CN111110920B - 生物补片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生物补片，所述生物补片是主要由脱细胞基质组成的片状物。所述脱细胞基质来源于去除血管细胞的脐带组织，所述脱细胞基质主要由所述脐带组织的细胞外基质构成，而细胞外基质中因富含多种生长因子，具有良好的生物活性，能够有效募集接触部位的细胞并为之提供合适的生长结构，诱导细胞定向分化，从而有利于肩袖组织的愈合效果；另外，以去除血管细胞的所述脐带组织作为来源，能够有效降低所述生物补片的免疫原性以提高使用安全性。本发明还提供了所述生物补片的制备方法。

Description

生物补片及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及生物补片及其制备方法。
背景技术
肩袖损伤是骨外科最常见肌腱损伤之一，是导致肩关节疼痛、活动度降低、或功能减弱的常见原因。传统肩袖修补手术的成功率不高，且术后肌腱与骨交界面处不易愈合，因此，开发应用于肩袖修复的医用补片以促进肩袖组织愈合并改善患者的术后功能成为近年来关注的热点。
目前大部分用于肩袖修复的补片的主要组成成分为高分子材料，尽管使用的高分子材料具有一定的生物相容性，但作为惰性材料，因缺乏生物活性，不可避免地会使人体产生排异、侵蚀或瘢痕化等不良反应。
因此，有必要开发一种新型的生物补片以解决现有技术中存在的上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种应用于肩袖修复的生物补片及其制备方法，以具有良好的生物活性和使用安全性，从而有利于肩袖组织的愈合效果。
为实现上述目的，本发明的所述生物补片为片状物，且主要由脱细胞基质组成，所述脱细胞基质来源于去除血管细胞的脐带组织，所述脱细胞基质主要由所述脐带组织的细胞外基质构成。
本发明的所述生物补片的有益效果在于：所述生物补片主要由脱细胞基质组成，所述脱细胞基质主要由所述脐带组织的细胞外基质构成，而细胞外基质中因富含多种生长因子，具有良好的生物活性，能够有效募集接触部位的细胞并为之提供合适的生长结构，诱导细胞定向分化，从而有利于肩袖组织的愈合效果；另外，以去除血管细胞的所述脐带组织作为来源，能够有效降低所述生物补片的免疫原性以提高使用安全性。
优选的，所述生物补片内部呈三维网状结构。
优选的，所述生物补片的含水率不高于10％。其有益效果在于：便于延长贮存时间的同时最大限度保留良好的生物活性。
优选的，所述生物补片的缝合强度不小于1牛顿，拉伸强度不小于0.1兆帕，撕裂强度不小于1牛顿，同一体外降解条件和同一降解时间下所述生物补片的组织残留率与新鲜原始脐带的组织残留率之间的差值为-15％-+15％。
优选的，每毫克所述生物补片中的DNA残留量小于50纳克。
优选的，所述脐带组织来源于人体。
本发明所述生物补片的制备方法包括：提供原始脐带，并对所述原始脐带顺次进行前处理、脱细胞处理、清洗处理、冷冻干燥和灭菌处理，以得到所述生物补片；所述前处理包括：通过机械方式去除所述原始脐带中的血管和血污后进行整形，以形成片状脐带组织；所述脱细胞处理包括：交替使用低渗溶液和高渗溶液对所述片状脐带组织进行振荡处理；所述清洗处理包括：使用等渗溶液去除经所述振荡处理后得到的片状脐带组织中残存的所述低渗溶液和所述高渗溶液中的溶质。
本发明的所述生物补片的制备方法的有益效果在于：通过所述机械方式去除所述血管，有利于有效降低所述生物补片的免疫原性，提高使用安全性；交替使用低渗溶液和高渗溶液对所述片状脐带组织进行振荡处理，能够使细胞膜更容易完全破裂，有利于实现良好的去除细胞效果，并保留细胞外基质成分。
