CN104645416A - 一种组织工程人角膜基质的体外构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种组织工程人角膜基质的体外构建方法。其特征是用组织工程人角膜基质体外构建专用培养液A将人角膜基质细胞制成细胞悬液，再将该细胞悬液注射入经载体支架专用复水溶液复水后的脱细胞猪角膜基质载体支架中，置入24孔培养板中，加入体外构建专用培养液A进行体外培养，期间更换体外构建专用培养液B继续培养，即得组织工程人角膜基质。本发明生产成本低、耗时少，更好的保持了载体支架结构的完整性，所构建出的组织工程人角膜基质在形态结构和透明度上与正常人角膜基质相似，并具有正常角膜基质的功能，可作为捐献角膜的替代物用于角膜基质异常的修复，因此已可用于批量生产满足对组织工程人角膜基质的高质量需求。
Description
技术领域
本发明属于组织工程角膜基质构建技术领域，具体涉及一种组织工程人角膜基质的体外构建方法。
背景技术
人角膜基质层由人角膜基质细胞和200-250个胶原纤维板层构成，在维持角膜透明和角膜厚度等方面具有不可替代的作用。角膜一旦受到感染、深度热烧伤、深度化学灼伤或手术创伤等，将引起人角膜基质细胞发生不同程度的损伤，进而导致角膜水肿和瘢痕形成而使视力受损，严重者将导致角膜不透明，即引发角膜病盲疾病，常见的有胶原斑、上皮下基质混浊和网状角膜混浊等。目前，人角膜基质移植是目前角膜基质病盲治愈的唯一途径，我国约有角膜病盲患者近500万人，尽管他们可以通过角膜移植来治愈，但由于捐献角膜的严重匮乏致使绝大多数患者因得不到适宜的供体而无法复明。自上个世纪以来，角膜组织工程新兴学科的快速发展，使组织工程人角膜基质的体外构建成为可能，也是目前解决捐献角膜数量严重不足的一种新的可行途径，更为各种角膜基质病盲患者通过组织工程人角膜基质的临床移植和治疗带来了新的希望。
但是在组织工程人角膜基质的体外构建研究中，如何获得足量的人角膜基质细胞作为种子细胞、理想的载体支架，以及体外的构建方法，是目前组织工程人角膜基质体外构建的研究热点。国内外学者们分别利用癌基因转染的永生化人角膜基质细胞(Peters DM等，1996；Doillon CJ等，2003；Reichl S等，2004；Manzer AK等，2009；Yoshiko K等，2010)、原代培养的人角膜基质细胞(Barbaro V等，2009；Proulx S等，2010)和继代培养3-8代的人角膜基质细胞(Crabb RA等，2005；Builles N等，2007；VranaE等，2008)作为种子细胞，分别利用胶原蛋白-硫酸软骨素凝胶(Griffith M等，1999)、胶原蛋白-聚N-异丙基丙烯酰胺共混聚合物(Shimmura S等，2003)、胶原蛋白-糖胺聚糖-壳聚糖泡沫(Builles N等，2007)、聚羟基乙酸未拆解纤维(Liu和Cao，2007)、水凝胶(Mimura T等，2008)、移植用透明人角膜片(Barbaro V等，2009)、多层胶原纤维(Builles N等，2010)、人角膜基质细胞分泌的细胞外基质(Proulx S等，2010)和脱细胞猪角膜基质(Yoeruek E等，2011)等作为载体支架，在体外构建出形态及组织结构与正常角膜基质近似的人角膜基质组织类似物，为组织工程人角膜基质的体外构建开辟了道路，但由于接种种子细胞的方法多采用直接接种法，导致细胞因密度过大而出现接触抑制现象，并且该方法退出在体外培养的时间很长，再者，所用种子细胞或者是转染了癌基因的永生化细胞具有潜在致瘤性，或者是来自眼库角膜的原代培养细胞或仅传3-8代的继代培养细胞，即获得的人角膜基质细胞的数量非常有限，因而大大限制了组织工程人角膜基质的规模化体外构建及其临床应用。现有组织工程人角膜基质体外构建的研究报道，仍局限于实验研究，根本无法满足众多角膜基质病盲临床的大量需求。
