CN111077304A - 一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，涉及医学检测技术领域。该方法通过对羧基化乳胶微球进行预处理、对羧基化乳胶微球进行活化形成活化中间体，最后再与抗体偶联的过程，有效地提高羧基乳胶微球单分散性、乳胶微球活化中间体的浓度以及羧基乳胶微球与抗体的偶联效率，避免乳胶微球发生自凝，维持乳胶微球的活化状态从而提高微球与抗体的有效结合率。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法。
背景技术
免疫层析技术从20世纪90年代发展至今，已成为临床医学常用的、成熟的快速检测技术，其中较为常见的形式是免疫层析试纸条技术。试纸条一般由PVC背板、吸水纸、固相硝酸纤维素膜(NC膜)、结合垫和样品垫组装而成。其工作原理通常是采用直接竞争法、间接竞争法或双抗体夹心法，关键技术是利用标记材料偶联抗体，使抗体显色，进而识别抗原物质。
常见的显色型标记物有酶、胶体金以及乳胶微球。酶作为标记材料的技术虽然比较成熟，但酶受温度影响较大，稳定性差，产品有效期短；胶体金是目前商品化试纸条中使用最多的标记材料，但其信号方法成本高，无法用于精确检测；乳胶微球在液体中可以形成稳定的胶体，与胶体金相比，微球颗粒更大，可以节省抗体用量，灵敏度更高；同时可以进行大规模生产，成本更低；稳定性与灵敏度更优。因此，通过在表面携带不同基团的乳胶微球上与抗体实现共价结合形成结构稳定的复合物，以应用于疾病诊断和生物医药等领域是目前研究的热点。
然而，乳胶微球在活化之前易发生聚沉，而在活化后pH值提高又容易发生水解，导致乳胶微球与抗体的偶联效率较低，难以满足乳胶微球标记物在临床免疫检测中的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是解决现有技术中的不足，提供一种羧基乳胶微球与抗体偶联方法，提高乳胶微球与抗体的偶联效率。
为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：
一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，包括以下步骤：
S1，将质量分数为4％羧基乳胶微球原液与活化缓冲液按体积比1:15-25充分混合，离心，弃上清，向沉淀中加入4倍所述羧基乳胶微球原液体积的活化缓冲液，再次混合，超声，至溶液中的羧基乳胶微球处于单分散状态，得到微球悬液，将微球悬液于4℃保存备用；
S2，将100g/L的EDC水溶液、100g/L的Sulfo-NHS水溶液以及所述微球悬液按体积比0.8-1.2:5.5-6.5:65-75快速充分混合，反应30min，得到第一混合液；
S3，对所述第一混合液进行超声，至所述第一混合液中的羧基乳胶微球处于单分散状态后，离心洗涤，得到沉淀液，向沉淀液中加入质量分数为10％的Tween-20混匀，得到活化微球液，将活化微球液于4℃保存备用，所述活化微球液中的Tween-20的质量分数为0.1-0.2％；
S4，将0.1～1ug/μL的抗体溶液与所述活化微球液按体积比为3-4:1进行混合，偶联反应2h以上，得到微球-抗体标记物溶液；
S5，向所述微球-抗体标记物溶液中加入1mol/L乙醇胺溶液，旋转混合均匀，得到第三混合液，所述第三混合液中乙醇胺的浓度为5～20mmol/L；
S6，对所述第三混合液进行超声、离心洗涤，得到微球-抗体标记物沉淀，向所述微球-抗体标记物沉淀中加入保存液重悬，即得到含有质量分数0.5％的羧基乳胶微球-抗体标记物重悬液。
进一步的，所述步骤S1之前还包括：将所述羧基乳胶微球液超声3-10min。
进一步的，所述步骤S3中离心洗涤，得到沉淀液的具体操作包括步骤S301-302：
S301，将超声后的第二混合液进行第一次离心，8000-12000rpm，10-20min，弃上清，将沉淀用1mL的SDS溶液重悬，得到第一重悬液，所述SDS溶液的质量分数为0.005％；
S302，将所述第一重悬液进行第二次离心，8000-12000rpm，10-20min，弃上清，加入与所述羧基乳胶微球原液体积一致的纯化水重悬沉淀，得到第二重悬液，超声所述第二重悬液至所述第二重悬液中的羧基乳胶微球处于单分散状态，即得到所述沉淀液。
