CN115006593B - 机械增强型组织工程角膜内皮的体外构建方法 - Google Patents

机械增强型组织工程角膜内皮的体外构建方法 Download PDF

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Abstract

机械增强型组织工程角膜内皮的体外构建方法，包括利用已有的人角膜内皮种子细胞，以及机械强度增强后的去上皮层羊膜载体支架，通过添加专用培养体系，将人角膜内皮种子细胞悬液接种到机械增强型去上皮层羊膜载体支架上，即构建出机械性能、组织结构和功能与正常角膜内皮相近的组织工程角膜内皮。本发明攻克了传统组织工程角膜内皮机械性能不足无法应用于DMEK术式的难题，同时构建出的组织工程角膜内皮具有角膜内皮细胞密度极高、连接紧密的单层内皮结构（高达3500~3800个细胞/mm2，相当于0~3岁儿童的角膜内皮细胞密度），且移植到刮除角膜内皮的家猫及猕猴眼中可使动物角膜长期维持透明，重建出可以行使正常功能的角膜内皮。

Description

机械增强型组织工程角膜内皮的体外构建方法
技术领域
本发明涉及一种机械增强型组织工程角膜内皮的体外构建方法，属于再生医学组织工程领域的构建技术。
背景技术
角膜位于眼球最前端的无血管透明组织，为眼睛提供大部分屈光力，也是人体唯一的免疫赦免区。角膜的组织结构由外到内依次为角膜上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层。其中角膜内皮层由单层、扁平、连接紧密的六角形内皮样细胞镶嵌而成，对维持角膜的半脱水状态、正常厚度、透明性以及从房水中获取养分与氧气具有无法替代的作用。人角膜内皮细胞在成年后丧失了***能力，且以每年0.3%~0.6%的比例死亡。局部细胞损伤后只能依靠邻近细胞的增大、扩展和移行来填补缺损区，以维持角膜内皮层的单层形态和功能。此外，白内障等手术损伤、长期高眼压（青光眼）、持续重度虹膜炎和严重虹膜前粘连等均可引起大量角膜内皮细胞的损伤与快速死亡，一旦角膜内皮细胞密度低于维持内皮生理功能的临界密度(600~800个/平方毫米)，角膜将出现不可逆病变，最终将引起角膜内皮失代偿，轻者引起角膜水肿和视敏度下降，重者甚至致盲。角膜内皮病盲患者绝大部分可以通过角膜移植而复明，但由于捐献角膜的数量有限和老化问题，致使大量患者因得不到移植角膜而无法复明。近年来，角膜组织工程的兴起与发展为组织工程角膜内皮的体外构建及其临床应用创造了条件，也为角膜内皮病盲患者通过组织工程角膜内皮的移植重见光明带来了新的希望，因而如何获得正常足量的人角膜内皮种子细胞，制备出具有一定机械强度及良好生物相容性的载体支架，建立高密度内皮的体外构建方式，进而可以利用临床中供体内皮移植的最佳术式——后弹力层角膜内皮移植术（DMEK）进行移植治疗，仍然是当前组织工程角膜内皮体外构建研究的热点和难点。
在种子细胞方面，樊廷俊等在国际上成功建立了非转染无致瘤性的人角膜内皮组织细胞系（ZL200510044143.3），首次解决了组织工程角膜内皮规模化构建所需大量种子细胞的来源问题。
在载体支架方面，目前用于组织工程角膜体外构建所用的载体支架主要有角膜后弹力层、去上皮羊膜、胶原-壳聚糖-硫酸软骨素共混膜、胶原-壳聚糖-透明质酸钠、聚羟乙基丙烯酸甲酯、脱细胞猪角膜基质和N-(1-甲基乙基)-2-丙烯酰胺均聚物等。其中，樊廷俊等利用新鲜羊膜在体外制备了具有良好生物相容性的组织工程人角膜内皮载体支架（ZL201010102340.7），成功解决了组织工程角膜内皮体外构建缺失载体支架的难题。然而该羊膜支架虽然与人角膜内皮种子细胞具有良好的生物相容性，但基于该支架构建的组织工程人角膜内皮机械强度不够，无法应用于对支架硬度有要求的临床角膜内皮移植的DMEK术式；同时，如何获得具有更高密度的组织工程人角膜内皮，依然是目前限制组织工程人角膜内皮规模化生产的瓶颈。因此，如何筛选和制备具有高仿生、机械性强、透明性好、能定向调控细胞行为的理想载体支架，仍然是制约组织工程角膜内皮规模化体外构建的瓶颈问题。