2011年，樊廷俊等成功建立了非转染、无致瘤性的人角膜基质细胞系，可为组织工程人角膜基质规模化构建提供足量的种子细胞来源。2014年，樊廷俊等对切取的新鲜猪角膜片进行低渗溶胀，在反复冻融破碎细胞后，以DNA-RNA酶处理去除其中的残留核酸物质，然后浸入含质量体积百分比10％-20％右旋糖苷溶液和质量体积百分比0.1％-0.2％核黄素的角膜专用交联剂溶液，先后利用紫外光A照射交联、漂洗、风干和电离辐照灭菌，成功制备出了透明性好、机械性强、与人角膜种子细胞生物相容性理想的组织工程角膜载体支架(以下简称载体支架)——脱细胞猪角膜基质，成功解决了组织工程人角膜基质规模化构建缺乏大量理想载体支架的问题。因此，尽早建立一种利用人角膜基质细胞和载体支架快速的体外构建组织工程人角膜基质的方法，是组织工程角膜基质规模化生产及临床应用造福全世界角膜基质病盲的关键。
发明内容
本发明的目的是以人角膜基质细胞为种子细胞、脱细胞猪角膜基质为载体支架，提供一种组织工程人角膜基质的体外构建方法，以弥补现有技术的不足。
本发明的体外构建方法包括：
用组织工程人角膜基质体外构建专用培养液A(以下简称体外构建专用培养液A)将人角膜基质细胞制成细胞悬液，再将该细胞悬液注射入用载体支架专用复水溶液处理后并用角膜环钻制成所需大小的圆形载体支架中，放置至24孔培养板孔中，加入体外构建专用培养液A后，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中进行体外培养，培养过程中更换组织工程人角膜基质体外构建专用培养液B(以下简称体外构建专用培养液B)继续培养，即得到组织结构和功能与正常人角膜基质相近的组织工程人角膜基质。
上述人角膜基质细胞悬液的制备方法：先取人角膜基质细胞，用含15％-20％小牛血清的DMEM/F12培养液培养至对数生长期后，再用0.25％胰蛋白酶溶液进行消化、离心收集细胞沉淀，最后再用体外构建专用培养液A重悬细胞沉淀，即得均质的人角膜基质细胞悬液。
上述人角膜基质细胞悬液的细胞浓度范围是5.0×106-1.0×107个细胞/毫升。
上述体外培养的方法：用微量注射器吸取上述人角膜基质细胞悬液，在每个载体支架上均匀注射4-6针，每针1-2微升，置入24孔培养板孔中，然后加入体外构建专用培养液A，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中进行体外培养，每隔24-36小时更换体外构建专用培养液B一次，培养72-120小时后，即得组织工程人角膜基质。
上述体外构建专用培养液A的配方：含有15％小牛血清和0.3‰-0.5‰凝血酸的DMEM/F12培养液。
上述体外构建专用培养液A的配方又添加了0.2‰-0.4‰纤连蛋白。
上述体外构建专用培养液B的配方：含有15％小牛血清和0.3‰-0.5‰凝血酸的DMEM/F12培养液。
上述体外构建专用培养液B的配方又添加了0.1‰-0.5‰ε-氨己酸。
上述载体支架专用复水溶液的配方：含有1％妥布霉素的DMEM/F12培养液。
本发明中的种子细胞来自非转染的人角膜基质细胞系的核型正常且结构功能正常的人角膜基质细胞，该细胞生长状态良好、无任何致瘤风险，可通过连续传代为组织工程人角膜基质的批量体外构建提供出足量的种子细胞；载体支架的制备工艺仅使用物理(低渗、冻融、风干)和酶(DNA-RNA酶)处理，未使用任何有毒的化学试剂和药品，安全性高、抗原性小，复水后的载体支架具有透明性好、结构致密完整、机械性强、与人角膜种子细胞生物相容性好、易于种子细胞附着、迁移和生长、生产成本低等特点，满足了组织工程人角膜基质所用大量载体支架的需要。本发明接种种子细胞采用注射接种法，不仅大大缩短了体外培养的时间，而且较直接接种法能够更好的保持载体支架结构的完整性。
本发明工艺科学合理，所构建出的组织工程人角膜基质在形态结构和透明度上与正常人角膜基质相似，并具有正常角膜基质的功能，移植到新西兰兔、比格犬和猕猴眼中可使其角膜持续保持透明分别150天、820天和750天以上，表明本发明所构建出的组织工程人角膜基质可作为捐献角膜的替代物用于角膜基质异常的修复，因此已可用于批量生产满足对组织工程人角膜基质的高质量需求，且组织工程人角膜基质体外构建的成本低。
具体实施方式
本发明涉及的各种溶液的配制方法：
