CN111088194B

CN111088194B - 一株粪肠球菌及其应用

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Publication number: CN111088194B
Application number: CN202010044764.6A
Authority: CN
Inventors: 石孔泉; 朱义明
Original assignee: Shengjinhe Biotechnology Jiangsu Co ltd
Current assignee: Shengjinhe Biotechnology Jiangsu Co ltd
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2020-01-16
Publication date: 2022-09-20
Anticipated expiration: 2040-01-16
Also published as: CN111088194A

Abstract

一株粪肠球菌及其应用。所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，于2019年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20191139。所述凝结芽孢杆菌的应用，是指粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139用于动物饲喂，规格为100亿cfu/g的单菌粉用量为0.5‰‑1.0‰。本发明的有益效果在于，粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139稳定性能好，可明显提升动物健康状态。

Description

一株粪肠球菌及其应用

技术领域

本发明专利涉及一株粪肠球菌及其在饲料添加剂中的应用，属于微生物技术领域。

背景技术

益生菌通常是指改善宿主微生态平衡而发挥有益作用，达到提高宿主健康水平和健康状态的微生物菌剂及其代谢产物。粪肠球菌(Enterococcus faecalis )，乳酸菌的一种，革兰氏阳性菌，是人和动物肠道内主要菌群之一。

粪肠球菌的益生作用机制包括：(1)作为乳酸菌的一种，粪肠球菌能够产生细菌素、有机酸或挥发性脂肪酸等来改善肠道内环境，达到竞争有害菌的应用成分或抑制其生长及活动的效果；(2) 粪肠球菌能够在动物肠道内形成生物薄膜附着在动物肠道粘膜上，进行正常发育、生长的繁殖，形成乳酸菌屏障，抵御外来毒素和致病菌侵入；(3)粪肠球菌能够能将多种碳水化合物的无氮浸出物转化为乳酸，完全被机体进行吸收利用；还能分解部分蛋白质；(4)粪肠球菌能够显著增强巨噬细胞的活性，促进免疫器官的发育，提高动物的免疫反应能力，促进抗体的产生及细胞因子的分泌，从而增强机体的免疫力(安玉亭，胡浩，王智刚，周新秀，粪肠球菌的生物学特性及其在养殖业中的应用，安徽农业科学，2015，43(27)：115-117)。

在《饲料添加剂品种目录(2013)》中，粪肠球菌被归类于微生物饲料添加剂，适用范围为养殖动物。已有不少关于粪肠球菌在畜禽养殖中的应用报道。CN104293697B公开了一种含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂及其制备方法，其有益效果在于：提高动物的饲料利用效率，节约成本，大大改善动物体内消化道内环境的稳态，促进营养的吸收利用，促进动物生长，显著提高动物的生产性能、免疫性能和繁殖性能，降低生产成本，提高经济效益。CN110326706A公开了一种含粪肠球菌的复合型高活性饲用益生菌剂，其有益效果在于：益生菌剂能有效提高饲料利用率和养殖动物机体免疫能力，减少腹泻、下痢机率，改善动物皮毛色泽和肉的品质，降低动物粪便臭味，减少医疗用药次数，降低动物饲养成本。

大多数乳酸菌不能耐受动物消化道中胃酸、胆盐等不良环境条件的作用，并且在颗粒饲料加工中无法耐受制粒时的高温、压力和剪切力，以及运输和存储过程中易受温度、挤压、氧气的影响，致使活性大大降低甚至死亡，严重影响了活菌制剂的效价及其应有的益生特性(王建华，杨新建，腾达，王秀敏，毛若雨，郝娅，一种粪肠球菌微胶囊及其制备方法，CN107260704A)。粪肠球菌也存在同样问题。江文涛等考察了国内3家同类产品的室温稳定性，发现60天存活率最高不超过32％ (江文涛，马加军，贾朋辉，卢刚，邱勇，微胶囊化粪肠球菌稳定性影响因素研究，饲料研究，2018 年01期：74-78)。