因此，建立理想载体支架的制备技术，进而建立机械性能理想且功能性好的组织工程人角膜内皮的体外构建技术，生产出可用于临床DMEK术式移植的组织工程人角膜内皮，对于彻底解决供体角膜材料的严重匮乏问题以及有效治疗该类疾病至关重要要。
发明内容
本发明的目的是提供一种机械增强型组织工程角膜内皮的体外构建方法，利用人角膜内皮组织细胞和机械增强型去上皮层羊膜载体支架进行组织工程角膜内皮的体外构建，以弥补现有技术和材料的不足。
本发明的技术构思是利用已有的人角膜内皮种子细胞，以及机械强度增强后的去上皮层羊膜载体支架，通过添加专用培养体系，将特定数量的人角膜内皮种子细胞悬液接种到机械增强型去上皮层羊膜载体支架上，即构建出机械性能、组织结构和功能与正常角膜内皮相近的组织工程角膜内皮。
一种机械增强型组织工程角膜内皮的体外构建方法，其特征在于包括以下步骤：
1）角膜内皮种子细胞的制备：
取人角膜内皮细胞，利用含10%~20%（v/v）胎牛血清的DMEM/F12培养液对人角膜内皮细胞进行扩增培养，待细胞长满单层后，吸出培养液，再加入0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.02%（w/v）EDTA混合溶液消化，离心收集细胞沉淀，再用专用培养液A将该细胞沉淀悬浮成人角膜内皮细胞悬液；
2）载体支架的制备：
利用0.25%（w/v）胰蛋白酶对新鲜羊膜的上皮面进行倒置消化以制备完全去上皮层羊膜，利用细胞刮刀刮除松散的上皮细胞，利用漂洗缓冲液漂洗2次，每次15~20分钟后，将去上皮层羊膜避光浸泡在专用交联剂溶液B中，于37℃恒温摇床缓慢摇动浸泡处理 20~40 分钟后，利用波长320~420 nm的紫外光照射10~20分钟，照射距离为3~6厘米进行机械性能改性；之后用0.9%（w/v）生理盐水漂洗2次，每次15~20分钟后，再用超纯水漂洗2次，每次15~20分钟；将交联漂洗后的去上皮层羊膜上皮层朝上平铺于PVDF膜上，风干24~48小时；利用角膜环钻将该去上皮层羊膜从PVDF膜上环成与培养板孔直径相同的圆片；继而使用剂量为7~14kGy的电离射线进行辐照灭菌，即制成组织工程角膜内皮的载体支架；
3）组织工程人角膜内皮的体外构建：
将载体支架上皮面朝上平铺于48孔培养板孔的底部，将上述人角膜内皮细胞悬液1毫升接种在平铺有上述羊膜载体支架的培养板中，置于37℃、5%（v/v）二氧化碳培养箱中12小时，待人角膜内皮细胞全部贴附在上述羊膜载体支架上后，吸出专用培养液A，然后在上述48孔培养板中加入1mL专用培养液C，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中进行培养，然后每隔12~24小时更换构建专用培养液C一次，持续培养96~120小时后，待人角膜内皮细胞在羊膜载体支架上长成单层即为构建的组织工程人角膜内皮。
所述组织工程人角膜内皮构建专用培养液A的配方为含有10%胎牛血清、0.02~0.04毫克/毫升Y-27632的DMEM/F12培养液。
所述组织工程人角膜内皮构建专用交联剂溶液B的配方：含有50-100毫克/毫升右旋糖苷、1~2毫克/毫升维生素B2的生理盐水。
所述组织工程人角膜内皮构建专用培养液C的配方：含有10%胎牛血清、0.05~0.15毫克/毫升纤连蛋白和0.005~0.015毫克/毫升层粘连蛋白的DMEM/F12培养液。
所述步骤1）用专用培养液A将该细胞沉淀悬浮成人角膜内皮细胞悬液中，人角膜内皮细胞的浓度为3×105~5×105个细胞/毫升。
所述步骤1）中的离心收集细胞沉淀，是1000~1500转/分离心10~15分钟获得人角膜内皮细胞沉淀。
