CN104524634B - 一种组织修复材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种组织修复材料的制备方法，本发明采用前处理、有机溶剂震荡脱脂、乙醇溶液病毒灭活、高低渗溶液脱细胞、酸或碱液发胀处理、快速冻干和灭菌的步骤完成；所得的组织修复材料厚度增加2~4倍，材料疏松多孔，力学性能和降解性变化小，脱细胞效果更好，具有较高的生物安全性和生物相容性；适宜的厚度和疏松多孔的结构特点，适用于软骨损伤、皮肤软组织缺损及牙龈退缩等修复所需对缺损部位进行填充的损伤修复；动物实验验证，8周后修复区域已无凹陷现象，完全被新生组织取代，且新生组织与自体组织愈合良好，未有分离现象，证明该材料能为细胞增殖和爬行提供充足的三维空间，使修复区域达到良好的整合度和填充度，实现组织的修复与再生。
Description
技术领域
本发明属于组织工程学医用生物材料技术领域，具体涉及一种组织修复材料的制备方法。
背景技术
组织、器官的丧失或功能障碍是人类健康所面对最频繁、最严重的问题之一。据统计，在美国每年有上百万人患有各种组织、器官丧失或功能障碍，每年需要进行手术800万次，年耗资逾400亿美元。近年来，随着组织工程与再生医学的发展，组织、器官的修复治疗有了许多突破，其中异种脱细胞生物膜材料因其独特的天然结构、与组织再生同步的降解性能获得了更多关注。国内外很多研究机构和公司对异种脱细胞生物膜材料进行了多年的基础研究和应用研究，其多年的临床应用也显示了材料安全有效。
在异种材料来源方面，研究较多的包括真皮、小肠粘膜下层、膀胱、腹膜、筋膜、心包膜、心脏瓣膜等。因异种材料本身含有大量细胞、遗传物质、脂肪，直接应用于人体会引发强烈的免疫反应，所以需要经过脱脂、脱细胞、去抗原等处理，最大限度地保留细胞外基质成分，实现其引导组织再生和修复的功能。因此，材料的处理过程对其使用效果具有重要作用。
脱细胞方法包括物理、化学和生物学方法。其中物理方法采用冻融、压力，能够杀死细胞却不能将细胞成分和遗传物质转运出来。化学方法包括1）酸碱法，酸或碱的处理可以导致细胞裂解，引起或催化活性分子的水解降解，达到脱细胞的目的，但酸或碱的长时间作用会对材料产生严重破坏；2）采用高低渗溶液，利用渗透压原理破碎细胞进行脱细胞的方法，被认为是对基质的分子结构破坏最小的脱细胞方法，但其单独作用的效果不彻底，处理后有少量的细胞碎片和DNA残留；3）采用去污剂脱细胞的方法，包括离子型去污剂（如SDS）和非离子型去污剂（如TritonX-100），以及两性离子型去污剂（如CHAPS），去污剂能够溶解细胞膜，将DNA洗脱出来，但去污剂同时破坏和分解了材料中的蛋白质，同时不易清洗，一方面增加成本、造成生产周期过长，另一方面试剂残留会影响材料的安全性和相容性；4）采用有机试剂脱细胞的方法，包括醇类和酮类等的应用。生物学方法主要包括酶和螯合物的应用，其存在破坏材料结构和试剂残留较难清洗的问题。
实践证明，上述方法的单独使用均无法达到理想的脱细胞效果，因此通常选择两种或几种方法联用或混合使用。美国专利US6206931以过氧乙酸-乙醇-水溶液共同作用对猪小肠粘膜下层进行脱细胞处理，对材料的结构影响较小；而本发明人按该文献记载实验，证明采用该方法处理后仍能观察到完整细胞结构的存在，这将会产生潜在的免疫排斥反应和炎症反应风险。美国专利US5387278利用先碱后酸处理，可以达到脱细胞效果，这两种强烈的脱细胞方法长时间的叠加使用，会对材料结构造成不可逆转的破坏，导致材料降解过快、力学性能低，不能达到与组织再生的同步降解，无法应用于临床；此外，该方法在脱细胞之后采用丙酮脱脂、有机试剂脱水干燥，存在有机试剂残留的风险；所以，该方法从工艺放大的可行性和科学性上仍有改进空间。美国TUTOGEN公司的系列产品采用过氧化氢进行脱细胞处理，处理过程会产生大量泡沫，不易于清洗，容易造成试剂残留影响材料的安全性。美国专利US5413798是以稀碱、稀氯化钠、络合剂进行脱细胞，也存在试剂残留的风险，在体内能引起较强的毒性反应。
