CN111088349B

CN111088349B - Kir3dl1基因分型引物组及其应用

Info

Publication number: CN111088349B
Application number: CN202010093263.7A
Authority: CN
Inventors: 甄建新; 熊礼宽
Original assignee: SHENZHEN BAOAN MATERNAL AND CHILD HEALTH HOSPITAL
Current assignee: SHENZHEN BAOAN MATERNAL AND CHILD HEALTH HOSPITAL
Priority date: 2020-02-14
Filing date: 2020-02-14
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2040-02-14
Also published as: CN111088349A

Abstract

本发明提供一种KIR3DL1基因分型引物组及其应用。该KIR3DL1基因分型引物组包括高表达型KIR3DL1*h等位基因特异性引物对；低表达型KIR3DL1*l等位基因特异性引物对和通用型KIR3DL1基因特异性引物对。基于最新的国际数据库IPD‑KIR Database公布的147个KIR3DL1等位基因，针对所有高表达型KIR3DL1*h、低表达型KIR3DL1*l等位基因以及所有的KIR3DL1等位基因各自设计一对特异性引物，使其能够通过更少的检测将所有的等位基因完全区分开。同时，特异性引物的特异性扩增片段均小于1kb，在反应时延伸时间仅需要1min左右，耗时更短，更适合临床上检测“快省好”的要求。

Description

KIR3DL1基因分型引物组及其应用

技术领域

本发明涉及基因分型检测技术领域，尤其是涉及一种 KIR3DL1基因分型引物组及其应用。

背景技术

自然杀伤（Natural killer，NK）细胞是固有免疫***的重要组成部分，是机体在病毒感染和肿瘤发生初期的第一道防御屏障。NK细胞在发育过程中可通过其表面抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体（Killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR）接受正常细胞HLA Ⅰ类分子介导的“教育”以获得功能成熟。KIR基因家族包括有14个功能性基因和2个假基因。位于19号染色体短臂（19q13.4）LRC区的 KIR3DL1基因是KIR基因家族的成员之一。KIR3DL1与携带Bw4结构域的HLA-A或HLA-B分子（HLA-Bw4）配位，传递强抑制信号，正常情况下抑制NK细胞的活性。

KIR3DL1基因具有丰富的等位基因多态性，不同等位基因的表达水平和功能也存在差异。截止2018年11月，IPD-KIR Database公布了147个 KIR3DL1等位基因，编码91种蛋白质分子。根据蛋白质表达水平， KIR3DL1等位基因分为高表达型 KIR3DL1*h（如： KIR3DL1*001、*002、*008、*009、*015和*020）、低表达型 KIR3DL1*l（如： KIR3DL1*005和*007）和不表达型 KIR3DL1*null（如： KIR3DL1*004和*019）。已有研究者发现在配体 HLA-B*57基因存在的情况下，高表达型 KIR3DL1*h等位基因能有效控制血清HIV病毒载量和延缓AIDS的病程进程。

目前，在 KIR3DL1基因的分型过程中，对于同一表达型的多种等位基因往往需要设计多种引物才能完全区分，在实际的使用过程中操作复杂。因此，有必要提供一种操作简易的 KIR3DL1基因分型引物组。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种 KIR3DL1基因分型引物组及其应用。

