得组织工程后板层角膜。
实施例2
将人角膜基质细胞注射入带有后弹力层的载体支架中，加入构建专用培养液A进行培养，然后更换构建专用培养液B继续培养，制得角膜基质层部分；然后将人角膜内皮细胞接种于上述所得角膜基质层部分的后弹力层上，然后更换构建专用培养液D继续培养，即得到组织结构和功能与正常后板层角膜相近的组织工程后板层角膜。
先取常规配制的DMEM/F12培养液80mL，加入妥布霉素1g，完全溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，补加上述DMEM/F12培养液至100mL，即为载体支架复水溶液；
用上述载体支架复水溶液对载体支架浸泡2小时进行复水处理后，作为组织工程后板层角膜载体支架备用；
再取常规配制的DMEM/F12培养液80mL，加入纤连蛋白20mg、碱性成纤维细胞生长因子1.5mg，完全溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，加入15mL胎牛血清，补加上述DMEM/F12培养液至100mL，制成构建专用培养液A；再取常规配制的DMEM/F12培养液80mL，加入凝血酸40mg、ε-氨基己酸50mg、抗坏血酸0.3g、基质金属蛋白酶抑制剂BB-94 0.3mg，完全溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，加入15mL小牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至100mL，制成构建专用培养液B；
然后取已有的人角膜基质细胞，用含20%小牛血清的DMEM/F12培养液在37℃进行扩增培养，待细胞长满单层后，吸出培养液，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化1.5分钟，加入此前吸出的旧培养液终止消化，1500转/分离心10分钟收集细胞沉淀后，用4mL上述构建专用培养液A将上述细胞沉淀悬浮均匀成角膜基质细胞悬液；经细胞计数后，用上述构建专用培养液A调整细胞浓度至4.0×105个细胞/mL；
用微量注射器吸取上述角膜基质细胞悬液，在上述载体支架上均匀注射6针，每针2μL；然后将注射细胞悬液后的载体支架放入48孔培养板中，加入1mL上述构建专用培养液A，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中进行培养，然后每隔12小时更换一次构建专用培养液B，持续培养72小时，即为体外构建的角膜基质层部分；
然后取常规配制的DMEM/F12培养液80mL，加入纤连蛋白30mg、碱性成纤维细胞生长因子1.5mg、表皮生长因子1.5mg，完全溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，加入10mL胎牛血清，补加上述的DMEM/F12培养液至100mL，制成构建专用培养液C；
再取已有的人角膜内皮细胞，用含20%小牛血清的DMEM/F12培养液在37℃进行扩增培养，待细胞长满单层后，吸出培养液，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化1.5分钟，加入此前吸出的旧培养液终止消化，1000转/分离心10分钟收集细胞沉淀后，用4mL上述构建专用培养液C将上述细胞沉淀悬浮均匀成角膜内皮细胞悬液；经细胞计数后，用上述构建专用培养液C调整细胞浓度至4×105个细胞/mL；
再将1mL角膜内皮细胞悬液接种于上述角膜基质层部分的后弹力层面上，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中12小时；
然后取常规配制的DMEM/F12培养液80mL，氨基葡萄糖盐酸盐30mg、ε-氨基己酸30mg、人骨形态发生蛋白7 4μg、抗坏血酸0.3g、基质金属蛋白酶抑制剂BB-94 0.3mg；完全溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，加入20mL小牛血清，补加上述的DMEM/F12培养液至100mL，制成构建专用培养液D；待上述的置于37℃、5%二氧化碳培养箱中12小时后，吸出构建专用培养液C，然后在48孔培养板中加入1mL 构建专用培养液D，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中进行培养，每隔18小时更换构建专用培养液D一次，持续培养96小时后，即得组织工程后板层角膜。
实施例3
将角膜缘干细胞诱导分化而来的角膜基质样细胞注射入带有后弹力层的载体支架中，加入构建专用培养液A进行培养，然后更换构建专用培养液B继续培养，制得角膜基质层部分；然后将角膜缘干细胞诱导分化而来的角膜内皮样细胞接种于上述所得角膜基质层部分的后弹力层上，然后更换构建专用培养液D继续培养，即得到组织结构和功能与正常后板层角膜相近的组织工程后板层角膜。
