CN108939132A - 一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸医用薄膜及其制备方法 - Google Patents

一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸医用薄膜及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸医用薄膜及其制备方法，将透明质酸溶解在磷酸盐缓冲液（pH=7.4）中，制得透明质酸溶液；再向透明质酸溶液加入低免疫原性胶原蛋白，搅拌均匀后，加入交联剂，如：京尼平溶液、或先加入4‑吗啉乙磺酸（MES）进行活化，随后加入1‑乙基‑碳二亚胺盐酸盐（EDC）与N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS）的组合物；反应结束后干燥成膜，制备得到了一种具有高生物活性的低免疫原性胶原蛋白/透明质酸复合医用薄膜。该医用薄膜材料具有良好的生物相容性、可生物降解性和生物安全性，又具有较好的力学强度，保湿性能，可用作止血材料、组织工程支架、高级敷料、药物载体材料、美容材料等。

Description

一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸医 用薄膜及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，涉及了一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸医用薄膜及其制备方法。
背景技术
透明质酸是由β-1,4与β-1,3-糖苷键所连接的D-葡萄糖醛酸与N-乙酰氨基葡萄糖的重复双糖所组成的线性多糖，它是一种非硫酸盐的糖胺聚糖。透明质酸广泛存在于脊椎动物体内，也存在于细菌中，其为人体内软***的外基质的主要组成部分，其具有优异的生物相容性及无免疫原性，并且由于其保水性，有利于细胞浸润的环境中，快速愈合。但是天然的透明质酸稳定性差，易降解，在水体系中缺乏力学强度等不足之处，限制了其在生物医药领域的应用。
天然高分子中的胶原类薄膜由于其优异的生物相容性，低免疫原性等，已在功能型薄膜领域得到了广泛应用。目前已有大量的研究人员利用胶原复合材料开发出各类术中止血材料及术后创口护理材料，因此被广泛应用于创伤敷料、生物胶黏剂、组织工程支架材料、给药载体材料等医用领域。凭借优良的生物活性、诱导组织再生能力、生物可降解性等，胶原类薄膜已成为目前的研究热点。然而，动物源胶原被发现存在病毒隐患、免疫排异性等缺点，影响了其的生物医学应用。近年来，利用基因重组技术制备低免疫原性胶原蛋白，解决了传统动物源胶原存在的生物安全性问题，能够成为动物源胶原的替代材料，目前已被应用于止血材料、组织工程材料、高级敷料等生物医用材料研发中。在实际应用中发现胶原类薄膜仍存在力学强度差、保湿性能弱等的先天缺陷，极大地限制了其的医学应用，因此，亟需开发一类具有高强度、保湿性能优异的胶原类薄膜。
综上所述，本发明为了解决目前生物薄膜类材料存在生物活性差，力学强度弱，降解速率快等缺点。采用以透明质酸为原料，与低免疫原性胶原蛋白共混。从根源上保证了材料的生物安全性；同时，为解决目前薄膜类材料存在的力学强度差、保湿性能弱等的缺陷，并以京尼平或EDC为生物交联，制备得到了一种基于低免疫原性胶原蛋白/透明酸的高强度，生物性能及保湿性能优异的医用薄膜，该薄膜材料具有良好的生物相容性、可生物降解性和生物安全性等优良性能，又兼具较好的力学强度，保湿性能，可用作止血材料、组织工程支架、高级敷料、药物载体材料等。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供的基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸医用薄膜。该薄膜具有良好的生物相容性、可生物降解性等优良性能，又兼具较好的力学强度，生物活性及保湿性能能显著促进组织创面愈合和修复，可用作高级敷料、组织工程支架、止血材料、美容材料等生物医用材料。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸医用薄膜的制备方法，首先将低免疫原性胶原蛋白溶液与透明质酸相混合，控制低免疫原性胶原蛋白用量为透明质酸质量的50%~150%，22～40℃下充分反应；至清澈透明后，加入交联剂充分反应；取充分反应的溶液制膜，得到基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸医用薄膜。
所述交联剂为京尼平溶液、或先加入4-吗啉乙磺酸（MES）进行活化，随后加入1-乙基-碳二亚胺盐酸盐（EDC）与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的组合物。
具体步骤包括：
（1）透明质酸溶液的制备：取1质量份透明质酸加入到50～200体积pH为7.4的磷酸缓冲液或蒸馏水中，22~80℃下搅拌至溶液完全澄清，配制成1份透明质酸水溶液
（2）基于低免疫原性胶原蛋白/透明质酸的高强度、生物活性及保湿性能优异的致密医用薄膜的制备：向步骤（1）所得透明质酸溶液中加入低免疫原性胶原蛋白，控制低免疫原性胶原蛋白用量为透明质酸质量的:0.5:1~1.5:1：，22～40℃下缓慢搅拌0.5～24h，搅拌至清澈透明，冷却至室温后，再加入低细胞毒***联剂，反应24~48h后将所制备混合溶液称取30~80质量均匀铺展在聚四氟乙烯板中，置于烘箱中，于37~40℃干燥24~72h。最后将其所成薄膜置于0~4℃下备用。制备得到基于低免疫原性胶原蛋白/透明质酸的高强度，生物活性且保湿性能优异的致密医用薄膜。
