CN110982724A - 一种拮抗植物病原菌和促生根的芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种拮抗植物病原菌和促生根的芽孢杆菌及其应用，该菌株为贝莱斯芽孢杆菌FJAT‑47164，学名为Bacillus velezensis FJAT‑47164，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.15948。本发明的芽孢杆菌不仅可以抑制植物病原菌，还可以促进植物生根，可用于枯萎病的早期预防，是一种对环境友好、经济有效的防治病害的生防菌。

Description

一种拮抗植物病原菌和促生根的芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株拮抗植物病原菌和促生根的芽孢杆菌菌株。
背景技术
枯萎病是一种***感染病害，是来蒙、大豆、小麦、番茄、棉花、草莓等植物的常见土传病害，在美国、加拿大、澳大利亚、中国等是一个日益突出的问题。植株由于枯萎病，叶片变小，缺少光泽，枝条矮化，果实瘦小，或叶片变黄萎蔫，严重时植株逐渐枯死。枯萎病的主要病原种群是尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum和腐皮镰刀菌Fusarium solani，防治的方法有化学试剂、真菌剂、生物防治、植物性治疗药物、优化施肥等，而采用生防菌控制枯萎病是综合防治的一条重要措施。
多种真菌、细菌和一些放线菌都可应用于真菌病害的生物防治，拮抗性细菌有短短芽孢杆菌、绿叶假单胞菌、贝莱斯芽孢杆菌等。细菌在植物生物防治中的应用研究已广泛开展，并取得良好的应用效果。但是，这些细菌对植物枯萎病却没有很好的防治效果。
因此，筛选到防效好、适应性广的生防菌是植物枯萎病生物防治工作面临的关键问题。而且，如果能筛选到在植物生长早期就能使用的生防菌，可以对植物病原菌进行及早预防，减少枯萎病等植物病害的发生，提高农作物产量。
发明内容
为此，需要提供一种拮抗植物病原菌的生防菌，解决枯萎病的生物防治问题。
为实现上述目的，发明人提供了如下技术方案：
一株拮植物病原菌和促生根的芽孢杆菌，所述的芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌FJAT-47164，学名为Bacillus velezensis FJAT-47164，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.15948，保藏日期为2018年6月19日，保藏地址为中国北京市中国科学院微生物研究所。
芽孢杆菌FJAT-47164的菌落形态为：淡黄色，圆形***，不透明，边缘整齐，表面光滑湿润的小菌落。
芽孢杆菌FJAT-47164对尖孢镰刀菌有较强的拮抗作用，包括番茄寄主尖孢镰刀菌FJAT-30512、香蕉寄主尖孢镰刀菌FJAT-370和西瓜寄主尖孢镰刀菌FJAT-30265，以及对地毯草黄单胞菌FJAT-10151也有较强拮抗作用。
进一步的，所述的拮抗植物病原菌和促生根的芽孢杆菌在拮抗植物病原菌中的应用。
具体的，将所述的芽孢杆菌制成抑菌溶液，采用灌根法浇灌于植物幼苗根系，或者喷洒于植物叶片或果实上。
所述的抑菌溶液的制备方法是将所述的芽孢杆菌菌株接种到固体培养基平板上，挑取一菌环单菌落接种到相应的液体培养基中，25-35℃恒温培养36-60h；对芽孢杆菌发酵液进行离心，弃菌体，取上清，即可得到抑菌溶液。
进一步的，所述的拮抗植物病原菌和促生根的芽孢杆菌在促进植物种子发芽中的应用。
具体的，用所述的芽孢杆菌的菌悬液浸种6-8h，用湿纱布包盖于25-28℃下催芽2-3天，有1/2-2/3种子露白时，即可播种，基质可用育苗土或育苗块。
所述的芽孢杆菌的菌悬液的制备方法是将芽孢杆菌菌株接种到固体培养基平板上，再挑取一菌环单菌落接种到相应的液体培养基中，25-35℃恒温培养36-60h，将培养后的菌液稀释至菌浓为1-4×105cfu·mL-1即可。
进一步的，所述的固体培养基为LB固体培养基，相应的液体培养基为LB液体培养基。