所述步骤2）中所用漂洗缓冲液的配方：0.01M PBS缓冲液（pH7.4）。
本发明构建的组织工程角膜内皮具有与正常角膜内皮相似的组织结构与功能，其中组织结构上，增强的机械性能使其可适用于目前供体内皮移植采用的DMEK术式，从而避免了过去因机械性能弱只能应用于免疫排斥及感染风险高的穿透性角膜移植术式的不足。功能上，利用高密度接种，通过早期复合促贴壁因子Y-27632，更好的帮助了细胞的贴附，后期培养中层粘连蛋白及纤连蛋白的加入，使得载体支架上的种子细胞能够表现出更好的增殖行为，从而构建出了具有增强型机械性能且高功效的组织工程人角膜内皮。最终构建出的组织工程角膜内皮中，角膜内皮细胞形成密度极高、连接紧密的单层内皮结构（高达3500~3800个细胞/平方毫米，相当于0~3岁儿童的角膜内皮细胞密度）。且本发明体外构建的组织工程人角膜内皮移植到刮除角膜内皮的家猫及猕猴眼中可使动物角膜维持透明，重建出了可以行使正常功能的角膜内皮。
具体实施方式
1、构建专用培养液A的配制：取常规配制的无菌DMEM/F12培养液90毫升，加入10毫升胎牛血清，即为构建专用培养液A；
本发明为了提高人角膜基质细胞在载体支架中的附着效果，又将上述构建专用培养液A的配方上添加了2~4毫克的Y-27632；
2、构建专用交联剂溶液B的配制：取生理盐水800毫升，加入50~100克右旋糖苷，再加入1~2克维生素B2，完全溶解后用生理盐水定容至1000毫升，抽滤除菌后即为本发明的专用交联剂溶液B；
3、构建专用培养液C的配制：取常规配制的DMEM/F12培养液80毫升，加入5~15毫克纤连蛋白，0.5~1.5毫克层粘连蛋白完全溶解后，用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入10mL胎牛血清，补加上述DMEM/F12培养液至100mL，即为构建专用培养液C；
4、上述漂洗缓冲液的配制方法：取超纯水800毫升，加入7.9克NaCl，0.2克KCl，1.05克K2HPO4，0.189克KH2PO4，调pH值至7.4，定容至1000毫升。
本发明的具体实施步骤：
1、角膜内皮种子细胞的制备：取人角膜内皮细胞，用含10%~20%（v/v）胎牛血清的DMEM/F12培养液在37℃进行扩增培养，待细胞长满单层后，吸出培养液，加入0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.02%（w/v）EDTA混合溶液消化1~2分钟，加入此前吸出的旧培养液终止消化，1000~1500转/分离心10~15分钟，细胞沉淀用4毫升构建专用培养液A悬浮均匀制成均质的角膜内皮细胞悬液；经细胞计数后，用上述构建专用培养液A调整细胞浓度至3×105~5×105个细胞/毫升；
2、载体支架的制备：利用0.25%（w/v）胰蛋白酶溶液对新鲜羊膜的上皮面进行倒置消化，利用细胞刮刀刮除松散的上皮细胞，继而利用漂洗缓冲液漂洗2次，每次15~20分钟后，将去上皮层羊膜避光浸泡在10毫升专用交联剂溶液B中，于37℃恒温摇床缓慢摇动浸泡处理 20~40分钟后，利用波长320~420纳米的紫外光照射10~20分钟，照射距离为3~6厘米；之后用0.9%（w/v）生理盐水漂洗2次，每次15~20分钟后，再用超纯水漂洗2次，每次15~20分钟；最后将交联漂洗后的去上皮层羊膜上皮层朝上平铺于PVDF膜上，风干24~48小时后，使用10.25毫米直径的角膜环钻，将其从PVDF膜上环成独立的支架圆片，继而使用剂量为7~14Kgy的电离射线进行辐照灭菌，即制成组织工程角膜内皮的载体支架；