优选的，所述低渗溶液包括第一低渗溶液和第二低渗溶液，所述脱细胞处理的过程中，顺次使用所述第一低渗溶液、所述高渗溶液和所述第二低渗溶液分别进行所述振荡处理，所述第二低渗溶液的浓度高于所述第一低渗溶液的浓度，所述高渗溶液中溶质的质量浓度为1％-3％，所述第二低渗溶液中溶质的质量浓度不高于0.03％。其有益效果在于：使细胞膜更容易完全破裂，有利于实现良好的去除细胞效果，并保留细胞外基质成分。
进一步优选的，所述振荡处理的温度为20-30摄氏度，所述振荡处理的时间不少于12小时。
进一步优选的，所述第一低渗溶液为三羟甲基氨基甲烷水溶液，所述第一低渗溶液的pH值为7.0-8.5，所述第二低渗溶液为十二烷基磺酸钠水溶液，所述高渗溶液为聚乙二醇辛基苯基醚和氯化钾的混合水溶液。
优选的，所述等渗溶液包括等渗缓冲溶液和双蒸水，顺次使用所述等渗缓冲溶液和所述双蒸水对经所述振荡处理后得到的片状脐带组织分别进行反复振荡处理，所述反复振荡处理的次数至少为3，每次所述反复震荡处理的时间不少于15分钟。其有益效果在于：有效去除经所述振荡处理后得到的片状脐带组织中残存的所述低渗溶液和所述高渗溶液中的溶质，提高所述生物补片的使用安全性。
优选的，所述冷冻干燥包括顺次进行的常压预冷冻和真空干燥；所述常压预冷冻包括：在不高于-20摄氏度且不低于-60摄氏度的环境温度下对经所述清洗处理后得到的片状脐带组织进行不少于30分钟的常压冷冻；所述真空干燥的温度不低于-70摄氏度，所述真空干燥的时间不少于24小时。其有益效果在于：有利于最大限度保留生物活性。
优选的，所述灭菌处理包括辐照灭菌，所述辐照灭菌的过程中，将经所述冷冻干燥后得到的产物置于0-10摄氏度的环境温度下进行所述灭菌处理。其有益效果在于：最大限度降低辐照对生物活性的影响。
附图说明
图1a为本发明实施例的生物补片表面的表面形貌照片；
图1b为图1所示的生物补片内部的扫描电镜照片；
图2为本发明实施例的经前处理后得到的片状脐带组织的组织学染色照片；
图3为本发明实施例的完成所述脱细胞处理后得到的片状脐带组织的组织学染色照片；
图4为本发明实施例的生物补片和新鲜原始脐带通过体外降解性能测试得到的组织残留率随降解时间的变化趋势对比图；
图5为本发明实施例的不同生物补片、空白对照、阴性对照以及阳性对照通过体外细胞毒性测试得到的小鼠成纤维细胞的增殖率对比图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
本发明实施例的环形钻头来源于苏州六六视觉科技股份有限公司。
针对现有技术存在的问题，本发明实施例提供了一种生物补片，所述生物补片是主要由脱细胞基质组成的片状物，所述脱细胞基质来源于去除血管细胞的脐带组织，所述脱细胞基质主要由所述脐带组织的细胞外基质构成。由于细胞外基质中因富含多种生长因子，具有良好的生物活性，能够有效募集接触部位的细胞并为之提供合适的生长结构，诱导细胞定向分化，从而有利于肩袖组织的愈合效果。
具体的，所述血管细胞包括动脉血管细胞和静脉血管细胞。
本发明还提供了所述生物补片的制备方法，包括：提供原始脐带，并对所述原始脐带顺次进行前处理、脱细胞处理、清洗处理、冷冻干燥和灭菌处理，以得到所述生物补片。
本发明一些实施例中，所述原始脐带来源于人体，以有利于避免患者产生排异反应。
本发明实施例1-4中，所述原始脐带来源于健康产妇生产的废弃脐带，并就使用方式征得患者本人同意并签署知情同意书。
本发明一些实施例中，所述前处理包括：通过机械方式去除所述原始脐带中的血管和血污后进行整形，以形成片状脐带组织。
通过去除所述血管，有效降低了所述脐带组织的免疫原性，有利于所述生物补片的使用安全性。
本发明一些具体的实施例中，所述前处理具体为：清洗所述原始脐带使直至表面无明显血污后分切成长度为4-6cm小段，沿每一小段的长轴剖开后并通过所述机械方式去除动脉血管和静脉血管，然后将每一小段展开以形成所述片状脐带组织，最后再次清洗所述片状脐带组织，以去除残留的血污。