本发明的有益效果是：
(1)从西藏纳木错国家公园牦牛粪中筛选到的芽孢杆菌FJAT-47164，对枯萎病主要病原菌镰刀菌具有很强的抑制效果，可专门用于防治枯萎病。
(2)芽孢杆菌FJAT-47164是植物病原菌的拮抗菌，尤其是枯萎病主要病原菌的拮抗菌，是一种对环境友好、经济有效的防治病害的生防菌。它能产生具有较强抗逆性的内生孢子(芽孢)，能耐盐、耐酸、耐高温且易于保存和运输，有利于快速实现商品化生产。
(3)芽孢杆菌FJAT-47164除了有显著的抑菌效果外，还具有明显促进植物生根的作用。可在植物种子阶段就进行应用，及早预防植物病害的发生。
附图说明
图1为具体实施方式所述的FJAT-47164对3种不同寄主尖孢镰刀菌的拮抗作用。A、B、C三行的平板分别接种的是番茄尖孢镰刀菌FJAT-30512、香蕉寄主尖孢镰刀菌FJAT-370、西瓜寄主尖孢镰刀菌FJAT-30265，左图均为空白对照，右图均为划线接种的FJAT-47164菌株。
图2为具体实施方式所述的芽孢杆菌FJAT-47164的菌落形态，左图为FJAT-47164菌株在整块平板上的菌落生长状态，右图为左图菌落的局部放大图。
图3为具体实施方式所述的芽孢杆菌FJAT-47164的16S rRNA序列鉴定结果的进化树。
图4为具体实施方式所述的芽孢杆菌FJAT-47164对绿豆种子萌发的影响。
图5为具体实施方式所述的芽孢杆菌FJAT-47164对绿豆种子根长和绿豆芽茎长的影响。
图6为具体实施方式所述的绿豆种子生长的盆栽结果。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
实施例1拮抗菌株的筛选
1.土样采集与芽孢杆菌分离纯化
将西藏纳木错国家公园牦牛粪制成悬浊液，再经过无菌水适当稀释，涂布LB平板(LB：胰蛋白胨10g·L-1，氯化钠10g·L-1，酵母粉5g·L-1，琼脂粉1.5％，pH 7.0-7.2)；30℃培养48h，挑取单菌落，甘油保存，作为待测菌株。采用稀释涂板法分离纯化得到了58株菌株作为待测菌株。
2.枯萎病生防菌株的筛选
(1)对峙法初筛
供试菌株，于LB培养基平板上活化，30℃恒温培养48h。
尖孢镰刀菌FJAT-30512(陈倩倩,刘波,刘国红,车建美,龚海艳.华重楼根际土芽胞杆菌多样性研究[J].热带农业科学,2015,35(12):103-107+112.)、FJAT-370(陈梅春等.地衣芽孢杆菌FJAT-4脂肽结构鉴定及其对尖孢镰刀菌的抑制作用.微生物学报,2017,57(12).)、FJAT-30265(肖荣凤,刘波,朱育菁,等.尖孢镰刀菌磷脂脂肪酸的遗传多样性分析[J].植物保护学报,2017,44(5):763-770.)，保藏在福建省农业科学院农业生物资源研究所(刘国红等.芽胞杆菌分类与应用研究进展.微生物学通报，2017，44(4):949-958)。
尖孢镰刀菌FJAT-30512、FJAT-370、FJAT-30265于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA：马铃薯200.0g·L-1，蔗糖20.0g·L-1，琼脂15g·L-1)上活化，28℃恒温培养48h。将活化后的尖孢镰刀菌接种于PDA平板上，28℃培养120h至菌丝长满整个平板，然后在菌饼上打下直径9mm的小菌圈，置于PDA平板的正中间，再在距离小菌圈***22mm的地方划长为40mm线接种供试菌株。28℃恒温培养120h，观察菌株对各尖孢镰刀菌的抑制效果。
从西藏地区分离纯化得到的58株菌株，进行平板对峙法初筛获得了1株对不同寄主尖孢镰刀真菌FJAT-30512、FJAT-370和FJAT-30265均有拮抗作用的菌株FJAT-47164。实验结果如图1所示。
(2)抑菌圈法复筛
将初筛中对不同寄主尖孢镰刀菌具有抑制作用的1株菌株FJAT-47164进行抑菌圈法复筛。将供试菌株FJAT-47164接种到LB平板上，再挑取1菌环单菌落接到10mL LB液体培养基(胰蛋白胨10g·L-1，氯化钠10g·L-1，酵母粉5g·L-1，pH 7.0-7.2)中，170r·min-130℃恒温培养48h，经血球计数板计数，FJAT-47164菌落密度达2.232×108cfu·mL-1。对FJAT-47164发酵液进行离心，4000rpm离心8min，取上清，弃菌体。
