与草鱼生长性状相关的SNP标记及其应用
技术领域
本发明属于分子生物技术领域,具体涉及与草鱼生长性状相关的SNP标记及其应用。
背景技术
草鱼(Ctenopharyngodon idella),隶属于鲤形目(Cypriniformes),鲤科(Cyprinidae),雅罗鱼亚科(Leuciscus),草鱼属(Ctenopharyngodon),是我国淡水养殖鱼类中养殖年产量最高的养殖品种。近年来,草鱼亲鱼遗传背景不清,多数繁殖场不遵守科学的种苗生产规程,选择个体小、性成熟早、亲缘关系近的草鱼作为亲本,致使养殖草鱼出现一定程度的种质退化现象,主要表现为生长速度减慢、抗逆性能下降等,制约草鱼养殖产业的健康发展。
草鱼的性成熟年龄为4-5年,育种周期较长。选育出生长速度更快的草鱼新品种可以有效的缩短育种周期进而大幅度的降低草鱼养殖成本。随着分子生物技术的快速发展,分子标记辅助育种技术有望是缩短草鱼育种周期和尽快培育出草鱼优良品种的一个重要途径。分子标记辅助育种技术是通过与目的基因紧密连锁或共分离的分子标记,对目的基因进行筛选,从而不受环境条件的影响,增加了选择的可靠性,提高育种效率。
单核苷酸多态性标记(Single nucleotide polymorphism,SNP)指的是单个核苷酸发生改变而引起的DNA序列多态性,具有数量多、密度大、遗传稳定性高等优点而被广泛应用。将这些遗传标记与生长性状相关联,从而实现在DNA水平上进行选择育种,有效的避免人为影响并提高选择育种的准确性,并且可实现在早期鉴定出具有优良性状的个体,筛选出优良的后备亲本,缩短育种周期,大大加快选育进程。
针对现有技术的不足,加强草鱼的种质资源挖掘利用,尽快培育出生长快速且经济性状优良的草鱼选育品种成为亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与草鱼生长性状相关的SNP标记及其应用,该分子标记可作为草鱼生长性状的可靠标记,便于进行早期选择,从而缩短世代间隔,提高选择强度,提高选育效率和准确性。
发明人发现,S1和S2位点在所测草鱼个体中存在四种单倍型,AACC、AACT、AGCT和AGTT基因型,分别命名为D1、D2、D3、D4,发现单倍型D4(AGTT)的基因型个体在体质量显著低于其他基因型草鱼个体。进而可以利用本发明SNP位点,去除AGTT基因型的个体,便可快速获得生长速度快的草鱼品种。
本发明的另一个目的在于,可去除生长缓慢个体,提供一种快速生长草鱼亲本的筛选方法。
本发明所采取的技术方案是:
本发明第一方面,提供草鱼生长性状相关的SLα基因组序列如SEQ ID NO:1。
本发明第二方面,提供一种草鱼生长性状相关的SNP标记,包括两个SNP位点S1和S2,所述S1位于前面所述SLα基因组序列的第2903位,且该位置处碱基R为A或G;所述S2位于前面所述SLα基因组序列中第8014位,且该位置处碱基Y为C或T。
本发明第三方面,提供草鱼SLα基因的cDNA序列如SEQ ID NO:2所示,其中第225位R为碱基A或G,第534位Y为碱基C或T。
本发明第四方面,提供用于扩增所述的SNP位点S1和S2所在基因片段的引物对,SNP位点S1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4;SNP位点S2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6;
用于检测前面所述的SNP位点S1和S2单倍型的延伸引物,用于检测S1位点延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:7,用于检测S2位点延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:8。
本发明第五方面,提供上述所述SNP位点在判断草鱼生长快慢中的应用。
本发明第六方面,提供上述所述SNP位点在筛选快速生长草鱼中的应用。
本发明第七方面,提供一种筛选快速生长草鱼的方法,检测草鱼SLα基因组序列SEQ ID NO:1的第2903位S1位点和第8014位S2位点是否为AGTT基因型,若是,则为缓慢生长的草鱼;否则,则为快速生长的草鱼。
根据本发明的实施例,包括如下步骤:
1)提取草鱼DNA;
2)以提取得到的DNA为模板,进行PCR扩增,检测第2903位S1位点和第8014位S2位点的基因型是否为AGTT。
根据本发明的实施例,步骤(2)所用到的PCR检测具体操作为:
用引物P1和P2对草鱼DNA进行初次PCR扩增,得到初次PCR产物A,
P1:5'-CAACTCTTGTTACTGTGTGTCCAA-3'(SEQ ID NO:3);
P2:5'-TGTTTCCTGCCTGATTTCTTAAAGT-3'(SEQ ID NO:4);
再将初次PCR产物A用引物P3进行延伸扩增,将所得产物经测序分析草鱼个体基因型;