先取常规配制的DMEM/F12培养液80mL，加入妥布霉素1g，完全溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，补加上述DMEM/F12培养液至100mL，即为载体支架复水溶液；
用上述载体支架复水溶液对载体支架浸泡2小时进行复水处理后，作为组织工程后板层角膜载体支架备用；
再取常规配制的DMEM/F12培养液80mL，加入纤连蛋白25mg、碱性成纤维细胞生长因子2mg，完全溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，加入15mL胎牛血清，补加上述DMEM/F12培养液至100mL，制成构建专用培养液A；再取常规配制的DMEM/F12培养液80mL，加入凝血酸50mg、ε-氨基己酸30mg、抗坏血酸0.5g、基质金属蛋白酶抑制剂BB-94 0.5mg，完全溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，加入15mL小牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至100mL，制成构建专用培养液B；
然后取角膜缘干细胞诱导分化而来的角膜基质样细胞，用含20%小牛血清的DMEM/F12培养液在37℃进行扩增培养，细胞长满单层后，吸出培养液，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化1分钟，加入此前吸出的旧培养液终止消化，1200转/分离心15分钟收集细胞沉淀后，用4mL上述构建专用培养液A将上述细胞沉淀悬浮均匀成角膜基质样细胞悬液；经细胞计数后，用上述构建专用培养液A调整细胞浓度至2.0×105个细胞/mL；
用微量注射器吸取上述角膜基质样细胞悬液，在上述载体支架上均匀注射9针，每针1.5μL；然后将注射细胞悬液后的载体支架放入48孔培养板中，加入1mL上述构建专用培养液A，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中进行培养，然后每隔24小时更换一次构建专用培养液B，持续培养96小时，即为体外构建的角膜基质层部分；
然后取常规配制的DMEM/F12培养液80mL，加入纤连蛋白40mg、碱性成纤维细胞生长因子2mg、表皮生长因子2mg，完全溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，加入10mL胎牛血清，补加上述的DMEM/F12培养液至100mL，制成构建专用培养液C；
再取角膜缘干细胞诱导分化而来的角膜内皮样细胞，用含20%小牛血清的DMEM/F12培养液在37℃进行扩增培养，细胞长满单层后，吸出培养液，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化1分钟，加入此前吸出的旧培养液终止消化，1200转/分离心15分钟收集细胞沉淀后，用4mL上述构建专用培养液C将上述细胞沉淀悬浮均匀成角膜内皮样细胞悬液；经细胞计数后，用上述构建专用培养液C调整细胞浓度至3×105个细胞/mL；
再将1mL角膜内皮样细胞悬液接种于上述角膜基质层部分的后弹力层面上，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中12小时；
然后取常规配制的DMEM/F12培养液80mL，加入氨基葡萄糖盐酸盐30mg、ε-氨基己酸50mg、人骨形态发生蛋白7 5μg、抗坏血酸0.5g、基质金属蛋白酶抑制剂BB-94 0.5mg；完全溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，加入20mL小牛血清，补加上述的DMEM/F12培养液至100mL，制成构建专用培养液D；待上述的置于37℃、5%二氧化碳培养箱中12小时后，吸出构建专用培养液C，然后在48孔培养板中加入1mL 构建专用培养液D，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中进行培养，然后每隔24小时更换构建专用培养液D一次，持续培养120小时后，即得组织工程后板层角膜。
由此可见，利用本发明的方法体外构建的组织工程后板层角膜，可作为捐献角膜的替代物应用于角膜内皮层和基质层异常的角膜疾病的修复，且容易实现规模化生产。

Claims (8)