本发明实施例1-4的所述前处理过程中，使用含1％双抗的1×PBS进行所述清洗。
本发明一些实施例中，所述机械方式包括使用环形钻头去除所述血管。
具体的，根据所述血管的直径选择不同内径的环形钻头以使所述血管剖离，即所述环形钻头为一系列具有不同内径的环形钻头，以适配所述血管的不同部位的直径。
本发明一些具体的实施例中，所述环形钻头的内径为1.5-8.0毫米，厚度不超过0.5毫米，以在剖离所述血管的同时最大限度减少所述脐带组织的损失，以便于后续临床应用中所述生物补片表面的大部分面积能够与待修复的部位良好贴合，有利于加速愈合。
本发明一些具体的实施例中，所述环形钻头为角膜环钻。
本发明一些实施例中，所述低温预处理在0-10摄氏度的环境温度下进行，以利于最大限度保留所述原始脐带的生物活性。
本发明一些实施例中，所述脱细胞处理包括：交替使用低渗溶液和高渗溶液对所述片状脐带组织进行振荡处理，以使细胞膜更容易完全破裂，有利于实现良好的去除细胞效果，并保留细胞外基质成分。
本发明一些实施例中，所述低渗溶液包括第一低渗溶液和第二低渗溶液，所述脱细胞处理的过程中，顺次使用所述第一低渗溶液、所述高渗溶液和所述第二低渗溶液分别进行所述振荡处理，所述第二低渗溶液的浓度高于所述第一低渗溶液的浓度，所述高渗溶液中溶质的质量浓度为1％-3％，所述第二低渗溶液中溶质的质量浓度不高于0.03％。
本发明一些实施例中，所述振荡处理的温度为20-30摄氏度，所述振荡处理的时间不少于12小时。
本发明实施例1-4中，所述第一低渗溶液为三羟甲基氨基甲烷水溶液，即低渗TBS溶液。所述第一低渗溶液的pH值为8，所述第二低渗溶液为十二烷基磺酸钠水溶液，所述高渗溶液为聚乙二醇辛基苯基醚和氯化钾的混合水溶液，即Triton X-100。
本发明一些实施例中，所述第一低渗溶液的pH为7.0-8.5。
本发明实施例1-4中，所述三羟甲基氨基甲烷水溶液的配置方法具体为：称取一定质量的Tris Base，即三羟甲基氨基甲烷，使用超纯水溶解后，用盐酸滴定直至所述三羟甲基氨基甲烷水溶液的pH为8。所述三羟甲基氨基甲烷水溶液室温保存并现配现用。
所述十二烷基磺酸钠水溶液的配置方法具体为：称取一定质量的十二烷基磺酸钠，用双蒸水溶解。所述十二烷基磺酸钠水溶液室温保存并现配现用。
所述聚乙二醇辛基苯基醚和氯化钾的混合水溶液的配置方法具体为：称取一定质量的氯化钾，用超纯水溶解后，再加入一定体积的Triton X-100混合均匀。所述混合水溶液室温保存并现配现用。
本发明实施例1-4的所述脱细胞处理过程中使用的三羟甲基氨基甲烷的质量MTris、十二烷基磺酸钠的质量MSDS，氯化钾的质量MKCl以及配置低渗TBS溶液使用的超纯水的体积Vupw1、配置十二烷基磺酸钠水溶液使用的双蒸水的体积VDSW1、配置聚乙二醇辛基苯基醚和氯化钾的混合水溶液使用的超纯水的体积Vupw2以及Triton X-100的体积VTX请参见表1。
表1
Figure BDA0002400093940000071
Figure BDA0002400093940000081
本发明实施例1-4中，使用所述第一低渗溶液浸没所述片状脐带组织后，置于脱色摇床在室温下进行12小时的振荡；然后将得到的所述片状脐带组织与所述高渗溶液混合，置于脱色摇床在室温下进行24小时的振荡，最后将得到的所述片状脐带组织与所述第二低渗溶液混合，置于脱色摇床在室温下继续进行24小时的振荡，已完成所述脱细胞处理。
本发明一些实施例中，所述清洗处理包括：使用等渗溶液去除经所述振荡处理后得到的片状脐带组织中残存的所述低渗溶液和所述高渗溶液中的溶质。
本发明一些实施例中，所述等渗溶液包括等渗缓冲溶液和双蒸水，顺次使用所述等渗缓冲溶液和所述双蒸水对经所述振荡处理后得到的片状脐带组织分别进行反复振荡处理，所述反复振荡处理的次数至少为3，每次所述反复震荡处理的时间不少于15分钟，以有效去除经所述振荡处理后得到的片状脐带组织中残存的所述低渗溶液和所述高渗溶液中的溶质，提高所述生物补片的使用安全性。