临床研究发现，在一些外科手术中，当材料厚度较薄，不能充分填充损伤部位高度时，会造成修复部位凹陷或表面凹凸不平，严重影响其修复效果与功能恢复。此外，在临床使用过程中，较薄的材料因复水或吸附组织液后容易皱缩，粘附在手术器材上，给手术操作造成不便。而生物材料的厚度受原材料本身的限制，如心包膜、腹膜、膀胱膜等材料厚度仅为0.1~0.4mm；为弥补此缺陷，一般采用生物材料叠加或复合其他材料的方式增加厚度，这样不可避免地造成成本增加和产量下降，还带来使用过程中出现材料分层的风险，影响组织的恢复效果。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种组织修复材料的制备方法，使所得的组织修复材料脱细胞彻底、无完整细胞结构和细胞碎片的残留、DNA残留和试剂残留风险低，厚度增加2~4倍，具有较好的力学性能和抗降解性，可以满足临床应用的要求。
本发明提出的组织修复材料的制备方法，包括前处理、脱脂、病毒灭活、脱细胞、材料发胀、冻干和灭菌的步骤，具体包括：
步骤一、前处理：将哺乳动物来源的膜组织平铺于平板，去除附着脂肪、***及边缘破损组织，之后水洗至无血色，得到生物膜材料；所述的哺乳动物包括猪、牛、羊的任一种；所述的膜组织包括膀胱基质膜、腹膜、筋膜、心包膜、心脏瓣膜中的任一种；
步骤二、脱脂：将所得生物膜材料置于有机溶剂中震荡脱脂2~10h之后换液，重复脱脂2~4次；水洗至无气味；所述有机溶剂为丙酮、异丙醇、甲醇与氯仿混合液、正己烷、乙酸乙酯、乙醇或石油醚的任一种；其中甲醇与氯仿混合液的体积比1︰0.25~4。
其中，采用有机溶剂脱脂处理，并放在整个工艺较前的位置，经后续处理和多次清洗，可以最大限度地去除有机溶剂残留，保证材料的安全性。
步骤三、消毒：将脱脂后的生物膜材料置于体积浓度70~75%的乙醇溶液中浸泡至少2h，达到杀菌消毒效果，水洗至无醇味；
步骤四、脱细胞：将消毒后的生物膜材料置于脱细胞高渗溶液中震荡10~60min，再转入脱细胞低渗溶液中震荡10~60min，如此反复2~5次；其中，脱细胞高渗溶液是在0.5~5M的NaCl溶液中加有0.01~0.5M的HCl或0.05~1M的NaOH；脱细胞低渗溶液为水；
本发明采用渗透压原理，在高渗处理时细胞发生缩水，能洗脱DNA，低渗处理时细胞吸水，可以破裂细胞。但是高低渗作用只是利用物理的溶胀和皱缩作用进行脱细胞，在细胞破碎后仍有一些遗传物质DNA、细胞碎片粘附在材料内部，较难洗脱，因此脱细胞效果欠佳（见附图1）。而在高渗溶液中加入酸或碱，可以催化活性因子的降解，破坏水解遗传物质DNA，加速洗脱，提高脱细胞效率（见附图2）。
本发明人将胰酶、SDS、过氧乙酸-乙醇-水溶液、酸碱处理几种脱细胞方法与本发明方法进行对比，评价项目包括材料的脱细胞效果，材料表面结构，力学性能，降解性等。结果显示，过氧乙酸工艺处理之后材料组织学切片中可以观察到完整细胞结构，在琼脂糖凝胶电泳中观察到DNA条带较亮，说明DNA残留较高，脱细胞效果不好（见图3），而本发明方法处理后的生物膜材料在显微镜下观察不存在完整细胞结构和细胞碎片，琼脂糖凝胶电泳图显示无明亮DNA条带（见图2），说明脱细胞彻底；扫描电镜结果显示胰酶工艺处理之后材料表面的部分纤维被溶解，说明其表面结构受到破坏（见图4）；通过拉伸强度、缝线撕裂力和体外Ⅰ型胶原酶降解结果显示，胰酶、SDS和酸碱处理后的材料力学性能较差、降解较快，而本发明处理的材料力学性能和降解性与原材料相差不大，说明本发明对材料的结构组成和性能影响较小（见图5和6）。通过对材料脱细胞效果，材料表面结构，力学性能，降解性的对比可以看出，本发明在保证彻底脱细胞的同时能够最大限度地降低对材料组成、结构及性能的影响，是一种温和有效的脱细胞方法。