P3:5'-CCAACAGGAGGAGATGTTTGTCCC-3'(SEQ ID NO:7)。
和/或
步骤(2)所用到的PCR检测具体操作为:
用引物P4和P5对草鱼DNA进行初次PCR扩增,得到初次PCR产物,
P4:5'-CGGTTTCTCCCCATCAGATG-3'(SEQ ID NO:5);
P5:5'-GAGACTGTCCGTCGTTTGG-3'(SEQ ID NO:6);
再将初次PCR产物用引物P6进行延伸扩增,确定草鱼第2903位S1位点和第8014位S2位点的基因型:
P6:5'-TGAAGGGATTCTGATGTCCTCGTC-3'(SEQ ID NO:8)。
根据本发明的实施例,所述初次PCR扩增的反应体系为:
初次PCR扩增反应程序为:94℃预变性3min;94℃变性15s,54℃退火15s,60℃延伸30s,24个循环;72℃延伸3min。
本发明的有益效果是:
(1)本发明大大降低草鱼亲本筛选的盲目性,可以快速获得生长速度快的草鱼个体。
(2)本发明筛选快速生长草鱼亲本的方法既保证了检测结果的可靠性,又无需繁琐操作进行测序分析,提高了处理效率和精确性,建立了有效地鉴定具有优良生长性状的亲本。该方法与传统的方法相比,具有目的性强,作用效果直接的优点,且操作简单、检测快速、检测成本低,便于广泛推广使用。
具体实施方式
草鱼生长性状相关的SLα基因组序列如SEQ ID NO:1。
一种草鱼生长性状相关的SNP标记,包括两个SNP位点S1和S2,所述S1位于前面所述SLα基因组序列的第2903位,且该位置处碱基R为A或G;所述S2位于前面所述SLα基因组序列中第8014位,且该位置处碱基Y为C或T。
草鱼SLα基因的cDNA序列如SEQ ID NO:2所示,其中第225位R为碱基A或G,第534位Y为碱基C或T。
用于扩增所述的SNP位点S1和S2所在基因片段的引物对,所述引物对分别具有SEQID NO:3和SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
用于检测所述的SNP位点S1和S2单倍型的延伸引物,用于检测S1位点延伸引物具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列,用于检测S2位点延伸引物具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
上述所述SNP位点在判断草鱼生长快慢中的应用。
上述所述SNP位点在筛选快速生长草鱼中的应用。
一种筛选快速生长草鱼的方法,检测草鱼SLα基因组序列SEQ ID NO:1的第2903位S1位点和第8014位S2位点是否为AGTT基因型,若是,则为缓慢生长的草鱼;否则,则为快速生长的草鱼。
根据上述所述的方法,包括如下步骤:
1)提取草鱼DNA;
2)以提取得到的DNA为模板,进行PCR扩增,检测第2903位S1位点和第8014位S2位点的基因型是否为AGTT。
进一步,步骤2)中所用到的PCR检测具体操作为:
用引物P1和P2对草鱼DNA进行初次PCR扩增,得到初次PCR产物,
P1:5'-CAACTCTTGTTACTGTGTGTCCAA-3'(SEQ ID NO:3);
P2:5'-TGTTTCCTGCCTGATTTCTTAAAGT-3'(SEQ ID NO:4);
再将初次PCR产物用引物P3进行延伸扩增,将所得产物经测序分析草鱼个体基因型;
P3:5'-CCAACAGGAGGAGATGTTTGTCCC-3'(SEQ ID NO:7)。
和/或
步骤2)中,所用到的PCR检测具体操作为:
用引物P4和P5对草鱼DNA进行初次PCR扩增,得到初次PCR产物,
P4:5'-CGGTTTCTCCCCATCAGATG-3'(SEQ ID NO:5);
P5:5'-GAGACTGTCCGTCGTTTGG-3'(SEQ ID NO:6);
再将初次PCR产物用引物P6进行延伸扩增,将所得产物经测序分析草鱼个体基因型;P6:5'-TGAAGGGATTCTGATGTCCTCGTC-3'(SEQ ID NO:8)。
进一步,所述初次PCR扩增的反应体系为:
初次PCR扩增反应程序为:94℃预变性3min;94℃变性15s,54℃退火15s,60℃延伸30s,24个循环;72℃延伸3min。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1与草鱼生长性状相关的SNP标记的获得
本申请研究发现,根据草鱼SLα(Somatolactin alpha)基因序列如SEQ ID NO:1所示,其中S1和S2位点在所测草鱼个体中存在四种单倍型,AACC、AACT、AGCT和AGTT基因型,分别命名为D1、D2、D3、D4。