进一步的，所述步骤S6离心洗涤，得到微球-抗体标记物沉淀的具体操作包括步骤S601-602：
S601，将超声后的第三混合液进行第一次离心，8000-12000rpm，10-20min，弃上清，将沉淀用1mL的保存液重悬，得到第三重悬液；
S602，将所述第三重悬液进行第二次离心，8000-12000rpm，10-20min，弃上清，即得到微球-抗体标记物沉淀。
进一步的，所述步骤S6之后，还包括将所述羧基乳胶微球-抗体标记物重悬液于4℃冷藏保存的步骤。
进一步的，所述抗体溶液具体为抗体原液与抗体缓冲液配制而得，所述抗体缓冲液为100mmol/L的HEPES缓冲液或100mmol/L的PB缓冲液。
进一步的，所述活化缓冲液的pH＝6，每1L的活化缓冲液中包括19-20g MES，0.001-1g SDS。
进一步的，所述保存液pH＝8.5，所述保存液由0.5g BSA，0.5g Tween-20和0.05gProClin300加入100mL 10mmol/L的Tris-HCl缓冲液中配制而得。
与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：
(1)本发明所提供的羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，在活化过程中加入表面活性剂SDS增强微球稳定性，用EDC和Sulfo-NHS活化时不贴壁聚沉，保证其单分散性，降低了超声处理频次；且SDS在乳胶微球的活化过程中不会与EDC发生反应，提高了微球的活化效率；活化过程中用Sulfo-NHS代替传统的NHS，保证活化后乳胶微球仍带负电荷，不发生凝集沉淀；
(2)本发明所提供的羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，活化后用SDS溶液洗涤羧基乳胶微球不会提高悬液的pH度，极大地避免了乳胶微球活化中间体被水解；偶联反应过程中Tween-20作为温和的表面活性剂可稳定活化后的乳胶微球，避免偶联后乳胶微球表面负电荷减少而聚沉，同时低浓度Tween-20对抗体活性无影响，提高乳胶微球的单分散性进而提高偶联效率。
(3)本发明所述的羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，其保存液中的缓冲液以及0.5％BSA可保护偶联到乳胶微球上的抗体，防止其变性，低浓度Tween-20保证乳胶处于单分散状态，痕量ProClin300为防腐剂，该保存液配方可保证标记抗体后的乳胶微球在4℃条件下稳定存放3个月以上不发生聚沉，同时抗体活性几乎无降低。
(4)本发明所述的羧基乳胶微球与抗体的偶联方法适用于羧基乳胶微球与不同抗体的偶联，适用范围广，实现抗原物质的定性与定量检测，易于形成试纸条的规模化制备与生产。
具体实施方式
下面将对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下将描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
还应当理解，在此本发明实施例说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明实施例。如在本发明实施例说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。
本发明实施例提供一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，包括以下步骤：
S1，将质量分数为4％羧基乳胶微球原液与活化缓冲液按体积比1:15-25充分混合，离心，弃上清，向沉淀中加入4倍所述羧基乳胶微球原液体积的活化缓冲液，再次混合，超声，至溶液中的羧基乳胶微球处于单分散状态，得到微球悬液，将微球悬液于4℃保存备用。
所述活化缓冲液的pH＝6，每1L的活化缓冲液中包括19-20g MES，0.001-1g SDS。
步骤S1中，将羧基乳胶微球液用活化缓冲液进行稀释活化，避免羧基乳胶微球发生自凝，通过超声处理可辅助将羧基乳胶微球全部进行单分散。
例如，在一实施例中，羧基乳胶微球液与活化缓冲液稀释的体积比为1:20。
在一实施例中，羧基乳胶微球液与活化缓冲液稀释的体积比为1:18。