步骤五、发胀处理：将脱去细胞的生物膜材料在发胀溶液中浸泡5~60min，水洗至中性；所述发胀溶液是指盐酸、过氧乙酸、磷酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、或氨水的任一种溶液，浓度为0.2~1M；
所述的浸泡可以采用两种方式实现：一是将材料全部浸没于发胀溶液中；二是将材料平铺，一面接触溶液，另一面暴露于空气，若材料具有疏松和致密的双面结构，则将疏松面接触溶液，致密面暴露于空气。
本发明人研究证实，采用酸或碱溶液浸泡处理可以改变材料中胶原分子的带电属性，使胶原分子之间产生静电排斥作用，引起生物膜材料组织结构膨胀疏松、孔径与孔隙率以及厚度的增大；由对比结果可以看出（见图7），材料厚度由原来的0.1~0.4mm增加到0.4~1mm。而采用单面浸泡的方法，尤其是对具有双面结构的生物膜材料，可以使浸泡溶液的一面结构更加疏松，利于细胞的贴附与增殖分化，另一面则保持原有的致密结构；通过单面浸泡处理可以增加疏松面和致密面的结构差异，提高材料引导细胞的长入和组织再生以及屏障作用的效果。
步骤六、冻干、灭菌：将步骤五得到的生物膜材料展平，贴于平板上，直接放入冻干机、或是在平板上加水覆盖材料表面后再放入冻干机；冻干是以5℃~12℃/min的速率降温至-80℃~-20℃，在-10℃条件下保持10h，完成冻干后进行裁切、包装，采用环氧乙烷或钴60辐照灭菌，得到组织修复材料。
相比晾干和真空加热干燥，冻干可以保持材料的疏松结构和多孔性质。其中在材料表面加水覆盖是使材料充分吸水、保持胶原纤维处于松散状态，冻干后水分去除而材料结构依然疏松，厚度增大（见附图8）；适用于对材料厚度要求更高的组织修复，有利于引导细胞的迁入和组织再生；材料快速预冻能避免形成的冰晶过大而扯断材料纤维、破坏内部结构，影响材料性能。
本发明方法与现有技术相比，具有以下优点：
（1）实验证明，采用酸或碱溶液浸泡，使材料厚度增加2~4倍，所制备材料在手术中充分发挥填充缺损的作用，填充完整并与组织愈合良好，保证修复区域不形成凹陷，并避免在材料复水后易粘附手术器械、方便使用；与现有的复层增加厚度方法相比，不会在修复过程中或术后出现材料分层而影响组织再生和修复的情况。
（2）经冻干能保证材料的疏松多孔，快速冻干能避免较大结晶破坏材料内部的纤维结构；而冻干时在材料表面加水覆盖，可以使冻干的材料纤维处于松散状态，结构更为疏松；通过对材料的单面浸泡使浸泡一面的结构疏松、另一面的致密结构不被破坏，从而保证疏松面引导组织再生、致密面防止细胞流失的功能。
（3）把有机溶剂脱脂步骤置于脱细胞处理之前，可以在经过后续的多个环节处理及清洗，最大限度地降低有机溶剂残留的风险，使制备的材料具有较高的生物安全性和生物相容性。
（4）在高渗溶液中加入酸或碱对生物膜材料进行脱细胞处理，与过氧乙酸工艺相比，本发明脱细胞效果更好；与胰酶、SDS以及酸碱工艺相比，处理后材料的力学性能和降解性变化较小，证明本发明对材料的破坏程度低；本发明制备的材料脱细胞彻底，具有较低的免疫原性，结构性能未受到太大影响，保证了材料的安全可靠。