本实验用于关联分析的草鱼,样本数为250尾的随机群体为同一批繁殖、同池养殖,且采样时间一致,因此在建立模型时不考虑时间、环境及人工饲养条件的差异。草鱼单倍型在随机群体中频率分布见表1。
表1草鱼单倍型在随机群体中频率分布
SNP标记与性状的关联分析
利用SPSS 17.0软件一般线性分析,分析SNP位点的不同基因型与草鱼随机群体中主要生长性状(体质量)之间的关联性。草鱼单倍型个体间生长性状的多重比较结果如表2所示。
表2草鱼单倍型个体间生长性状的多重比较
注:表中数值为平均值±标准误差,同一行上标不同字母表示差异显著(P<0.05)。
从以上数据可知,基因型D4与其他三种基因型在体质量上存在显著差异(P<0.05),基因型D1、D2和D3之间没有显著性差异,基因型D4在体质量上显著低于D1、D2和D3三种基因型。故本发明发现若去除D4基因型个体,便可快速获得生长速度快的草鱼品种,与预期一致,即可快速、准确地筛选出所需要的快速生长的草鱼亲本。
实施例2筛选快速生长草鱼的方法
利用实施例1选取的SNP位点对快速生长草鱼亲本进行筛选,包括如下步骤:
(一)引物序列:
根据草鱼SLα基因组序列设计了两对引物分别对SNP位点S1和S2所在基因片段进行PCR扩增,设计并合成的引物如下:
SNP位点S1:
P1:5'-CAACTCTTGTTACTGTGTGTCCAA-3'(SEQ ID NO:3);
P2:5'-TGTTTCCTGCCTGATTTCTTAAAGT-3'(SEQ ID NO:4);
引物预期扩增1条DNA带,大小82bp。
SNP位点S2:
P4:5'-CGGTTTCTCCCCATCAGATG-3'(SEQ ID NO:5);
P5:5'-GAGACTGTCCGTCGTTTGG-3'(SEQ ID NO:6);
引物预期扩增1条DNA带,大小90bp。
(二)样品处理(碱裂解法):
1、剪取待检测鳍条10-20mg,装入干净的EP管中;
2、加入180μL的50mmol/L NaOH溶液,水浴20min(常温),期间震荡数次;
3、加入20μL的1mol/L Tris-HCL溶液(PH=8.0),充分涡旋震荡;
4、将样品管放入离心机12000rpm离心10min,吸取上清液,备用。
(三)引物P1和P2、P4和P5初次扩增的PCR体系:
初次PCR扩增的反应体系和扩增条件为:
(四)引物P1和P2、P4和P5初次扩增的PCR扩增程序:
94℃3min;94℃15s、54℃15s、60℃30s,循环24次;72℃3min。
(五)对纯化的PCR产物进行单碱基延伸,反应体系为:
SNP位点S1的延伸引物序列为:
P3:5'-CCAACAGGAGGAGATGTTTGTCCC-3'(SEQ ID NO:7)。
SNP位点S2的延伸引物序列为:
P6:5'-TGAAGGGATTCTGATGTCCTCGTC-3'(SEQ ID NO:8)。
延伸反应条件为:
96℃1min;96℃10s、52℃5s、60℃30s,循环30次。
(六)取1μl延伸产物,加8μl上样loading,95℃变性3min,立即冰水浴。
在测序仪上,对延伸产物大小及峰的颜色进行检测,检测草鱼SLα基因组序列如SEQ ID NO:1的S1和S2位点是否为单倍型D4(AGTT)基因型,若是,则为缓慢生长的草鱼;若否,则为快速生长的草鱼。
本实施例检测方法大约可以在10个小时内操作完成,并且可以同时对多个样本进行检测,能为接下来要进行的草鱼优良品种选育和鉴定提供快速准确的检测结果。我们通过去除劣势基因型的个体从而获得快速生长的草鱼个体,是在DNA水平上对草鱼种质质量的评估,目的性更强。用该方法检测一个样品所需的成本大约为3元,成本较低,适合推广使用。
综上所述,申请人研究发现,基因型D4与其他三种基因型在体质量上存在显著差异(P<0.05),基因型D4在体质量上显著低于D1、D2和D3三种基因型,故若去除D4基因型个体,便可准确地去除掉生长缓慢的草鱼个体,筛选出所需要的快速生长的草鱼亲本。因此,根据草鱼SLα基因组序列设计引物,建立了有效地鉴定具有优良生长性状的亲本。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所、广东梁氏水产种业有限公司
<120> 与草鱼生长性状相关的SNP标记及其应用
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8188
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgaaaggcc tgcatatgaa ggagtctgag gagaaggcca cgtctcttct tacactcaag 60
caggtgagtt catgaatcta tggatctctg agaacacctc tgactgctat ataaaggcag 120