第一方面，本发明的一个实施例提供了一种 KIR3DL1基因分型引物组，包括如下引物对：

高表达型 KIR3DL1*h等位基因特异性引物对：

KIR3DL1*h-PCR-SSP-F：5′-AACAAAAAAAGTAAGTCTCACGG-3′（SEQ ID No.1），

KIR3DL1*h-PCR-SSP-R：5′-GAGGAGCMCCTACCTCGCTGTTG-3′（SEQ ID No.2）；

低表达型 KIR3DL1*l等位基因特异性引物对：

KIR3DL1*l-PCR-SSP-F：5′-AACAAAAAAAGTAAGTCTCACGC-3′（SEQ ID No.3），

KIR3DL1*l-PCR-SSP-R：5′-GATGCCCTAAGATGMAGACTCAC-3′（SEQ ID No.4）；

通用型 KIR3DL1基因特异性引物对：

KIR3DL1-PCR-SSP-F：5′-CAGCTCAGGTATGAGGGGAGCT-3′（SEQ ID No.5），

KIR3DL1-PCR-SSP-R：5′-GGCTGAGAGAGAAGGTTTCTCATAT-3′（SEQ ID No.6）。

其中，高表达型 KIR3DL1*h等位基因特异性引物对的上游引物（ KIR3DL1*h-PCR-SSP-F）位于 KIR3DL1基因组nt12956-nt12978，下游引物（ KIR3DL1*h-PCR-SSP-R）位于 KIR3DL1基因组nt13471-nt13493，扩增目的片段长度为538bp；低表达型 KIR3DL1*l等位基因特异性引物对的上游引物（ KIR3DL1*l-PCR-SSP-F）位于 KIR3DL1基因组nt12956-nt12978，下游引物（ KIR3DL1*l-PCR-SSP-R）位于 KIR3DL1基因组nt13877-nt13899，扩增目的片段长度944bp；通用型 KIR3DL1基因特异性引物对的上游引物（ KIR3DL1-PCR-SSP-F）位于 KIR3DL1基因组nt4996-nt5017，下游引物（ KIR3DL1-PCR-SSP-R）位于 KIR3DL1基因组nt5069-nt5093，扩增目的片段长度98bp。

本发明实施例的 KIR3DL1基因分型试剂盒至少具有如下有益效果：

基于最新的国际数据库IPD-KIR Database公布的147个 KIR3DL1等位基因，针对所有高表达型 KIR3DL1*h、低表达型 KIR3DL1*l等位基因以及所有的 KIR3DL1等位基因各自设计一对特异性引物，以更少的引物完成更全面的检测将所有的等位基因完全区分开。同时，特异性引物的特异性扩增片段均小于1kb，在反应时延伸时间仅需要1min左右，耗时更短，更适合临床上检测“快省好”的要求。

第二方面，本发明的一个实施例提供了一种上述 KIR3DL1基因分型引物组在制备 KIR3DL1基因分型试剂中的应用。基于上述引物组进行分型试剂的制备，得到的 KIR3DL1基因分型试剂能够快速准确地完成该基因的分型工作，节约检测时间。

第三方面，本发明的一个实施例提供了一种 KIR3DL1基因分型试剂盒，该试剂盒包括上述的 KIR3DL1基因分型引物组。基于前述 KIR3DL1基因分型引物组得到的 KIR3DL1基因分型试剂盒能够以较少的检测量完成较为全面的检测工作，相比于现有技术中仅针对特定的几个不同表达型的等位基因设计得到的分型试剂盒，能够更加准确地检测出可能的基因分型，覆盖更加全面。同时，这些引物组可以在相同的反应体系和反应参数下进行反应，从而实现同步扩增，达到省时省力的目标。

根据本发明的一些实施例的 KIR3DL1基因分型试剂盒，还包括dNTPs、DNA聚合酶、PCR缓冲液。其中，DNA聚合酶可以是本领域任选的具有一定耐热性和保真性的DNA聚合酶，例如，可以是Taq DNA聚合酶。PCR缓冲液中可以是已添加有Mg²⁺离子的缓冲液，也可以是不含Mg²⁺离子的缓冲液。当缓冲液中不含Mg²⁺离子时，需在反应时另外添加额外的Mg²⁺离子以保证扩增的进行。

第四方面，本发明的一个实施例提供了一种上述 KIR3DL1基因分型引物组，或上述 KIR3DL1基因分型试剂盒在非诊断目的的 KIR3DL1基因分型中的应用。其中，该非诊断目的的 KIR3DL1基因分型可以是包括但不限于诸如对 KIR3DL1基因的群体遗传学等进行的基础或应用研究。