本发明制备的组织修复材料，具有适宜的厚度和疏松多孔的结构特点，适用于软骨损伤、皮肤软组织缺损及牙龈退缩等修复所需对缺损部位进行填充的损伤修复。经动物实验验证，8周后取材证实，修复区域已无凹陷现象，完全被新生组织取代，且新生组织与自体组织愈合良好，未发生分离现象。说明本发明所制备的组织修复材料能够为细胞增殖和爬行提供充足的三维空间，使修复区域达到良好的整合度和填充度，实现组织的修复与再生。
附图说明
附图1为采用高低渗方法脱细胞处理后材料的组织学切片与DNA琼脂糖凝胶电泳照片；图中A为组织学切片的显微照片，可以看出材料内部无完整细胞结构，但仍有细胞碎片残留，说明脱细胞不彻底；图中B为DNA琼脂糖凝胶电泳照片，可以看出DNA条带清晰明显，证明材料中有DNA残留，遗传物质去除不彻底。
附图2为本发明中脱细胞处理后的材料组织学切片和DNA琼脂糖凝胶电泳照片；图中A为组织学切片显微照片，可以看出材料中无完整细胞结构，也没有细胞碎片残留，说明脱细胞彻底；图中B为DNA琼脂糖凝胶电泳照片，可以看出无明显DNA条带，说明材料中DNA残留较低。
附图3为采用过氧乙酸工艺脱细胞处理材料的组织学切片和DNA琼脂糖凝胶电泳照片；图中A为组织学切片显微照片，可以看出材料中有完整的细胞存在，说明脱细胞不彻底；图中B为DNA琼脂糖凝胶电泳照片，可看出DNA条带清晰明显，说明材料中DNA残留较高，该方法脱细胞效果差。
附图4为采用胰酶工艺处理材料的表面扫描电镜照片，可以看出材料表面的部分纤维被溶解，结构被破坏。
附图5为采用胰酶工艺、SDS工艺、酸碱工艺及本发明分别处理后材料与原材料力学性能的对比图；其中A图为拉伸强度对比图，B图为缝线撕裂力对比图；可以看出，相比原材料，采用胰酶工艺、SDS工艺及酸碱工艺处理材料的力学性能都有所下降，而本发明处理的材料力学性能与原材料相差不大，说明与现有技术相比，采用本发明处理对材料的力学性能影响较小。
附图6为采用胰酶工艺、SDS工艺、酸碱工艺及本发明分别处理后材料与原材料降解性的对比图；可以看出，相比原材料，采用胰酶工艺、SDS工艺及酸碱工艺处理的材料降解较快，而本发明处理的材料降解速率与原材料相近，说明与现有技术相比，采用本发明处理对材料的降解性能影响较小。
附图7为本发明中发胀（碱）处理前后材料的厚度变化示意图；显示出经发胀处理后材料厚度明显增大，说明碱浸泡对材料厚度有明显作用。
附图8为本发明冻干处理中加水覆盖与未加水覆盖的材料厚度对比示意图；可以看出，加水覆盖的材料厚度明显提高，说明加水覆盖可使材料吸水、纤维处于松散状态，冻干的材料更加疏松、厚度更大。
附图9为采用猪腹膜材料经本发明各步骤处理后材料厚度的变化曲线；可以看出，经本发明处理后材料的厚度明显提高，其中碱浸泡步骤在材料厚度增加中起到重要作用。
附图10为采用猪腹膜材料经本发明碱浸泡处理前后的力学强度和降解性变化的对比图；其中A图为拉伸强度和缝线撕裂力变化的对比，可以看出，材料的缝线撕裂力未发生明显变化，而拉伸强度有所降低是由材料厚度增大引起，说明碱浸泡对材料力学性能影响不大；B图为材料降解性变化的对比，可以看出，降解性未发生明显变化，说明碱浸泡对材料降解性影响不大。
附图11为采用未经碱浸泡处理制备的组织修复材料进行猪软骨损伤修复8周的动物实验照片；其中A图为大体照片，可看出修复区域存在凹陷，未实现修复表面的光滑平整；B图为组织学切片显微照片，可看出修复区域未与自体软骨组织平齐，说明修复材料太薄，不能实现缺损区域的完全填充。
附图12为采用现有技术制备的复层组织修复材料进行猪软骨损伤修复8周的动物实验照片；其中A图为大体照片，可看出修复区域仍存在凹陷，没有实现缺损区域的完全填充；B图为组织学切片显微照片，可看出修复区域出现断层，新生组织之间以及新生组织与自体组织之间愈合不佳，说明在软骨修复中随着细胞的长入和组织的再生，复层材料出现分层，影响了软骨组织的修复与整合效果。