1、体外构建专用培养液A的配制：取常规配制的DMEM/F12培养液80毫升，加入凝血酸30-50毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入15毫升小牛血清，补加上述的DMEM/F12培养液至100毫升，即为体外构建专用培养液A；
为了提高人角膜基质细胞在载体支架中的附着效果，又将上述培养液的配方上添加了20-40毫克的纤连蛋白；
2、体外构建专用培养液B的配制：取常规配制的DMEM/F12培养液80毫升，加入凝血酸30-50毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入15毫升小牛血清，补加上述的DMEM/F12培养液至100毫升，即为体外构建专用培养液B；
为了提高人角膜基质细胞在载体支架中的附着和迁移效果，又将上述培养液的配方上添加了10-50毫克的ε-氨己酸；
3、载体支架专用复水溶液的配制：取常规配制的DMEM/F12培养液80毫升，加入妥布霉素1克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，补加上述的DMEM/F12培养液至100毫升，即为载体支架专用复水溶液。
本发明的具体实施步骤：
1、人角膜基质种子细胞的制备：取来自非转染、无致瘤性人角膜基质系的核型正常且结构功能正常的人角膜基质细胞，用含15％-20％小牛血清的DMEM/F12培养液在底面积75平方厘米培养瓶中置37℃进行扩增培养，细胞增殖36-48小时至对数生长期后，用玻璃滴管吸出培养液，加入0.25％胰蛋白酶溶液消化1-2分钟，加入此前吸出的旧培养液终止消化，1000-1500转/分离心10-15分钟，细胞沉淀用4毫升体外构建专用培养液A悬浮均匀制成均质的人角膜基质细胞悬液；利用CASY细胞计数仪进行细胞计数后，用上述体外构建专用培养液A调整细胞浓度至5.0×106-1.0×107个细胞/毫升；
2、载体支架的制备：利用载体支架专用复水溶液对载体支架浸泡1-2小时进行复水处理后，再用角膜环钻将复水后的载体支架打成所需大小的圆片；
3、组织工程人角膜基质的体外构建：用微量注射器吸取上述人角膜基质细胞悬液，在每个载体支架上均匀注射4-6针，每针1-2微升；将注射细胞悬液后的载体支架放入24孔培养板中，加入上述体外构建专用培养液A至1毫升，置37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，每隔24-36小时更换体外构建专用培养液B一次，持续培养72-120小时后，即为体外构建出的组织工程人角膜基质。
结合下面的多个实施例进一步阐明本发明：
实施例1
先取常规配制的DMEM/F12培养液80毫升，加入凝血酸30毫克，纤连蛋白20毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入15毫升小牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至100毫升，制成体外构建专用培养液A；
再取人角膜基质细胞，用含15％小牛血清的DMEM/F12培养液在底面积75平方厘米培养瓶中置37℃进行扩增培养，细胞增殖48小时至对数生长期后，用玻璃滴管吸出培养液，加入0.25％胰蛋白酶溶液消化1.5分钟，加入此前吸出的旧培养液终止消化，1500转/分离心10分钟收集细胞沉淀后，用4毫升上述体外构建专用培养液A将上述细胞沉淀悬浮均匀成人角膜基质细胞悬液；利用CASY细胞计数仪进行细胞计数后，用上述体外构建专用培养液A调整细胞浓度至1.0×107个细胞/毫升；
然后取常规配制的DMEM/F12培养液80毫升，加入妥布霉素1克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，补加上述的DMEM/F12培养液至100毫升，即为载体支架专用复水溶液。
再用载体支架专用复水溶液对载体支架浸泡2小时进行复水处理后，再用角膜环钻将复水后的载体支架打成直径6.5毫米的圆片，用微量注射器吸取上述人角膜基质细胞悬液，在每个载体支架上均匀注射6针，每针1微升；然后将注射细胞悬液后的载体支架放入24孔培养板中，加入上述体外构建专用培养液A至1毫升，置37℃、5％二氧化碳培养箱中进行体外培养；