在一实施例中，羧基乳胶微球液与活化缓冲液稀释的体积比为1:23。
在另一实施例中，为使得羧基乳胶微球的分散状态良好，减少后续处理时间，可预先将质量分数为4％羧基乳胶微球液进行超声处理3-10min。
S2，将100g/L的EDC水溶液、100g/L的Sulfo-NHS水溶液以及所述微球悬液按体积比0.8-1.2:5.5-6.5:65-75快速充分混合，反应30min，得到第一混合液；
本实施例使用Sulfo-NHS代替传统方法中的NHS，可保证活化后的羧基乳胶微球仍带负电荷，不易发生凝集沉淀。且，活化缓冲液中含有的SDS不会与EDC发生反应，可提高活化效率。
在一实施例中，所述第一混合液是由100g/L的EDC水溶液、100g/L的Sulfo-NHS水溶液以及所述微球悬液按体积比1:5.8:68快速混合，反应30min而得。
在一实施例中，所述第一混合液是由100g/L的EDC水溶液、100g/L的Sulfo-NHS水溶液以及所述微球悬液按体积比1.1:6.1:72快速混合，反应30min而得。
S3，对所述第一混合液进行超声，至所述第一混合液中的羧基乳胶微球处于单分散状态后，离心洗涤，得到沉淀液，向沉淀液中加入质量分数为10％的Tween-20混匀，得到活化微球液，将活化微球液于4℃保存备用，所述活化微球液中的Tween-20的质量分数为0.1-0.2％。
此步骤中，对活化后的羧基乳胶微球加入Tween-20可稳定羧基乳胶微球的活化状态，提高羧基乳胶微球的单分散性进而提高后续反应的偶联效率。
在一具体实施例中，所述步骤S3中离心洗涤，得到沉淀液的具体操作包括步骤S301-302：
S301，将超声后的第二混合液进行第一次离心，8000-12000rpm，10-20min，弃上清，将沉淀用1mL的SDS溶液重悬，得到第一重悬液，所述SDS溶液的质量分数为0.005％；
S302，将所述第一重悬液进行第二次离心，8000-12000rpm，10-20min，弃上清，加入与所述羧基乳胶微球原液体积一致的纯化水重悬沉淀，得到第二重悬液，超声所述第二重悬液至所述第二重悬液中的羧基乳胶微球处于单分散状态，即得到所述沉淀液。
活化后的羧基乳胶微球用SDS溶液洗涤重悬，可保证乳胶微球活化中间体不会被水解，羧基乳胶微球的稳定性。
S4，将0.1～1ug/μL的抗体溶液与所述活化微球液按体积比为3-4:1进行混合，偶联反应2h以上，得到微球-抗体标记物溶液。
在一实施例中，所述抗体溶液具体为抗体原液与抗体缓冲液配制而得，所述抗体缓冲液为100mmol/L的HEPES缓冲液或100mmol/L的PB缓冲液。
在旋转的条件可以确保抗体与羧基乳胶微球的偶联反应更加充分。在一实施例中，偶联反应2h。
在一实施例中，偶联反应2.5h。
在一实施例中，偶联反应4h。
S5，向所述微球-抗体标记物溶液中加入1mol/L乙醇胺溶液，旋转混合均匀，得到第三混合液，所述第三混合液中乙醇胺的浓度为5～20mmol/L；
S6，对所述第三混合液进行超声、离心洗涤，得到微球-抗体标记物沉淀，向所述微球-抗体标记物沉淀中加入保存液重悬，即得到含有质量分数0.5％的羧基乳胶微球-抗体标记物重悬液。
所述保存液pH＝8.5，所述保存液由0.5g BSA，0.5g Tween-20和0.05gProClin300加入100mL 10mmol/L的Tris-HCl缓冲液中配制而得。
在其他实施例中，所述步骤S6离心洗涤，得到微球-抗体标记物沉淀的具体操作包括步骤S601-602：
S601，将超声后的第三混合液进行第一次离心，8000-12000rpm，10-20min，弃上清，将沉淀用1mL的保存液重悬，得到第三重悬液；
S602，将所述第三重悬液进行第二次离心，8000-12000rpm，10-20min，弃上清，即得到微球-抗体标记物沉淀。
在一实施例中，所述步骤S6之后，还包括将所述羧基乳胶微球-抗体标记物重悬液于2-8℃冷藏保存的步骤。
需要说明的是，本发明实施例所述的单分散状态是指，含有羧基乳胶微球的液体在400x显微镜下观察无团聚以及大颗粒。
本实施例提供的羧基乳胶微球与抗体偶联方法，通过对羧基化乳胶微球进行预处理、对羧基化乳胶微球进行活化形成活化中间体，最后再与抗体偶联的过程，有效地提高羧基乳胶微球单分散性、乳胶微球活化中间体的浓度以及羧基乳胶微球与抗体的偶联效率，避免乳胶微球发生自凝，维持乳胶微球的活化状态从而提高微球与抗体的有效结合率。