本发明实施例1-4中，所述等渗缓冲液为等渗TBS缓冲液，具体的配置方法为：称取0.619克Tris Base，使用双蒸水定容至100毫升，然后用盐酸滴定至pH为8。
本发明实施例1-4的所述清洗处理具体为：使用所述等渗缓冲液浸没经所述脱细胞处理后得到的片状脐带组织后，置于脱色摇床在室温下进行15分钟的振荡，上述过程重复三次；然后将得到的片状脐带组织浸没于新的所述等渗缓冲液后，置于脱色摇床在室温下进行12小时的振荡；最后将得到的片状脐带组织浸没于双蒸水中后，置于脱色摇床在室温下进行15分钟的振荡，上述过程重复三次。
本发明一些实施例中，所述冷冻干燥包括顺次进行的常压预冷冻和真空干燥。
所述常压预冷冻包括：在不高于-20摄氏度且不低于-60摄氏度的环境温度下对经所述清洗处理后得到的片状脐带组织进行不少于30分钟的常压冷冻；所述真空干燥的温度不低于-70摄氏度，所述真空干燥的时间不少于24小时以有利于最大限度保留生物活性。
本发明实施例1-4中，所述常压预冷冻的时间为30分钟，温度为-20摄氏度，所述真空干燥的时间为24小时。
本发明一些实施例中，经所述冷冻干燥后得到的生物补片的含水率不超过10％，以有利于延长贮存时间并最大限度保留生物活性。
所述含水率通过烘干法测定，具体为将所述生物补片放置于105-110摄氏度的干燥箱中常压干燥至恒重，计算重量的减少量占干燥前的生物补片的质量百分比为含水率。
本发明一些实施例中，所述冷冻干燥结束后，对得到的生物补片进行裁切和内包后再进行所述灭菌处理。
本发明一些实施例中，所述灭菌处理包括辐照灭菌，所述辐照灭菌的过程中，将经所述冷冻干燥后得到的产物置于0-10摄氏度的环境温度下进行所述灭菌处理，以最大限度降低辐照对生物活性的影响。
具体的裁切方法请参见CN105903080，在此不做赘述。
本发明一些实施例中，所述辐照灭菌包括采用辐照剂量为15～30kGy的伽马射线或电子束辐照灭菌，以有效灭活所述生物补片在制备过程中可能携带的各类细菌或病毒，进一步确保使用安全性。
本发明实施例1-4中，辐照剂量为25kGy。
本发明实施例1-4中，每毫克所述生物补片中的DNA残留量MDNA均小于35纳克。所述DNA残留量的测定方法依据行业标准YY/T 0606.25-2014进行测试，其具体数值以及生物补片的含水率W请参见表2。
表2
实施例编号 1 2 3 4
M<sub>DNA</sub>/纳克 31.2 16.3 19.3 26.4
W/％ 4.78 7.42 6.93 5.35
本发明一些实施例中，每毫克所述生物补片中的DNA残留量MDNA均小于50纳克。
图1a为本发明实施例1的生物补片表面的表面形貌照片。图1b为本发明实施例1的生物补片内部的扫描电镜照片，其中扫描电镜照片的放大倍数为500。
参见图1a和图1b，实施例1的生物补片表面结构较平整，内部呈三维网状结构，且孔分布较均匀。
图2为本发明实施例1的所述生物补片的制备过程中，经所述前处理后得到的片状脐带组织的组织学染色照片。图3为本发明实施例1的所述生物补片的制备过程中，完成所述脱细胞处理后得到的片状脐带组织的组织学染色照片。具体的染色方式为苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin Staining)，此为本领域技术人员的常规技术手段，在此不做赘述。
参照图2和图3，所述原始脐带含有如图2所示的富含血管的第一区域21和第二区域22，经所述低温预处理后，血管得到去除，已不存在血管细胞残留。