a、番茄枯萎病生防菌的筛选
将2mL番茄寄主尖孢镰刀菌FJAT-30512的菌悬液(菌落密度2.31×107cfu·mL-1)与100mL 50℃的含150μg·mL-1链霉素的PDA半固体培养基(PDA：马铃薯200.0g·L-1，蔗糖20.0g·L-1，琼脂9g·L-1)混合后，吸取4mL倒入已制备好的含150μg·mL-1链霉素的PDA固体培养基(每块平板定量为20mL)，制成含病原菌的双层平板；待培养基凝固后，打孔(直径9mm)，在孔内加入100μL供试菌株上清液，阴性对照为100μL无菌水，阳性对照为100μL潮霉素(质量浓度为0.25mg·mL-1)，每个供试菌株重复3次，28℃恒温培养1-2d，用直径交叉法测量抑菌圈直径。抑菌效果如表1所示。
表1FJAT-47164菌株对番茄寄主尖孢镰刀菌FJAT-30512的抑菌作用
单位：mm
Figure BDA0001817355020000051
注：抑菌圈直径包含打孔器直径。
b、香蕉枯萎病生防菌的筛选
将2mL香蕉寄主尖孢镰刀菌FJAT-370的菌悬液(菌落密度2.52×107cfu·mL-1)与100mL 50℃的PDA半固体培养基(含150μg·mL-1链霉素)混合后，吸取4mL倒入已制备好的含150μg·mL-1链霉素的PDA固体培养基(每块平板定量为20mL)，制成含病原菌的双层平板；待培养基凝固后，打孔(直径9mm)，在孔内加入100μL供试菌株上清液，阴性对照为100μL无菌水，阳性对照为100μL潮霉素(质量浓度为0.25mg·mL-1)，每个供试菌株重复3次，28℃恒温培养1-2d，用直径交叉法测量抑菌圈直径。抑菌效果如表2所示。
表2FJAT-47164菌株对香蕉寄主尖孢镰刀菌FJAT-370的抑菌作用
单位：mm
Figure BDA0001817355020000061
注：抑菌圈直径包含打孔器直径。
c、西瓜枯萎病生防菌的筛选
将2mL西瓜寄主尖孢镰刀菌FJAT-30265的菌悬液(菌落密度2.14×107cfu·mL-1)与100mL 50℃的PDA半固体培养基(含150μg·mL-1链霉素)混合后，吸取4mL倒入已制备好的含150μg·mL-1链霉素的PDA固体培养基(每块平板定量为20mL)，制成含病原菌的双层平板；待培养基凝固后，打孔(直径9mm)，在孔内加入100μL供试菌株上清液，阴性对照为100μL无菌水，阳性对照为100μL潮霉素(质量浓度为0.2mg·mL-1)，每个供试菌株重复3次，28℃恒温培养1-2d，用直径交叉法测量抑菌圈直径。抑菌效果如表3所示。
表3FJAT-47164菌株对西瓜寄主尖孢镰刀菌FJAT-30265的抑菌作用
单位：mm
Figure BDA0001817355020000071
注：抑菌圈直径包含打孔器直径。
综上，从西藏纳木错国家公园牦牛粪中筛选到一株对番茄尖孢镰刀菌、香蕉尖孢镰刀菌、西瓜尖孢镰刀菌具有较强抑制效果的菌株FJAT-47164。利用菌株FJAT-47164拮抗尖孢镰刀菌的作用，可将菌株FJAT-47164的菌液或发酵上清液采用灌根法浇灌于番茄苗、西瓜苗或香蕉苗等植物幼苗根系，用于枯萎病的防治。
实施例2拮抗菌株的鉴定
1.形态特征
将FJAT-47164菌株于LB平板上活化，48h后观察菌株的菌落形态、大小、颜色、透明度、突起和边缘情况。
菌株FJAT-47164的菌落特征如图2所示，淡黄色，圆形***，不透明，边缘整齐，表面光滑湿润的小菌落。
2.16S rRNA基因序列分析
采用Tris-饱和酚法提取菌株FJAT-47164的基因组DNA，采用16S rRNA基因通用引物27F和1492R进行PCR扩增，PCR反应程序参照郑雪芳等的文献(郑雪芳,刘波,朱育菁,等.番茄青枯病生防芽孢杆菌的筛选与鉴定[J].中国生物防治学报,2016,32(5):657-665.)，PCR产物送至上海博尚测序，应用EZBioCloud完成序列同源性比对，通过MEGA 6.0.6软件分析序列和构建***发育树。