1.一种组织工程后板层角膜的体外构建方法，包括作为角膜种子细胞的人角膜基质细胞和人角膜内皮细胞，以及带有后弹力层的脱细胞猪角膜基质作为组织工程角膜载体支架，其特征是首先在上述载体支架中接种角膜基质种子细胞构建出组织工程后板层角膜的基质层部分，再在上述构建的基质层部分的后弹力层上接种角膜内皮种子细胞，即构建出组织结构和功能与正常后板层角膜相近的组织工程后板层角膜。
2.如权利要求1所述的组织工程后板层角膜的体外构建方法，其特征是上述角膜基质种子细胞和角膜内皮种子细胞可以由角膜缘干细胞诱导分化而来的角膜基质样细胞和角膜内皮样细胞替代。
3.如权利要求1所述的组织工程后板层角膜的体外构建方法，其特征在于上述基质层部分的构建是首先用载体支架复水溶液对组织工程角膜载体支架进行复水，然后用构建专用培养液A将人角膜基质细胞制成角膜基质细胞悬液，再将该细胞悬液注射入经载体支架复水溶液复水后的载体支架中，再加入构建专用培养液A后进行体外培养，然后更换构建专用培养液B继续培养，得到组织工程后板层角膜的基质层部分；再用构建专用培养液C将人角膜内皮细胞制成角膜内皮细胞悬液后，将该细胞悬液接种于上述组织工程后板层角膜的基质层部分的后弹力层上进行体外培养，再将构建专用培养液C更换为构建专用培养液D进行培养，然后更换新的上述构建专用培养液D继续培养，即得组织结构和功能与正常后板层角膜相近的组织工程后板层角膜；
上述构建专用培养液A的配方是含有15%胎牛血清、0.2-0.4mg/mL纤连蛋白和0.01-0.02mg/mL碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养液；
上述构建专用培养液B的配方是含有15%小牛血清、0.3-0.5mg/mL凝血酸、0.1-0.5mg/mL ε-氨基己酸、1-5mg/mL抗坏血酸和1-5μg/mL基质金属蛋白酶抑制剂BB-94的DMEM/F12培养液；
上述构建专用培养液C的配方是含有10%胎牛血清、0.2-0.4mg/mL纤连蛋白、0.01-0.02mg/mL碱性成纤维细胞生长因子和0.01-0.02mg/mL表皮细胞生长因子的DMEM/F12培养液；
上述构建专用培养液D的配方是20%小牛血清、0.2-0.4mg/mL氨基葡萄糖盐酸盐、0.1-0.5mg/mL ε-氨基己酸、30-50ng/mL人骨形态发生蛋白7、1-5mg/mL抗坏血酸和1-5μg/mL基质金属蛋白酶抑制剂BB-94的DMEM/F12培养液。
4.如权利要求3所述的组织工程后板层角膜的体外构建方法，其特征是上述角膜基质细胞悬液的制备方法：先取人角膜基质细胞，用含15%-20%小牛血清的DMEM/F12培养液培养至汇合单层后，再用0.25%胰蛋白酶溶液进行消化、离心收集细胞沉淀，最后再用上述构建专用培养液A重悬细胞沉淀，调整细胞浓度为2×105-6×105个细胞/毫升，即得均质的角膜基质细胞悬液。
5.如权利要求3所述的组织工程后板层角膜的体外构建方法，其特征是上述角膜内皮细胞悬液的制备方法：先取人角膜内皮细胞，用含15%-20%小牛血清的DMEM/F12培养液培养至汇合单层后，再用0.25%胰蛋白酶溶液进行消化、离心收集细胞沉淀，最后再用上述构建专用培养液C重悬细胞沉淀，调整细胞浓度为3×105-5×105个细胞/毫升，即得均质的角膜内皮细胞悬液。
6.如权利要求3所述的组织工程后板层角膜的体外构建方法，其特征是上述角膜基质细胞悬液注射入经载体支架复水溶液复水后的载体支架中，再加入构建专用培养液A后进行体外培养，然后更换构建专用培养液B继续培养的方法：是用微量注射器吸取上述角膜基质细胞悬液，在每个载体支架上均匀注射6-9针，每针1-2微升，后弹力层面朝上置于48孔板中，然后加入上述构建专用培养液A，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中，每隔12-24小时更换上述构建专用培养液B一次，持续培养48-96小时后，即得组织工程后板层角膜的基质层部分。
7.如权利要求3所述的组织工程后板层角膜的体外构建方法，其特征是上述角膜内皮细胞悬液接种于上述组织工程后板层角膜的基质层部分的后弹力层上进行体外培养，再将构建专用培养液C更换为构建专用培养液D进行培养，然后更换新的上述构建专用培养液D继续培养的方法：是吸取1mL上述角膜内皮细胞悬液接种于组织工程后板层角膜的基质层部分的后弹力层面上，12小时后，吸出构建专用培养液C，更换为构建专用培养液D，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中，每隔12-24小时更换上述构建专用培养液D一次，持续培养72-120小时后，即得组织工程后板层角膜。
8.权利要求1所构建的组织工程后板层角膜，其特征是作为捐献人后板层角膜的替代物应用于角膜内皮层和基质层异常的修复。
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