本发明另一实施例提供一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，包括以下步骤：
1.微球预处理步骤
1.1.超声处理羧基乳胶微球，超声5min；
1.2.取25uL羧基乳胶微球(质量分数为4％，即1mg)，加475uL活化缓冲液，充分混匀后，10000rpm 10min离心，弃上清；
1.3.沉淀加入100uL活化缓冲液，吹吸混匀后超声至微球处于单分散状态(400x显微镜观察应无团聚以及大颗粒)，此为微球悬液，备用。
2.微球活化步骤
2.1.活化
将1.4uL100g/L EDC溶液，8.6uL 100g/L Sulfo-NHS溶液后迅速混匀，迅速加至100uL微球悬液中；迅速置于旋转混合仪上20rpm旋转混匀反应30min。
2.2.镜检
400x显微镜观察活化后微球，应无团聚以及大颗粒。
2.3.洗涤
10000rpm离心10min，弃上清，沉淀用1mL 0.005％SDS溶液重悬，10000rpm离心15min，弃上清；
沉淀重悬于25uL纯化水中，加入0.25uL 10％Tween-20溶液，终浓度为0.1％，超声至微球处于单分散状态(400x显微镜观察活化后微球，应无团聚以及大颗粒)；混匀备用。
3.抗体与乳胶微球偶联
吸取60ug抗体原液，加入一定体积100mmol/L HEPES缓冲液或100mmol/L PB缓冲液，稀释至75uL，充分混匀后，加入2.3所得微球悬液中，迅速置于旋转混匀仪上20rpm旋转混匀2h。
4.封闭
向3所得微球-抗体标记物加入1mol/L乙醇胺1uL，乙醇胺终浓度为10mmol/L，旋转混匀1h。
5.保存
5.1.洗涤
取一定量4封闭后标记物，镜检，微球应处于单分散状态(若有团聚，应超声至单分散状态)；10000rpm离心10min，分离上清并用1mL保存液重悬沉淀，10000rpm离心15min，弃上清。
5.2.保存
加入200uL保存液重悬沉淀，即微球浓度为0.5％，2-8℃冷藏保存。
实施例中所用试剂的浓度和配制方法如下：
活化缓冲液
称取19.524g MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)，0.05g SDS(十二烷基硫酸钠)，加入一定量纯水，调节pH至6.0，定容至1L。
100g/L EDC(1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液
称取10mg EDC，加入100uL活化缓冲液，充分混匀，现配现用。
100g/L Sulfo-NHS(N-羟乙基硫代琥珀酰亚胺)溶液
称取10mg Sulfo-NHS，加入100uL活化缓冲液，充分混匀，现配现用。
0.005％SDS溶液
称取0.05g SDS，加入1L纯水，充分溶解。
100mmol/L HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液
称取23.83g HEPES，加入一定量纯水，调节pH至7.5，定容至1L。
100mmol/L PB缓冲液
称取1.45g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，加入一定量纯水，调节pH至7.5，定容至100mL。
10％吐温-20溶液
称取10g吐温-20，加入90mL纯水。
1mol/L乙醇胺
称取0.6108g乙醇胺，加入100mL纯水。
10mmol/L Tris-HCl缓冲液
称取1.2114g Tris(三羟甲基氨基甲烷)，加入一定量纯水，调节pH至8.5，定容至1L。
保存液
称取0.5g BSA，0.5g吐温-20和0.05g ProClin 300，加入100mL10mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.5)，调节pH至8.5。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
Claims (8)