将菌株FJAT-47164的16S rRNA基因序列与EZBioCloud基因数据库比对，菌株FJAT-47164与Bacillus velezensis亲缘关系最近，16S rRNA基因同源性为99.86％，所以菌株FJAT-47164应属于Bacillus velezensis贝莱斯芽孢杆菌。将同源性较高菌株的16SrRNA基因序列下载进行对比分析，构建***发育树，采用Neighbour-Joining方法，Bootstrap值为1000次时，形成的发育树如图3所示。构建的***发育树中，菌株FJAT-47164与Bacillus velezensis聚在同一个分支。
实施例3芽孢杆菌对其他菌的抑制效果
(1)芽孢杆菌FJAT-47164抑菌溶液的制备
将芽孢杆菌FJAT-47164菌株接种到LB平板上，再挑取1菌环单菌落接到10mL LB液体培养基中，170r·min-130℃恒温培养48h，经血球计数板计数，FJAT-47164菌落密度达2.232×108cfu·mL-1。对FJAT-47164发酵液进行4000rpm，8min离心，弃菌体，取上清，即可得到抑菌溶液。
(2)抑菌溶液对地毯草黄单胞菌的抑制效果
将1mL地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)FJAT-10151(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.10271)的菌悬液(菌落密度4.224×108cfu·mL-1)与200mL 50℃的NA半固体培养基(牛肉膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂9g,水1L)混合后，吸取4mL倒入已制备好的NA固体培养基(牛肉膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂18g,水1L)，每块平板定量为20mL，制成含病原菌的双层平板；待培养基凝固后，打孔(直径6mm)，在孔内加入80μL抑菌溶液，阴性对照为80μL无菌水，阳性对照为80μL链霉素(质量浓度为0.06μg·mL-1)，实验重复3次，28℃恒温培养1-2d，用直径交叉法测量抑菌圈直径。抑菌效果如表4所示。
表4抑菌溶液对地毯草黄单胞菌FJAT-10151的抑菌作用
单位：mm
Figure BDA0001817355020000091
注：抑菌圈直径包含打孔器直径。
芽孢杆菌FJAT-47164可抑制地毯草黄单胞菌。地毯草黄单胞菌为典型的植物致病菌，会引起红掌的细菌性叶斑病、棉豆的白叶枯病、柑橘溃疡等植物病害。因此，也可将芽孢杆菌FJAT-47164制备的抑菌溶液喷洒于植物叶片或果实上，用于植物病原菌的防治。
实施例4芽孢杆菌的促生根作用
将芽孢杆菌FJAT-47164菌株接种到LB平板上，再挑取1菌环单菌落接到10mL LB液体培养基中，170r·min-130℃恒温培养48h，经血球计数板计数，FJAT-47164菌落密度达2.232×108cfu·mL-1。
将菌悬液进行梯度稀释，分别稀释1200倍、600倍、300倍、150倍、50倍、原液，以清水作为对照(ck)。挑选长势相对一致的绿豆种子置于底部铺置2-3层滤纸的9cm的透明培养盒中，每培养盒15粒绿豆种子，将其置于27℃恒温人工气候箱，光照16h、黑暗8h。跟踪观察绿豆发芽情况，记录发芽数，直到连续3d无新的发芽粒出现，测量绿豆发芽胚根机胚芽长度，分析芽孢杆菌FJAT-47164对绿豆种子发芽的影响。
实验结果显示，48h时，实验组与对照组比较，稀释的菌液组与对照组发芽明显即有2/3种子露白，原液抑制效果明显；72h时，实验组与对照组比较，随着稀释倍数的增加，实验组的生长状态也呈现正相关；96h时，实验组与对照组比较，随着稀释倍数的增加，实验组的生长状态也呈现正相关，原液抑制效果明显，已停止发芽。