研究人员进行了大量尝试以增强粪肠球菌的稳定性。张琳等采用乳化凝胶化法制备微囊化粪肠球菌，发现微囊化粪肠球菌5个月的存活率由10.96％提升到30.42％，且对不良环境的抗性有显著提升(张琳，贠婷婷，綦文涛，李杰，王永伟，李爱科，乳化凝胶化法微囊化益生菌抗胁迫作用研究，动物营养学报，2015年11期：3636-3642)。杜志琳等研究了微囊化粪肠球菌的体外特征，发现微囊化粪肠球菌较菌粉样品的抗逆性有明显提高，6个月的存活率由31.5％增加至65.9％(杜志琳，尹望，李雪平，微囊化粪肠球菌的体外特征的研究，中国饲料添加剂，2018年第7期：36-39)。江文涛等选择合适的载体并控制水分，微囊化粪肠球菌的45天存活率达96.6％，较原菌粉的11.3％有显著提高；应用中试中，微囊化粪肠球菌的30天存活率和60天存活率分别可达88.7％和81.3％ (江文涛，马加军，贾朋辉，卢刚，邱勇，微胶囊化粪肠球菌稳定性影响因素研究，饲料研究，2018 年01期：74-78)。

基于成本因素和加工便利，饲用益生菌不仅要求益生功能显著，还必须有良好的加工性能和储存性能。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一株粪肠球菌及其在饲料加工中的应用。本发明粪肠球菌菌株抗逆性强、稳定性能好，可用作动物益生菌。

本发明技术方案如下：

一株粪肠球菌(Enterococcus faecalis )014及其应用。

所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis )014，于2019年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20191139。

所述粪肠球菌的应用，是指粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139用于饲喂动物，规格为100亿cfu/g 的单菌粉用量为0.5‰-1.0‰。

本发明的有益效果在于：

本发明的粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139稳定性好，可明显提升动物健康状态。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进行具体描述。

本发明粪肠球菌(Enterococcus faecalis )014于2019年12月31日保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20191139。

实施例1

取粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139发酵液进行耐酸性能评估。

粪肠球菌发酵液活菌数为50亿cfu/mL。取1mL粪肠球菌发酵液加入模拟胃液中，置于37℃培养。定时取样并测定粪肠球菌活菌数，与初始活菌数进行比较，计算存活率。

模拟胃液配制方法：配制pH1.5-3.0的稀盐酸溶液各100mL，分别加入1g胃蛋白酶，使其充分溶解，模拟胃液。

采用倾注平板法测定粪肠球菌活菌数。先以无菌生理盐水进行十倍逐级稀释，取1mL稀释液在培养皿上，将灭菌后冷却至45℃的MRS培养基倾注在培养皿上，迅速摇匀，置于37℃条件下培养24hr，计算粪肠球菌数量。MRS培养基配制方法：蛋白胨10.0g，牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温-801.0mL，七水磷酸氢二钾2.0g，三水醋酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，七水硫酸镁0.2g，四水硫酸锰0.05g，琼脂粉15.0g，将上述成分加入到1000mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH6.2±0.2，121℃灭菌15～20min。

表1粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139在不同模拟胃酸条件下存活率变化情况

人和的动物的胃液呈强酸性，采用模拟胃液评估了粪肠球菌CCTCC NO：M20191139的耐酸性能。 pH1.5-3.0范围内，随时间延长，粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139的存活率逐步下降；pH越低，下降趋势越明显。即使这样，pH1.5、作用180min后，粪肠球菌CCTCCNO：M20191139的存活率依然达到58％，这说明粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139有良好的耐酸能力。

实施例2

取粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139发酵液进行耐胆盐性能评估。

粪肠球菌发酵液活菌数为50亿cfu/mL。取1mL粪肠球菌发酵液加入模拟胆盐中，置于37℃培养。定时取样并测定粪肠球菌活菌数，与初始活菌数进行比较，计算存活率。

模拟胆盐配制方法：氯化钠8g，氯化钾0.2g，十二水磷酸氢二钠3.63g，磷酸二氢钾0.24g，纯净水1000mL，猪胆盐0.1％～0.3％。

粪肠球菌活菌数测定方法和存活率计算方法同实施例1。

表2粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139在不同模拟胆盐条件下存活率变化情况

胆盐对微生物有一定破坏性。要发挥益生作用，微生物必须能耐受胆盐。人体胆盐浓度一般 0.3％，动物有所不同。在模拟胆盐试验条件下，随时间延长，粪肠球菌CCTCC NO：M20191139的存活率逐步下降；胆盐浓度越高，下降趋势越明显。0.5％胆盐、作用6hr后，粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139的存活率依然达到79％，这说明粪肠球菌CCTCC NO：M20191139有良好的耐胆盐能力。