附图13为采用本发明制备的组织修复材料进行猪软骨损伤修复8周的动物实验照片；其中A图为大体照片，可以看出修复表面光滑平整，色泽与自体组织相近，缺损面被完全填充；B图为组织学切片显微照片，可以看出新生组织与自体组织表面平齐，新生组织内部以及新生组织与自体组织之间整合良好，组织间未有断层现象。说明本发明制备的组织修复材料可以引导软骨组织再生，实现软骨组织的修复。
具体实施方式
以下结合实例详细说明本发明技术方案的具体实施方式。实例中所采用的膜组织购买于陕西石羊集团蒲城畜牧发展有限公司屠宰场的新鲜废弃料。
实施例 1 、以猪腹膜为原料制备组织修复材料
步骤一、前处理：将猪腹膜平铺于平板上，撕除大片脂肪后，去除残余的脂肪和***，以水清洗至无血色，得猪腹膜材料；
步骤二、脱脂：将所得膜材料置于甲醇与氯仿混合液（体积比1︰2）中，震荡脱脂10h后换液，重复脱脂3次，用水清洗至无味；
步骤三、消毒：将脱脂后的膜材料置于体积浓度为75%的乙醇溶液中浸泡3h，用水清洗至无味；
步骤四、脱细胞：将消毒后的膜材料置于含3M 的NaCl和0.25 M 的NaOH的脱细胞高渗溶液中，震荡30min后，转入水中震荡30min，如此反复5次完成脱细胞；
步骤五、发胀处理：将脱去细胞的膜材料疏松面向下平铺于0.5M的 KOH溶液表面，保持5min后，用水清洗至中性；
步骤六、冻干、灭菌：将步骤五得到的膜材料展平铺于不锈钢板上，在钢板上加水覆盖至刚刚浸没材料表面，之后将钢板连同材料放入冻干机内，以5℃/min的速率降温至-20℃，在-10℃下保持10小时完成冻干；再将膜材料裁切、包装后，经Co 60辐照灭菌。
本实例以猪腹膜为原材料，脂肪含量较高，因此工艺中采用较长时间和较多次数的脱脂处理，以达到更好的效果；另外，猪腹膜本身具有疏松面和致密面的结构特点，采用单面发胀处理，可使组织修复材料厚度增加至原材料厚度的3倍左右（见图9）；同时，由于采用覆盖水层冻干，可使材料疏松面更加疏松多孔，为细胞增殖分化提供充足的三维空间，而致密面结构不受影响，可以发挥屏障作用，避免细胞流失，因此更适用于修复软骨损伤。猪软骨损伤修复动物实验结果显示，该组织修复材料所修复的软骨表面光滑平整，新生软骨组织未出现断层现象，且与自体组织愈合良好，实现了缺损组织的再生，促进了关节的功能恢复（见图13）。
实施例 2 、以羊膀胱基质膜为原料制备组织修复材料
步骤一、前处理：将羊膀胱平铺于平板上，分离基质膜，以水清洗至无血色，得羊膀胱基质膜材料；
步骤二、脱脂：将所得膜材料置于丙酮中，震荡脱脂2h后换液，继续震荡脱脂4h后，用水清洗至无味；
步骤三、消毒：将脱脂后的膜材料置于体积浓度为75%的乙醇溶液中浸泡2h，用水清洗至无味；
步骤四、脱细胞：将消毒后的膜材料置于含1M的NaCl和0.2M的HCl的脱细胞高渗溶液中，震荡15min后，转入水中震荡15min，如此反复3次完成脱细胞；
步骤五、发胀处理：将脱去细胞的膜材料用1M的NaOH溶液浸泡1h后，用水清洗至中性；
步骤六、冻干和灭菌：将步骤五得到的膜材料展平铺于玻璃板上，放入冻干机内，以7℃/min的速率降温至-40℃，在-10℃下保持10h完成冻干；进行裁切、包装，采用环氧乙烷灭菌。
羊组织基质膜与腹膜相比厚度较薄，因此采用温和的脱细胞处理方法。由于羊源性的组织存在朊病毒的风险，发胀处理中对整个膜材料采用1M
NaOH浸泡，在增加材料厚度的同时可以降低材料的病毒风险，且材料结构更为均一。所制备的组织修复材料脱细胞彻底、免疫原性低、厚度均匀，适用于皮肤软组织缺损及损伤的修复，可以使再生皮肤的表面光滑无凹凸，实现功能恢复的同时也最大程度地恢复美观。
实施例 3 、以牛心包膜为原料制备组织修复材料