3、组织工程人角膜内皮的体外构建：将载体支架（即去上皮层羊膜圆片）上皮面朝上平铺于48孔培养板中，在其上接种1毫升角膜内皮细胞悬液，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中12小时后，吸出构建专用培养液A，然后在48孔培养板中加1mL构建专用培养液C，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中进行培养，然后每隔12~24小时更换构建专用培养液C一次，持续培养96~120小时后，即得组织工程角膜内皮。
结合以下多个实施例进一步阐明本发明。
实施例1
取常规配制的DMEM/F12培养液90毫升，加入2毫克Y-27632, 完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入10毫升胎牛血清，补加上述DMEM/F12培养液至100毫升，制成构建专用培养液A；取生理盐水800毫升，加入50克右旋糖苷，再加入1克维生素B2，完全溶解后用生理盐水定容至1000毫升，抽滤除菌后制成专用交联剂溶液B；再取常规配制的DMEM/F12培养液80毫升，加入5毫克纤连蛋白，0.5毫克层粘连蛋白完全溶解后，用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入10毫升胎牛血清，补加上述DMEM/F12培养液至100毫升，即为构建专用培养液C；
取人角膜内皮细胞，用含10%（v/v）胎牛血清的DMEM/F12培养液在37℃进行扩增培养，待细胞长满单层后，吸出培养液，加入0.25%胰蛋白酶-0.02%（w/v）EDTA混合溶液0.5mL消化2分钟，加入此前吸出的旧培养液终止消化，1000转/分离心15分钟，细胞沉淀用4毫升构建专用培养液A悬浮均匀制成均质的角膜内皮细胞悬液；经细胞计数后，用上述构建专用培养液A调整细胞浓度至3×105个细胞/毫升；
利用0.25%的胰蛋白酶溶液对新鲜羊膜的上皮面进行倒置消化，利用细胞刮刀刮除松散的上皮细胞，继而利用漂洗缓冲液漂洗2次，每次15分钟后，将去上皮层羊膜避光浸泡在10毫升专用交联剂溶液B中，于37℃恒温摇床缓慢摇动浸泡处理 40分钟后，利用波长320纳米的紫外光照射20分钟，照射距离为3厘米；之后用0.9%（w/v）生理盐水漂洗2次，每次15min后，再用超纯水漂洗2次，每次15分钟；最后将交联漂洗后的去上皮层羊膜上皮层朝上平铺于PVDF膜上，风干24小时后，使用10.25毫米直径的角膜环钻，将其从PVDF膜上环成独立的支架圆片，继而使用剂量为7 kGy的电离射线进行辐照灭菌，即制成组织工程角膜内皮的载体支架；
将载体支架上皮面朝上平铺于48孔培养板中，在其上接种1毫升角膜内皮细胞悬液，置于37℃、5%（v/v）二氧化碳培养箱中12小时后，吸出构建专用培养液A，然后在48孔培养板中加1毫升构建专用培养液C，置于37℃、5%（v/v）二氧化碳培养箱中进行培养，然后每隔24小时更换构建专用培养液C一次，持续培养120小时后，即得组织工程角膜内皮。
实施例2
取常规配制的DMEM/F12培养液90毫升，加入3毫克Y-27632 , 完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入10毫升胎牛血清，补加上述DMEM/F12培养液至100毫升，制成构建专用培养液A；取生理盐水800毫升，加入75克右旋糖苷，再加入1.5克维生素B2，完全溶解后用生理盐水定容至1000毫升，抽滤除菌后制成专用交联剂溶液B；再取常规配制的DMEM/F12培养液80毫升，加入10毫克纤连蛋白，1毫克层粘连蛋白完全溶解后，用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入10毫升胎牛血清，补加上述DMEM/F12培养液至100毫升，即为构建专用培养液C；