本发明实施例还分别统计了实施例1的生物补片以及作为原料的新鲜原始脐带中的各类因子，具体为类胰岛素一号增长因子(IGF-1)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)、血小板衍生生长因子(PDFG)以及上皮生长因子(EGF)含量，请参见表3。具体的统计方法为本领域技术人员的常规技术手段，在此不做赘述。含量定义为每克生物补片或新鲜原始脐带中所含有的因子的纳克数。
表3
Figure BDA0002400093940000111
Figure BDA0002400093940000121
从表3中可以看到，所述生物补片与作为原料的新鲜原始脐带中的各类因子含量相差不大，说明本发明制备所述生物补片的方法能最大限度保留所述新鲜原始脐带的生物活性。
本发明实施例考察了实施例1-4的生物补片的力学性能。具体的，依据医药行业标准YY 0500-2004心血管植入物人工血管中8.8部分考察缝合强度；依据GB/T 528-2009硫化橡胶或热塑性橡胶拉伸应力应变性能的考察拉伸强度；依据GB/T 529-2008硫化橡胶或热塑性橡胶撕裂强度的测定(裤形、直角形和新月形试样)部分通过制备A裤型试样考察撕裂强度，具体结果请参见表4。表4中的力学性能数值为3个平行试样的平均值。
表4
实施例编号 缝合强度/牛顿 拉伸强度/兆帕 撕裂强度/牛顿
1 3.21 0.78 1.68
2 2.77 0.69 2.12
3 2.43 0.66 1.88
4 2.34 0.89 1.56
本发明一些实施例中，所述生物补片的缝合强度不小于1牛顿，拉伸强度不小于0.1兆帕，撕裂强度不小于1牛顿。
本发明一些实施例中，所述生物补片的缝合强度不小于2牛顿，拉伸强度不小于0.6兆帕。
本发明实施例以实施例1-4的生物补片以及作为原料的新鲜原始脐带为例，分别考察了体外降解性能。
所述体外降解性能的具体测试方法为：取20-30毫克待测试样品浸泡于37摄氏度的I型胶原酶溶液中降解，在不同的时间取出固态物质进行冷冻干燥并称重，计算组织残留率，所述组织残留率为获得的冻干物占经所述冷冻干燥后的待测试样品的质量百分比。
图4为本发明实施例1的生物补片和新鲜原始脐带通过体外降解性能测试得到的组织残留率随降解时间的变化趋势图。
参照图4，实施例1的生物补片，即图示的测试生物补片的组织残留率随降解时间的变化趋势与作为原料的新鲜原始脐带的组织残留率随降解时间的变化趋势基本一致。同一体外降解条件和同一降解时间下实施例1所述生物补片的组织残留率与新鲜原始脐带的组织残留率之间的差值在-15％-+15％之间。
本发明实施例2-4的生物补片的组织残留量随降解时间的变化趋势与图4中的新鲜原始脐带的组织残留量随降解时间的变化趋势基本一致，所述生物补片的组织残留率与新鲜原始脐带的组织残留率之间的差值在-15％-+15％，在此不做赘述。
本发明实施例还以高密度聚乙烯(High Density Polyethylene，HDPE)为阴性对照，二甲基亚砜DMSO为阳性对照，依据GB/T 16886.5-2003的第5部分：体外细胞毒性试验考察了实施例1-3的生物补片的体外细胞毒性，具体结果请参见图5。其中纵坐标的百分比为小鼠成纤维细胞L929的增殖率。
参照图5，实施例1-3的生物补片、空白对照和阴性对照的L929的增殖率没有显著差异，而阳性对照的L929增殖率明显低于10％，可见实施例1-3的生物补片具有良好的生物相容性。
本发明实施例将实施例1-4的生物补片应用于犬类的肩袖修复。将所述生物补片裁剪为合适的大小后用无菌生理盐水浸泡5-10分钟，以确保所述生物补片实现饱和吸水，然后对实验犬进行肩袖急性损伤以及修复手术。每个实施例的生物补片分别应用于6只实验犬，并分别在修复手术结束后的第4、12、24和52周观察实验犬的存活情况、切口情况和活动情况。所有实验犬具有相同的育龄。实验结果显示：