所述的低免疫原性胶原蛋白（分子量为3万~6万）；透明质酸（分子量为2万~100万）；制得的基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸医用薄膜的力学强度、生物降解性及保湿性能可通过调整生物交联剂的用量及改性条件来有效控制。
本技术与现有技术相比，具有如下优点：
（1）与传统动物源胶原蛋白不同，本发明以低免疫原性胶原蛋白为原料，从根源上保证了材料的生物安全性，同时，低免疫原性胶原蛋白同样具有优异的生物活性，能够赋予透明质酸薄膜优异的生物活性；
（2）本发明发现透明质酸能够促进低免疫原性胶原蛋白的分子自组装行为，加速成膜；并且使用京尼平或EDC进行交联，使其结构致密，不仅提升其力学性能，对其保湿性能、保护创伤内环境也有极大益处，同时在实际应用中低免疫原性胶原蛋白不会被轻易释放，保证了薄膜材料优异的生物活性。
（3）本发明采用以分子自组装、交联法构建薄膜，能够特性设计薄膜中低免疫原性胶原蛋白的微观形貌与三维结构，使其更仿生胞外基质。
具体实施方式
下面通过实施对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出非本质的改进和调整。
实施例1
（1）透明质酸溶液的制备：取1g透明质酸加入到50ml pH为7.4的磷酸缓冲液中，22℃下搅拌至溶液完全澄清，配制成1份透明质酸水溶液。
（2）基于低免疫原性胶原蛋白/透明质酸的高强度，生物活性且保湿性能优异的致密医用薄膜的制备：向步骤（1）所得透明质酸溶液中加入低免疫原性胶原蛋白，控制低免疫原性胶原蛋白与透明质酸的质量比为0.5:1，22～40℃下缓慢搅拌0.5h，搅拌至清澈透明，冷却至室温后，加入0.5g京尼平溶液，反应24h，将所制备混合溶液称取30g均匀铺展在聚四氟乙烯板中，置于烘箱中，于37~40℃干燥24h。最后将其所成薄膜置于0~4℃下备用。制备得到基于低免疫原性胶原蛋白/透明质酸的高强度，生物活性且保湿性能优异的致密医用薄膜。
实施例2
（1）透明质酸溶液的制备：取1g透明质酸加入到200ml pH为7.4的磷酸缓冲液中， 80℃下搅拌至溶液完全澄清，配制成1份透明质酸水溶液。
（2）基于低免疫原性胶原蛋白/透明质酸的高强度，生物活性且保湿性能优异的致密医用薄膜的制备：向步骤（1）所得透明质酸溶液中加入低免疫原性胶原蛋白，控制低免疫原性胶原蛋白与透明质酸的质量为 1.5:1，在40℃下缓慢搅拌24h，搅拌至清澈透明，冷却至室温后，加入1g的京尼平溶液，反应24h，将所制备混合溶液称取80g均匀铺展在聚四氟乙烯板中，置于烘箱中，于40℃干燥72h。最后将其所成薄膜置于0~4℃下备用。制备得到基于低免疫原性胶原蛋白/透明质酸的高强度，生物活性且保湿性能优异的致密医用薄膜。
实施例3
（1）透明质酸的制备：取1g透明质酸加入到150ml pH为7.4的磷酸缓冲液中，60℃下搅拌至溶液完全澄清，配制成1份透明质酸水溶液。
（2）基于低免疫原性胶原蛋白/透明质酸的高强度医用薄膜的制备：向步骤（1）所得透明质酸溶液中加入低免疫原性胶原蛋白，控制低免疫原性胶原蛋白与透明质酸的质量比为1:1，37℃下缓慢搅拌6h，搅拌至清澈透明，冷却至室温后，加入2g的京尼平溶液，反应24h，将所制备低免疫原性胶原蛋白/透明质酸溶液称取50g均匀铺展在聚四氟乙烯板中，置于烘箱中，于40℃干燥48h。最后将其所成薄膜置于0~4℃下备用。制备得到基于低免疫原性胶原蛋白/透明质酸的高强度，生物活性且保湿性能优异的致密医用薄膜。
实施例4
（1）透明质酸溶液的制备：取1g透明质酸加入到50ml pH为7.4的磷酸缓冲液中，22℃下搅拌至溶液完全澄清，配制成1份透明质酸水溶液。
（2）基于低免疫原性胶原蛋白/透明质酸的高强度，生物活性且保湿性能优异的致密医用薄膜的制备：向步骤（1）所得透明质酸溶液中加入低免疫原性胶原蛋白，控制低免疫原性胶原蛋白与透明质酸的质量比为0.5:1，22～40℃下缓慢搅拌0.5h，搅拌至清澈透明，冷却至室温后，加入4ml 的MES活化0.5h，再加入1g的EDC及一定质量的NHS，使得NHS添加量与EDC添加量的摩尔比为1:2.5，反应24h，将所制备混合溶液称取30g均匀铺展在聚四氟乙烯板中，置于烘箱中，于37~40℃干燥24h。最后将其所成薄膜置于0~4℃下备用。制备得到基于低免疫原性胶原蛋白/透明质酸的高强度，生物活性且保湿性能优异的致密医用薄膜。
实施例5
（1）透明质酸溶液的制备：取1g透明质酸加入到150ml pH为7.4的磷酸缓冲液中， 80℃下搅拌至溶液完全澄清，配制成1份透明质酸水溶液。
（2）基于低免疫原性胶原蛋白/透明质酸的高强度，生物活性且保湿性能优异的致密医用薄膜的制备：向步骤（1）所得透明质酸溶液中加入低免疫原性胶原蛋白，控制低免疫原性胶原蛋白与透明质酸的质量为 1.5:1，在40℃下缓慢搅拌24h，搅拌至清澈透明，冷却至室温后，加入5ml的MES活化0.5h，再加入2g的EDC及一定质量的NHS，使得NHS添加量与EDC添加量的摩尔比为1:2.5，反应24h，将所制备混合溶液称取80g均匀铺展在聚四氟乙烯板中，置于烘箱中，于40℃干燥72h。最后将其所成薄膜置于0~4℃下备用。制备得到基于低免疫原性胶原蛋白/透明质酸的高强度，生物活性且保湿性能优异的致密医用薄膜。