取人角膜内皮细胞，用含10%~20%胎牛血清的DMEM/F12培养液在37℃进行扩增培养，待细胞长满单层后，吸出培养液，加入0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.02%（w/v）EDTA混合溶液1毫升消化1分钟，加入此前吸出的旧培养液终止消化，1500转/分离心10分钟，细胞沉淀用4毫升构建专用培养液A悬浮均匀制成均质的角膜内皮细胞悬液；经细胞计数后，用上述构建专用培养液A调整细胞浓度至4×105个细胞/毫升；
利用0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液对新鲜羊膜的上皮面进行倒置消化，利用细胞刮刀刮除松散的上皮细胞，继而利用漂洗缓冲液漂洗2次，每次20分钟后，将去上皮层羊膜避光浸泡在10毫升专用交联剂溶液B中，于37℃恒温摇床缓慢摇动浸泡处理30分钟后，利用波长370纳米的紫外光照射15分钟，照射距离为4厘米；之后用0.9%（w/v）生理盐水漂洗2次，每次15分钟后，再用超纯水漂洗2次，每次15分钟；最后将交联漂洗后的去上皮层羊膜上皮层朝上平铺于PVDF膜上，风干36小时后，使用10.25毫米直径的角膜环钻，将其从PVDF膜上环成独立的支架圆片，继而使用剂量为7 Kgy的电离射线进行辐照灭菌，即制成组织工程角膜内皮的载体支架；
将载体支架上皮面朝上平铺于48孔培养板中，在其上接种1毫升角膜内皮细胞悬液，置于37℃、5%（v/v）二氧化碳培养箱中12小时后，吸出构建专用培养液A，然后在48孔培养板中加1毫升构建专用培养液C，置于37℃、5%（v/v）二氧化碳培养箱中进行培养，然后每隔24小时更换构建专用培养液C一次，持续培养108小时后，即得组织工程角膜内皮。
实施例3
取常规配制的DMEM/F12培养液90mL，加入4毫克Y-27632 , 完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入10毫升胎牛血清，补加上述DMEM/F12培养液至100毫升，制成构建专用培养液A；取生理盐水800毫升，加入100克右旋糖苷，再加入2克维生素B2，完全溶解后用生理盐水定容至1000毫升，抽滤除菌后制成专用交联剂溶液B；再取常规配制的DMEM/F12培养液80mL，加入15毫克纤连蛋白，1.5毫克层粘连蛋白完全溶解后，用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入10毫升胎牛血清，补加上述DMEM/F12培养液至100毫升，即为构建专用培养液C；
取人角膜内皮细胞，用含20%（v/v）胎牛血清的DMEM/F12培养液在37℃进行扩增培养，待细胞长满单层后，吸出培养液，加入0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.02%（w/v）EDTA混合溶液1毫升消化1分钟，加入此前吸出的旧培养液终止消化，1500转/分离心10分钟，细胞沉淀用4毫升构建专用培养液A悬浮均匀制成均质的角膜内皮细胞悬液；经细胞计数后，用上述构建专用培养液A调整细胞浓度至5×105个细胞/毫升；
利用0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液对新鲜羊膜的上皮面进行倒置消化，利用细胞刮刀刮除松散的上皮细胞，继而利用漂洗缓冲液漂洗2次，每次20分钟后，将去上皮层羊膜避光浸泡在10毫升专用交联剂溶液B中，于37℃恒温摇床缓慢摇动浸泡处理20分钟后，利用波长420纳米的紫外光照射10分钟，照射距离为3厘米；之后用0.9%（w/v）生理盐水漂洗2次，每次20分钟后，再用超纯水漂洗2次，每次20分钟；最后将交联漂洗后的去上皮层羊膜上皮层朝上平铺于PVDF膜上，风干48小时后，使用10.25毫米直径的角膜环钻，将其从PVDF膜上环成独立的支架圆片，继而使用剂量为14 kGy的电离射线进行辐照灭菌，即制成组织工程角膜内皮的载体支架；