再取常规配制的DMEM/F12培养液80毫升，加入凝血酸30毫克，10毫克的ε-氨己酸，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入15毫升小牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至100毫升，制成体外构建专用培养液B；最后每隔36小时更换一次体外构建专用培养液B，持续培养120小时，即为体外构建的组织工程人角膜基质。
实施例2
先取常规配制的DMEM/F12培养液80毫升，加入凝血酸40毫克，纤连蛋白30毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入15毫升小牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至100毫升，制成体外构建专用培养液A；
再取人角膜基质细胞，用含20％小牛血清的DMEM/F12培养液在底面积75平方厘米培养瓶中置37℃进行扩增培养，细胞增殖36小时至对数生长期后，用玻璃滴管吸出培养液，加入0.25％胰蛋白酶溶液消化2分钟，加入此前吸出的旧培养液终止消化，1000转/分离心15分钟，细胞沉淀用4毫升上述体外构建专用培养液A悬浮均匀制成人角膜基质细胞悬液；利用CASY细胞计数仪进行细胞计数后，用上述体外构建专用培养液A调整细胞浓度至7.0×106个细胞/毫升；
然后取常规配制的DMEM/F12培养液80毫升，加入妥布霉素1克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，补加上述的DMEM/F12培养液至100毫升，即为载体支架专用复水溶液。
再用载体支架专用复水溶液对载体支架浸泡1.5小时进行复水处理后，再用角膜环钻将复水后的载体支架打成直径8.0毫米的圆片，用微量注射器吸取上述人角膜基质细胞悬液，在每个载体支架上均匀注射5针，每针1.5微升；然后将注射细胞悬液后的载体支架放入24孔培养板中，加入上述体外构建专用培养液A至1毫升，置37℃、5％二氧化碳培养箱中进行体外培养；
再取常规配制的DMEM/F12培养液80毫升，加入凝血酸40毫克，30毫克的ε-氨己酸，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入15毫升小牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至100毫升，制成体外构建专用培养液B；最后每隔30小时更换一次体外构建专用培养液B，持续培养96小时，即为体外构建的组织工程人角膜基质。
实施例3
先取常规配制的DMEM/F12培养液80毫升，加入凝血酸50毫克，纤连蛋白40毫克完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入15毫升小牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至100毫升，制成体外构建专用培养液A；
再取人角膜基质细胞，用含15％小牛血清的DMEM/F12培养液在底面积75平方厘米培养瓶中置37℃进行扩增培养，细胞增殖48小时至对数生长期后，用玻璃滴管吸出培养液，加入0.25％胰蛋白酶溶液消化1分钟，加入此前吸出的旧培养液终止消化，1200转/分离心12分钟，细胞沉淀用4毫升上述体外构建专用培养液A悬浮均匀制成人角膜基质细胞悬液；利用CASY细胞计数仪进行细胞计数后，用上述体外构建专用培养液A调整细胞浓度至8.0×106细胞/毫升；
然后取常规配制的DMEM/F12培养液80毫升，加入妥布霉素1克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，补加上述的DMEM/F12培养液至100毫升，即为载体支架专用复水溶液。