实施例3

对粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139单菌粉进行储存稳定性评估。

将粪肠球菌原菌粉与无水葡萄糖按比例混合，制备粪肠球菌单菌粉(规格：500亿cfu/g-2000 亿cfu/g)；将单菌粉密封，分别储存于-18℃、4℃和室温，定期测定活菌数，计算存活率。

表3粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139单菌粉不同储存温度下的存活率情况

不同规格的粪肠球菌单菌粉在不同储存温度下的存活率有细微差异，但结论一致：低温易于保存。从试验情况看，粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139单菌粉室温下储存2个月，存活率保持在80％以上；储存3个月，存活率保持在70％左右；储存6个月，存活率不低于60％。由此可见，粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139单菌粉成品货架期相对较长，便于客户应用。

实施例4

将粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139单菌粉(规格：100亿cfu/g)用于仔猪饲喂。

选用28日龄平均体重为(7.82±0.75)kg“杜×长×大”断奶仔猪108头，随机分为3组，每组6个重复(公母各占一半)，每个重复6头，每个重复为1栏。I组为空白组，基础饲粮中不添加任何益生菌和抗生素；II组为益生菌组，将粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139单菌粉拌入基础饲粮，用量是投料量的1‰；III组为抗生素组，在基础饲粮中加入500mg/kg硫酸粘杆菌素。仔猪在封闭式猪舍中饲养，水泥地面，自由采食和饮水，驱虫、消毒及免疫均按养猪场常规饲养管理程序进行，试验期30天。仔猪腹泻率的计算方法按文献执行(史自涛，姚焰础，江山，肖融，刘作华，杨飞云，董国忠，郭致君，粪肠球菌替代抗生素对断奶仔猪生长性能、腹泻率、血液生化指标和免疫器官的影响，动物营养学报，2015，27(6)：1832-1840)，结果如下：

表4粪肠球菌CCTCC NO ：M 20191139对仔猪腹泻率的影响

	I组	II组	III组
				腹泻率	7.3％	1.5％	5.2％

I组 II组 III组腹泻率 7.3％ 1.5％ 5.2％

粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139可显著降低仔猪腹泻率，对于促进仔猪健康生长具有积极作用。

实施例5

将粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139单菌粉(规格：100亿cfu/g)用于宠物狗饲喂。

参考张明秀的方法(张明秀，高多不饱和脂肪酸含量犬粮的制备及应用研究[D]，无锡：江南大学，2013年)，选取45只符合实验动物健康要求的成年比格犬，10kg左右/只，随机分成3组，每组15只。饲养温度23±2℃，相对湿度55±5％，光照时间为7:00～19:00，一笼一只饲养。采用商品犬粮(宝路成犬中小型犬全价犬粮)按建议喂食量进行比格犬喂养，三周后随机分成3组(对照组、实验组一、实验组二)分别喂食。喂食时间为9周。对照组，正常饲喂商品犬粮；实验组一，按照1‰用量进行拌料饲喂；实验组二，按照0.5‰用量进行拌料饲喂。

犬毛发收集：第-21、-14、0、7、14、28和第63天。按张明秀的方法采用感官评定进行打分： 1-钝的、粗糙的、干燥的；2-不弯曲的、不柔软的；3-中等完全、中等柔软的；4-高度弯曲的、非常柔软的；5-油腻的。

表5粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139对犬毛发的影响

在未添加粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139前，对照组、实验组一、实验组二的打分非常接近，基本没有区分，说明犬只毛发没有差异。使用粪肠球菌CCTCC NO：M 20191139仅7天后，实验组一、实验组二的打分较对照组有所提升；使用粪肠球菌CCTCC NO：M2019113914天后，实验组一、实验组二的打分明显高于对照组。这说明粪肠球菌CCTCC NO：M20191139对改善犬毛发有明显促进作用。

Claims

1.一株粪肠球菌(Enterococcus f aecalis)014，其特征在于：所述粪肠球菌为粪肠球菌(Enterococcus faecalis )014，保藏编号为CCTCC NO：M 20191139。

2.一种根据权利要求1所述的粪肠球菌在动物饲喂中的应用，规格为100亿cfu/g的单菌粉用量为0.5‰-1.0‰。