所有实验犬在修复手术结束后的52周内均存活，切口愈合情况良好且没有出现感染或炎症等排异症状。修复手术结束后的12周至52周内，所有实验犬的肩袖活动基本正常，且肩袖修复的部位没有发生断裂。由此可见，本发明实施例的生物补片具有良好的生物活性。
虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。

Claims (11)

1.一种生物补片的制备方法，所述生物补片应用于肩袖修复，其特征在于，所述生物补片为片状物，且主要由脱细胞基质组成，所述脱细胞基质来源于去除血管细胞的脐带组织，所述脱细胞基质主要由所述脐带组织的细胞外基质构成，所述脐带组织来源于人体，所述生物补片的制备方法包括：
提供原始脐带，并对所述原始脐带顺次进行前处理、脱细胞处理、清洗处理、冷冻干燥和灭菌处理，以得到所述生物补片；
所述前处理包括：通过机械方式去除所述原始脐带中的血管和血污后进行整形，以形成片状脐带组织；
所述机械方式包括使用环形钻头去除所述血管；
所述脱细胞处理包括：交替使用低渗溶液和高渗溶液对所述片状脐带组织进行振荡处理；
所述清洗处理包括：使用等渗溶液去除经所述振荡处理后得到的片状脐带组织中残存的所述低渗溶液和所述高渗溶液中的溶质。
2.根据权利要求1所述的生物补片的制备方法，其特征在于，所述生物补片内部呈三维网状结构。
3.根据权利要求1所述的生物补片的制备方法，其特征在于，所述生物补片的含水率不高于10％。
4.根据权利要求3所述的生物补片的制备方法，其特征在于，所述生物补片的缝合强度不小于1牛顿，拉伸强度不小于0.1兆帕，撕裂强度不小于1牛顿，同一体外降解条件和同一降解时间下所述生物补片的组织残留率与新鲜原始脐带的组织残留率之间的差值为-15％-+15％。
5.根据权利要求3所述的生物补片的制备方法，其特征在于，每毫克所述生物补片中的DNA残留量小于50纳克。
6.根据权利要求1所述的生物补片的制备方法，其特征在于，所述低渗溶液包括第一低渗溶液和第二低渗溶液，所述脱细胞处理的过程中，顺次使用所述第一低渗溶液、所述高渗溶液和所述第二低渗溶液分别进行所述振荡处理，所述第二低渗溶液的浓度高于所述第一低渗溶液的浓度，所述高渗溶液中溶质的质量浓度为1％-3％，所述第二低渗溶液中溶质的质量浓度不高于0.03％。
7.根据权利要求6所述的生物补片的制备方法，其特征在于，所述振荡处理的温度为20-30摄氏度，所述振荡处理的时间不少于12小时。
8.根据权利要求7所述的生物补片的制备方法，其特征在于，所述第一低渗溶液为三羟甲基氨基甲烷水溶液，所述第一低渗溶液的pH值为7.0-8.5，所述第二低渗溶液为十二烷基磺酸钠水溶液，所述高渗溶液为聚乙二醇辛基苯基醚和氯化钾的混合水溶液。
9.根据权利要求1所述的生物补片的制备方法，其特征在于，所述等渗溶液包括等渗缓冲溶液和双蒸水，顺次使用所述等渗缓冲溶液和所述双蒸水对经所述振荡处理后得到的片状脐带组织分别进行反复振荡处理，所述反复振荡处理的次数至少为3，每次所述反复震荡处理的时间不少于15分钟。
10.根据权利要求1所述的生物补片的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥包括顺次进行的常压预冷冻和真空干燥；
所述常压预冷冻包括：在不高于-20摄氏度且不低于-60摄氏度的环境温度下对经所述清洗处理后得到的片状脐带组织进行不少于30分钟的常压冷冻；
所述真空干燥的温度不低于-70摄氏度，所述真空干燥的时间不少于24小时。
11.根据权利要求1所述的生物补片的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理包括辐照灭菌，所述辐照灭菌的过程中，将经所述冷冻干燥后得到的产物置于0-10摄氏度的环境温度下进行所述灭菌处理。
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