再用载体支架专用复水溶液对载体支架浸泡1小时进行复水处理后，再用角膜环钻将复水后的载体支架打成直径9.5毫米的圆片，用微量注射器吸取上述人角膜基质细胞悬液，在每个载体支架上均匀注射4针，每针2微升；然后将注射细胞悬液后的载体支架放入24孔培养板中，加入上述体外构建专用培养液A至1毫升，置37℃、5％二氧化碳培养箱中进行体外培养；
再取常规配制的DMEM/F12培养液80毫升，加入凝血酸50毫克，50毫克的ε-氨己酸，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入15毫升小牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至100毫升，制成体外构建专用培养液B；最后每隔24小时更换一次体外构建专用培养液B，持续培养72小时，即得体外构建的组织工程人角膜基质。
由此可见，利用本发明的方法体外构建的组织工程人角膜基质，可作为人角膜的替代物应用于角膜基质异常的修复，并且容易实现规模化生产。
Claims (10)
1.一种组织工程人角膜基质的体外构建方法，其特征是用组织工程人角膜基质体外构建专用培养液A将人角膜基质细胞制成细胞悬液，再将该细胞悬液注射入经载体支架复水溶液复水后的脱细胞猪角膜基质载体支架中，放置至24孔培养板孔中，加入体外构建专用培养液A后，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中进行体外培养，期间更换体外构建专用培养液B继续培养，即得到组织结构和功能与正常人角膜基质相近的组织工程人角膜基质。
2.如权利要求1所述的组织工程人角膜基质的体外构建方法，其特征是上述人角膜基质细胞悬液的制备方法：先取人角膜基质细胞，用含15％-20％小牛血清的DMEM/F12培养液培养至对数生长期后，再用0.25％胰蛋白酶溶液进行消化、离心收集细胞沉淀，最后再用体外构建专用培养液A重悬细胞沉淀，即得均质的人角膜基质细胞悬液。
3.如权利要求1所述的组织工程人角膜基质的体外构建方法，其特征是上述载体支架的制备方法：首先切取新鲜猪角膜片进行低渗溶胀，在反复冻融破碎细胞后，以DNA-RNA酶处理去除其中的残留核酸物质，然后浸入含质量体积百分比10％-20％右旋糖苷溶液和质量体积百分比0.1％-0.2％核黄素的角膜专用交联剂溶液，先后利用紫外光A照射交联、漂洗、风干和电离辐照灭菌，最后用载体支架复水溶液对载体支架复水后，用角膜环钻制成所需大小的圆形载体支架。
4.如权利要求1所述的组织工程人角膜基质的体外构建方法，其特征是上述体外培养的方法：用微量注射器吸取上述人角膜基质细胞悬液，在每个载体支架上均匀注射4-6针，每针1-2微升，然后加入体外构建专用培养液A，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中进行体外培养，每隔24-36小时更换体外构建专用培养液B一次，培养72-120小时后，即得组织工程人角膜基质。
5.如权利要求1和2所述的组织工程人角膜基质的体外构建方法，其特征是上述体外构建专用培养液A的配方：含有15％小牛血清和0.3‰-0.5‰凝血酸的DMEM/F12培养液。
6.如权利要求1和2所述的组织工程人角膜基质的体外构建方法，其特征是上述体外构建专用培养液A的配方又添加了0.2‰-0.4‰纤连蛋白。
7.如权利要求1和4所述的组织工程人角膜基质的体外构建方法，其特征是上述体外构建专用培养液B的配方：含有15％小牛血清和0.3‰-0.5‰凝血酸的DMEM/F12培养液。
8.如权利要求1和4所述的组织工程人角膜基质的体外构建方法，其特征是上述体外构建专用培养液B的配方又添加了0.1‰-0.5‰ε-氨己酸。
9.如权利要求1和3所述的组织工程人角膜基质的体外构建方法，其特征是上述载体支架复水溶液的配方：含有1％妥布霉素的DMEM/F12培养液。
10.权利要求1所构建的组织工程人角膜基质，其特征是作为捐献人角膜的替代物应用于角膜基质异常的修复。
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