第五方面，本发明的一个实施例提供了一种 KIR3DL1基因的快速分型方法，该快速分型方法包括以下步骤：

S1、提取待测样本的DNA；

S2、以待测样本的DNA为模板，使用前述 KIR3DL1基因分型引物组作为扩增引物进行PCR扩增；

S3、根据扩增产物确定分型结果；

该快速分型方法适用于非诊断目的。

通过上述方法对 KIR3DL1基因进行分型，其中的三对引物分别针对所有高表达型 KIR3DL1*h、低表达型 KIR3DL1*l等位基因以及所有的 KIR3DL1等位基因而设计，相对于现有技术能够以更少的反应完成更全面的检测。同时，这些引物组可以在相同的反应体系和反应参数下进行反应，实现同步扩增。而且，特异性扩增片段均小于1kb，在反应时延伸时间仅需要1min左右，耗时更短，更适合临床上检测“快省好”的要求。

根据本发明的一些实施例的快速分型方法，S3中确定分型结果的方法为：凝胶电泳检测所述扩增产物，判断特异性PCR产物条带，确定所述待测样本的DNA的基因型。具体方法如下：出现长度为98bp的扩增目的片段时，表示待测样本的DNA包含 KIR3DL1基因；出现长度为538bp的扩增目的片段时，表示待测样本携带高表达型 KIR3DL1*h等位基因；出现长度为944bp的扩增目的片段时，表示待测样本携带低表达型 KIR3DL1*l等位基因。本方法所使用的引物组基于PCR-SSP技术设计，因此，在根据扩增产物判断分型结果时，可以将其染色后在琼脂糖凝胶中电泳，对照分子标记，观察各个特异性PCR产物条带的有无和大小，从而判定待测DNA所属被检对象的 KIR3DL1基因型。

根据本发明的一些实施例的快速分型方法，S2中PCR扩增的程序为：95℃，4min；95℃，30s，68℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min。通过上述循环参数的设置，使PCR扩增过程能够更为高效地进行。

根据本发明的一些实施例的快速分型方法，S2中PCR的反应体系如下：

10×PCR Buffer1.0μL；

2.5mM的dNTP0.8μL；

5mM的Mg²⁺3.0μL；

10μM的PCR引物各0.4μL；

30~100ng/μL的待测DNA1.0μL；

5U/μL的Taq DNA聚合酶0.1μL；

ddH₂O补至10.0μL。

以上述反应体系进行PCR扩增，可以有效保持PCR的反应效率，使扩增反应能够以较为高效的方式进行，提高扩增产物的量。

附图说明

图1是本发明的一个实施例的8例中国汉族健康个体基于PCR-SSP技术的高/低表达型 KIR3DL1基因快速分型的琼脂糖凝胶电泳效果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例对8例中国汉族健康个体进行基于PCR-SSP技术的高/低表达型 KIR3DL1基因快速分型。该分型方法包括以下步骤：

（1）抽提8例中国汉族健康个体的外周血于抗凝管中，提取基因组DNA为待测DNA。

（2）以 KIR3DL1基因分型引物组对8例待测DNA进行特异性PCR扩增反应，所采用的 KIR3DL1基因分型引物组如下表所示：

表1.引物组信息

其中，PCR扩增反应的体系组成为：

所有的PCR扩增反应都可以在同一循环参数下进行同步扩增，扩增过程中采用的循环参数为：

六条PCR引物序列委托Invitrogen公司合成。扩增酶采用宝生物工程（大连）有限公司生产的Takara TaqTM高保真酶，保证序列的准确性。

（3）各取2μL的PCR扩增产物，经核酸染料染色，于2％琼脂糖凝胶中电泳，对照TakaraDL2000DNA分子标记，在凝胶成像***中观察各特异性PCR产物条带的有无和大小，以判定被检对象待测DNA的 KIR3DL1基因型，具体方法如下：

出现长度为98bp的扩增目的片段时，表示待测样本包含 KIR3DL1基因；

出现长度为538bp的扩增目的片段时，表示待测样本携带高表达型 KIR3DL1*h等位基因；

出现长度为944bp的扩增目的片段时，表示待测样本携带低表达型 KIR3DL1*l等位基因。

结果如图1所示，图1是本发明的一个实施例的8例中国汉族健康个体基于PCR-SSP技术的高/低表达型 KIR3DL1基因快速分型的琼脂糖凝胶电泳效果图。可以看到，1号、2号和4号样本携带高表达型 KIR3DL1*h等位基因，3号样本携带低表达型 KIR3DL1*l等位基因，5号、6号、7号和8号样本携带高表达型 KIR3DL1*h和低表达型 KIR3DL1*l等位基因。图中M为购自Takara公司的DL2000 DNA Marker。