步骤一、前处理：将牛心包膜平铺于平板上，撕除其上大片脂肪，去除残余脂肪和***，以水清洗至无血色，得牛心包膜材料；
步骤二、脱脂：将所得膜材料置于异丙醇中，震荡脱脂4h后换液，如此再反复震荡脱脂两次，时间分别为10h和4h，用水清洗至无味；
步骤三、消毒：将脱脂后的膜材料置于体积浓度为70%的乙醇溶液中浸泡4h，用水清洗至无味；
步骤四、脱细胞：将消毒后的膜材料置于含5M的NaCl和1M的NaOH的脱细胞高渗溶液中，震荡1h后，转入水中震荡20min，如此反复2次完成脱细胞；
步骤五、发胀处理：将脱去细胞的膜材料疏松面向下平铺于0.2M的HCl溶液表面，保持15min后，用水清洗至中性；
步骤六、冻干和灭菌：将步骤五得到的膜材料展平铺于聚四氟乙烯板上，放入冻干机内，以12℃/min的速率降温至-80℃，在-10℃下保持10小时完成冻干；再将膜材料裁切、包装，采用Co 60辐照灭菌。
本实例以牛心包膜为原材料，较实例2中的膜材料厚，因此采用较高的试剂浓度和较长处理时间，以达到彻底的脱细胞效果；此外，牛源性组织同样存在朊病毒的风险，本实例在脱细胞过程中加入了1M的NaOH溶液，在提高脱细胞效率的同时发挥了病毒灭活的作用。本实例采用单面发胀的工艺处理即可满足牙龈退缩修复对材料厚度的要求，材料致密面为组织内部长入细胞和新生的组织提供屏障功能，使其免受口腔环境的侵蚀和机械破坏，经动物实验证明，牙龈修复区域填充度和覆盖度良好，牙龈高度具有明显提升。
Claims (3)
1.一种组织修复材料的制备方法，包括前处理、脱脂、病毒灭活、脱细胞、发胀处理、冻干和灭菌的步骤，具体包括：
步骤一、前处理：将哺乳动物的膜组织平铺于平板，去除附着脂肪、***及边缘破损组织，之后水洗至无血色，得到生物膜材料；所述的哺乳动物包括猪、牛、或羊的任一种；所述的膜组织包括膀胱基质膜、腹膜、筋膜、心包膜、或心脏瓣膜的任一种；
步骤二、脱脂：将所得生物膜材料置于有机溶剂中震荡脱脂2~10h之后换液，重复脱脂2~4次；水洗至无气味；
步骤三、消毒：将脱脂后的生物膜材料置于体积浓度70~75%的乙醇溶液中浸泡至少2h，再水洗至无醇味；
步骤四、脱细胞：将消毒后的生物膜材料置于脱细胞高渗溶液中震荡10~60min，再转入脱细胞低渗溶液中震荡10~60min，如此反复2~5次；其中，脱细胞高渗溶液是在0.5~5M的NaCl溶液中加入0.01~0.5M的HCl或0.05~1M的NaOH；脱细胞低渗溶液为水；
步骤五、发胀处理：将脱去细胞的生物膜材料在发胀溶液中浸泡5~60min，水洗至中性；所述的发胀溶液是指盐酸、过氧乙酸、磷酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、或氨水的任一种溶液，浓度为0.2~1M；
步骤六、冻干、灭菌：将步骤五得到的生物膜材料展平，贴于平板上，直接放入冻干机、或是在平板上加水覆盖材料表面后再放入冻干机；冻干是以5℃~12℃/min的速率降温至-80℃~-20℃，在-10℃下保持10h；完成冻干后进行裁切、包装，采用环氧乙烷或钴60辐照灭菌，得到组织修复材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中所述的有机溶剂为丙酮、异丙醇、甲醇与氯仿混合液、正己烷、乙酸乙酯、乙醇或石油醚的任一种；其中甲醇与氯仿混合液的体积比1:0.25~4。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤五中所述的浸泡是将材料全部浸没于发胀溶液中，或是将材料平铺，疏松面接触溶液，致密面暴露于空气。
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