芽孢杆菌FJAT-47164对绿豆种子萌发的发芽影响见表5和图4。实验结果显示，绿豆种子发芽指数：实验组与对照组无显著差异，无明显抑制促进作用；种子活力：稀释300-1200倍有促进作用，其中稀释600倍效果最好，且稀释600倍时，与其他组有显著差异，是对照组生长的114.93％。
表5芽孢杆菌FJAT-47164对绿豆种子萌发的影响
Figure BDA0001817355020000101
上表中，发芽率％＝(指定天数的发芽种子数/供试种子数)×100％；
发芽指数＝∑(Gt/Dt)，其中Gt为第t天的发芽种子数，Dt为相应发芽天数；
活力指数＝发芽指数×胚根长(cm)；
abcd表示显著性差异(P<0.05)。
72h时，芽孢杆菌FJAT-47164对绿豆种子根长茎长影响见表6和图5、图6。实验结果显示，绿豆芽根长：菌液稀释600倍效果最好，且与其他组有显著差异，菌液稀释600倍时的根长是对照的121.77％；茎长：均有抑制作用，但无显著差异，稀释600倍时抑制效果最弱，是对照的98.39％。
表6芽孢杆菌FJAT-47164对绿豆种子根长茎长影响
Figure BDA0001817355020000111
上表中，abcd表示显著性差异(P<0.05)。
总之，芽孢杆菌FJAT-47164的菌悬液不仅可提高绿豆种子活力，还可以促进绿豆芽生根。因此，在种子发芽阶段，可用稀释600-1200倍的芽孢杆菌FJAT-47164的菌悬液即菌浓在1-4×105cfu·mL-1浸种6-8小时，用湿纱布包盖于25-28℃下催芽2-3天，以促进种子生根发芽，待有1/2-2/3种子露白时，即可播种，基质可用育苗土或育苗块。
综上所述，芽孢杆菌FJAT-47164不仅可以抑制植物病原菌，还可以促进植物生根。在番茄、西瓜等种子发芽阶段，可用一定浓度的芽孢杆菌FJAT-47164的菌悬液浸泡种子来促进种子生根发芽，并且通过根系将抑菌溶液输送到叶子上，还可以在番茄、西瓜等植物生长阶段拮抗枯萎病等。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (7)

1.一种拮抗植物病原菌和促生根的芽孢杆菌，其特征在于：所述的芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌FJAT-47164，学名为Bacillus velezensis FJAT-47164，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.15948，保藏日期为2018年6月19日，保藏地址为中国北京市中国科学院微生物研究所。
2.一种如权利要求1所述的拮抗植物病原菌和促生根的芽孢杆菌在拮抗植物病原菌中的应用。
3.根据权利要求2所述的拮抗植物病原菌和促生根的芽孢杆菌在拮抗植物病原菌中的应用，其特征在于：将所述的芽孢杆菌制成抑菌溶液，采用灌根法浇灌于植物幼苗根系，或者喷洒于植物叶片或果实上。
4.根据权利要求3所述的拮抗植物病原菌和促生根的芽孢杆菌在拮抗植物病原菌中的应用，其特征在于：所述的抑菌溶液的制备方法是将所述的芽孢杆菌菌株接种到固体培养基平板上，挑取一菌环单菌落接种到相应的液体培养基中，25-35℃恒温培养36-60h；对芽孢杆菌发酵液进行离心，弃菌体，取上清，即可得到抑菌溶液。
5.一种如权利要求1所述的拮抗植物病原菌和促生根的芽孢杆菌在促进植物种子发芽中的应用。
6.根据权利要求5所述的拮抗植物病原菌和促生根的芽孢杆菌在促进植物种子发芽中的应用，其特征在于：用所述的芽孢杆菌的菌悬液浸种6-8h，于25-28℃下催芽2-3天，有1/2-2/3种子露白时，即可播种。
7.根据权利要求6所述的拮抗植物病原菌和促生根的芽孢杆菌在促进植物种子发芽中的应用，其特征在于：所述的芽孢杆菌的菌悬液的制备方法是将芽孢杆菌菌株接种到固体培养基平板上，再挑取一菌环单菌落接种到相应的液体培养基中，25-35℃恒温培养36-60h，将培养后的菌液稀释至菌浓为1-4×105cfu·mL-1即可。
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