实施例2

基因分型结果比较

分别以一代测序技术和实施例1中的方法鉴定200例中国汉族健康个体的 KIR3DL1基因型。其中，基于一代测序技术鉴定 KIR3DL1基因型的方法参考中国专利申请CN107058544A“14个功能性杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIRs基因同步测序分型的方法”。

鉴定结果如表2所示，从表中可以看到，本实施例所提供的 KIR3DL1基因快速分型方法的分型结果与采用一代测序技术得到的分型结果完全相同，具有非常好的一致性，表明本实施例所提供的引物组对于 KIR3DL1基因的分型具有高度的准确性。

表2.不同基因分型技术的分型结果比较

从上述实施例中可以看到，本发明实施例所提供的分型引物组基于已公布的147个 KIR3DL1等位基因进行设计，对于所有高表达型 KIR3DL1*h等位基因和所有低表达型 KIR3DL1*l等位基因以及所有 KIR3DL1等位基因各设计一对特异性引物，以更少的引物完成更全面的检测。以此形成的快速分型方法相较于第一代测序技术无需配置昂贵的一代测序仪和配套试剂，仅需常规PCR仪、琼脂糖凝胶电泳仪和配套成像***即可完成分型工作，费用便宜，操作简单快速，结果易于判读，更符合临床检测要求。同时，其采用的引物反应体系和反应参数可以是相同的，从而能够实现同步扩增、省时省力。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市宝安区妇幼保健院

<120> KIR3DL1基因分型引物组及其应用

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aacaaaaaaa gtaagtctca cgg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaggagcmcc tacctcgctg ttg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aacaaaaaaa gtaagtctca cgc 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatgccctaa gatgmagact cac 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cagctcaggt atgaggggag ct 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggctgagaga gaaggtttct catat 25

Claims

1.一种KIR3DL1基因的快速分型方法，其特征在于，所述快速分型方法为基于PCR-SSP技术的高/低表达型KIR3DL1基因的快速分型方法，所述快速分型方法包括以下步骤：

S1、提取待测样本的DNA；

S2、以所述DNA为模板，使用KIR3DL1基因分型引物组作为扩增引物进行PCR扩增，所述PCR扩增的程序为：95℃，4min；95℃，30s，68℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min；

S3、根据扩增产物确定分型结果，所述确定分型结果的方法为：凝胶电泳检测所述扩增产物，判断特异性PCR产物条带，确定所述DNA的基因型；

所述的快速分型方法适用于非诊断目的；

所述KIR3DL1基因分型引物组包括如下引物对：

高表达型KIR3DL1*h等位基因特异性引物对：

KIR3DL1*h-PCR-SSP-F：5′-AACAAAAAAAGTAAGTCTCACGG-3′，

KIR3DL1*h-PCR-SSP-R：5′-GAGGAGCMCCTACCTCGCTGTTG-3′；

低表达型KIR3DL1*l等位基因特异性引物对：

KIR3DL1*l-PCR-SSP-F：5′-AACAAAAAAAGTAAGTCTCACGC-3′，

KIR3DL1*l-PCR-SSP-R：5′-GATGCCCTAAGATGMAGACTCAC-3′；

通用型KIR3DL1基因特异性引物对：

KIR3DL1-PCR-SSP-F：5′-CAGCTCAGGTATGAGGGGAGCT-3′，

KIR3DL1-PCR-SSP-R：5′-GGCTGAGAGAGAAGGTTTCTCATAT-3′。

2.根据权利要求1所述的快速分型方法，其特征在于，S2中PCR的反应体系如下：

10×PCR Buffer 1.0μL；

2.5mM的dNTP 0.8μL；

5mM的Mg²⁺ 3.0μL；

10μM的PCR引物各0.4μL；

30~100ng/μL的待测DNA 1.0μL；

5U/μL的Taq DNA聚合酶 0.1μL；

ddH₂O 补至10.0μL。