Claims (7)

1.一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸医用薄膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将低免疫原性胶原蛋白溶液与透明质酸相混合，控制低免疫原性胶原蛋白用量为透明质酸质量的50%~150%，22～40℃下充分反应；至清澈透明后，加入低细胞毒***联剂充分反应；取充分反应的溶液制膜，得到基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸医用薄膜。
2.如权利要求1所述的一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸医用薄膜的制备方法，其特征在于：所述低细胞毒***联剂为京尼平溶液。
3.如权利要求2所述的一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸医用薄膜的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
1）将0.5～3.0质量份的透明质酸溶解到50～300体积pH为7.4的磷酸缓冲液中，50℃~80℃室温下搅拌至完全溶解，配制成1份透明质酸溶液；
2）将低免疫原性胶原蛋白与透明质酸按质量比（0.5~1.5）:1，将低免疫原性胶原蛋白加入到1份透明质酸溶液中，22~40℃下磁力搅拌反应0.5~24h，搅拌至清澈透明；冷却至室温后，加入0.5~2体积的京尼平溶液，反应24~48小时；移取基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸混合溶液均匀，铺膜，于37~40℃干燥24~72h，制备得到基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸医用薄膜；
上述步骤中，质量与体积的对应关系为1质量份：1体积=1g：1ml。
4.如权利要求1所述的一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸医用薄膜的制备方法，其特征在于：所述低细胞毒***联剂为包括4-吗啉乙磺酸MES、1-乙基-碳二亚胺盐酸盐EDC、及N-羟基琥珀酰亚胺NHS的组合物。
5.如权利要求4所述的一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸医用薄膜的制备方法，其特征在于：交联反应时，先加入4-吗啉乙磺酸MES进行活化，随后加入1-乙基-碳二亚胺盐酸盐EDC、及N-羟基琥珀酰亚胺NHS，充分反应。
6.如权利要求5所述的一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸医用薄膜的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
1）将0.5～3.0质量份的透明质酸溶解到50～300体积pH为7.4的磷酸缓冲液中，50℃~80℃室温下搅拌至完全溶解，配制成1份透明质酸溶液；
2）将低免疫原性胶原蛋白与透明质酸按质量比（0.5~1.5）:1，将低免疫原性胶原蛋白加入到1份透明质酸溶液中，22~40℃下磁力搅拌反应0.5~24h，搅拌至清澈透明；冷却至室温后，加入0.5~6体积的MES乙醇水溶液，搅拌均匀；加入EDC和NHS，使得EDC的添加量为0.5~2质量份、并使EDC与NHS摩尔比为1:2.5，反应24~48小时；移取基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸混合溶液，铺膜，于37~40℃干燥24~72h，制备得到基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸医用薄膜
上述步骤中，质量与体积的对应关系为1质量份：1体积=1g：1ml。
7.权利要求1~6任一项所述方法制备的基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性透明质酸医用薄膜。
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