1.一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将质量分数为4％羧基乳胶微球原液与活化缓冲液按体积比1:15-25充分混合，离心，弃上清，向沉淀中加入4倍所述羧基乳胶微球原液体积的活化缓冲液，再次混合，超声，至溶液中的羧基乳胶微球处于单分散状态，得到微球悬液，将微球悬液于4℃保存备用；
S2，将100g/L的EDC水溶液、100g/L的Sulfo-NHS水溶液以及所述微球悬液按体积比0.8-1.2:5.5-6.5:65-75快速充分混合，反应30min，得到第一混合液；
S3，对所述第一混合液进行超声，至所述第一混合液中的羧基乳胶微球处于单分散状态后，离心洗涤，得到沉淀液，向沉淀液中加入质量分数为10％的Tween-20混匀，得到活化微球液，将活化微球液于4℃保存备用，所述活化微球液中的Tween-20的质量分数为0.1-0.2％；
S4，将0.1～1ug/μL的抗体溶液与所述活化微球液按体积比为3-4:1进行混合，偶联反应2h以上，得到微球-抗体标记物溶液；
S5，向所述微球-抗体标记物溶液中加入1mol/L乙醇胺溶液，旋转混合均匀，得到第三混合液，所述第三混合液中乙醇胺的浓度为5～20mmol/L；
S6，对所述第三混合液进行超声、离心洗涤，得到微球-抗体标记物沉淀，向所述微球-抗体标记物沉淀中加入保存液重悬，即得到含有质量分数0.5％的羧基乳胶微球-抗体标记物重悬液。
2.如权利要求1所述的羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，其特征在于，所述步骤S1之前还包括：将所述羧基乳胶微球液超声3-10min。
3.如权利要求1所述的羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，其特征在于，所述步骤S3中离心洗涤，得到沉淀液的具体操作包括步骤S301-302：
S301，将超声后的第二混合液进行第一次离心，8000-12000rpm，10-20min，弃上清，将沉淀用1mL的SDS溶液重悬，得到第一重悬液，所述SDS溶液的质量分数为0.005％；
S302，将所述第一重悬液进行第二次离心，8000-12000rpm，10-20min，弃上清，加入与所述羧基乳胶微球原液体积一致的纯化水重悬沉淀，得到第二重悬液，超声所述第二重悬液至所述第二重悬液中的羧基乳胶微球处于单分散状态，即得到所述沉淀液。
4.如权利要求1所述的羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，其特征在于，所述步骤S6离心洗涤，得到微球-抗体标记物沉淀的具体操作包括步骤S601-602：
S601，将超声后的第三混合液进行第一次离心，8000-12000rpm，10-20min，弃上清，将沉淀用1mL的保存液重悬，得到第三重悬液；
S602，将所述第三重悬液进行第二次离心，8000-12000rpm，10-20min，弃上清，即得到微球-抗体标记物沉淀。
5.如权利要求4所述的羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，其特征在于，所述步骤S6之后，还包括将所述羧基乳胶微球-抗体标记物重悬液于4℃冷藏保存的步骤。
6.如权利要求1所述的羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，其特征在于，所述抗体溶液具体为抗体原液与抗体缓冲液配制而得，所述抗体缓冲液为100mmol/L的HEPES缓冲液或100mmol/L的PB缓冲液。
7.如权利要求1所述的羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，其特征在于，所述活化缓冲液的pH＝6，每1L的活化缓冲液中包括19-20g MES，0.001-1g SDS。
8.如权利要求1所述的羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，其特征在于，所述保存液pH＝8.5，所述保存液由0.5g BSA，0.5g Tween-20和0.05g ProClin300加入100mL 10mmol/L的Tris-HCl缓冲液中配制而得。
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