将载体支架上皮面朝上平铺于48孔培养板中，在其上接种1毫升角膜内皮细胞悬液，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中12小时后，吸出构建专用培养液A，然后在48孔培养板中加1毫升构建专用培养液C，置于37℃、5%（v/v）二氧化碳培养箱中进行培养，然后每隔24小时更换构建专用培养液C一次，持续培养120小时后，即得组织工程角膜内皮。
由此可见，利用本发明的方法体外构建的组织工程人角膜内皮，可作为捐献角膜内皮的替代物应用于角膜内皮层异常的角膜疾病的修复，且容易实现规模化生产。

Claims (4)

1.一种机械增强型组织工程角膜内皮的体外构建方法，其特征在于包括以下步骤：
1）角膜内皮种子细胞悬液的制备：
取人角膜内皮细胞，利用含10%~20% v/v胎牛血清的DMEM/F12培养液对人角膜内皮细胞进行扩增培养，待细胞长满单层后，吸出培养液，再加入0.25% w/v胰蛋白酶-0.02% w/vEDTA混合溶液消化，离心收集细胞沉淀，再用专用培养液A将该细胞沉淀悬浮成人角膜内皮细胞悬液；
2）载体支架的制备：
利用0.25% w/v胰蛋白酶对新鲜羊膜的上皮面进行倒置消化以制备完全去上皮层羊膜，利用细胞刮刀刮除松散的上皮细胞，利用漂洗缓冲液漂洗2次，每次15~20分钟后，将去上皮层羊膜避光浸泡在专用交联剂溶液B中，于37℃恒温摇床缓慢摇动浸泡处理 20~40 分钟后，利用波长320~420 nm的紫外光照射10~20分钟，照射距离为3~6厘米进行机械性能改性；之后用0.9% w/v生理盐水漂洗2次，每次15~20分钟后，再用超纯水漂洗2次，每次15~20分钟；将交联漂洗后的去上皮层羊膜上皮层朝上平铺于PVDF膜上，风干24~48小时；利用角膜环钻将该去上皮层羊膜从PVDF膜上环成与培养板孔直径相同的圆片；继而使用剂量为7~14kGy的电离射线进行辐照灭菌，即制成组织工程角膜内皮的载体支架；
3）组织工程角膜内皮的体外构建：
将载体支架上皮面朝上平铺于48孔培养板孔的底部，将上述人角膜内皮细胞悬液1毫升接种在平铺有上述羊膜载体支架的培养板中，置于37℃、5% v/v二氧化碳培养箱中12小时，待人角膜内皮细胞全部贴附在上述羊膜载体支架上后，吸出专用培养液A，然后在上述48孔培养板中加入1mL专用培养液C，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中进行培养，然后每隔12~24小时更换构建专用培养液C一次，持续培养96~120小时后，待人角膜内皮细胞在羊膜载体支架上长成单层即为构建的组织工程角膜内皮；
所述专用培养液A的配方为含有10%胎牛血清、0.02~0.04毫克/毫升Y-27632的DMEM/F12培养液；
所述专用交联剂溶液B的配方：含有50-100毫克/毫升右旋糖苷、1~2毫克/毫升维生素B2的生理盐水；
所述专用培养液C的配方：含有10%胎牛血清、0.05~0.15毫克/毫升纤连蛋白和0.005~0.015毫克/毫升层粘连蛋白的DMEM/F12培养液。
2.如权利要求1所述的机械增强型组织工程角膜内皮的体外构建方法，其特征是所述步骤1）用专用培养液A将该细胞沉淀悬浮成人角膜内皮细胞悬液中，人角膜内皮细胞的浓度为3×105~5×105个细胞/毫升。
3.如权利要求1所述的机械增强型组织工程角膜内皮的体外构建方法，其特征是所述步骤1）中的离心收集细胞沉淀，是1000~1500转/分离心10~15分钟获得人角膜内皮细胞沉淀。
4.如权利要求1所述的机械增强型组织工程角膜内皮的体外构建方法，其特征是所述步骤2）中所用漂洗缓冲液的配方：0.01M PBS缓冲液，pH7.4。
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