tgtgtgcctc tagtacaggc aaacaatctg tgcaaaatga acagggttaa aggtacattg 180
actccagatc tttattagat ttttcaagga aatctgccta cagctatagc ctgaaagaac 240
tgccttagct ttgtaaagaa cacagtgctc gcttattaaa catatttcaa atattcagtc 300
tacaggaagc aaaagtattt cttaaacaga cttttcaaag catgtttctt cagcaaaatg 360
atcttgtcac atgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtttcatt 420
agttctgcag gtctggctgt gttgtgtgtc tctgtgccgc ttctgggttt ctcatgccgt 480
tcctctggac tgcaaggacg agacgggatc tctcacccac tgtacttcaa tctcccaaga 540
gaaacttcta gatcgtgtca tccaacacgc agagctcatc taccgtgtct ctgaagagtc 600
atgcactctt tttgtgagtg aaccatctct gtcaatcaaa gtctgttgat ctttactatt 660
aacttaagtc ttgtattaca tgttcactgt gtagcacaac atatgaaatg atttattaca 720
gcatattaag ttgtatttta gtttgtaaat atatgaaatg ttgctaaatc tctgcatgct 780
ttttggttac acttcatttt gatggtcctc ttatcgttga acctacagtt gcatgaaaaa 840
atttgggaac cacttgtaga atctgtgaaa atgtgaataa ttttaacaaa ataagaggga 900
tcatacaaaa tgtatgttat tttttattta gtactgtcct gattaagata ttttacataa 960
acgatgttta cataaagtct acaagacaaa aaaaaaaata gctgaattta tgaaaataat 1020
cctgttcaaa agtttgtgaa cccttgattc ttaatactgt gtgtggttac ctggatgatc 1080
tacgactgtt tttgtttttg ttttgttgtg tgatggttgt tcccttgttt gtcctgagca 1140
gttaaactga gctctgttct tcagaaaaat ccaccacgtc ctgcagattt caatgatttt 1200
tgtatatttg aaccctttcc agcagtgact gaatgatttt gagatccatc ttttcacact 1260
gaggacaact gagggactca aacacaacta ttaaaaaagg ttcaaacatt cactgatgct 1320
ccagaaggaa acacgatgca ttaagagtca gggggtgaaa acatttttga atttgaagat 1380
caatgtaaat tgtacttaat ttatcttccg ggaaacatgc aagtatcttc tgttgctttc 1440
gaagggcaat actaaatgag aaaaaaagaa aaaaaaattt caacaaaata agaaaaattt 1500
ggacatcttt atcctgttca aaagttttca ccccccggct cttaatgcat catgtttcct 1560
tctgaagcat cagtgaatgt ttgaaccttt tttaatagtt gtgtttgagt ccctcagttg 1620
tcctcagtgt gaaaagatgg atctcagaat catacagtca ctgctggtaa gggttcaaat 1680
atgcaaaata tgcttgaaaa ctgaagaatc tgcaggacct ggaggatttt tctgaagaac 1740
agagctcagt ttaactgctc agaacaaaca agggactcat gaagaaccat cacaaaacaa 1800
caaaaaaaaa aaacagttgt ggatcatcca ggtaaccaca cacagcatta agaatcaatg 1860
gttcacaaac ttttgaacaa ggttatttta ataaattaag cttttttttt tttttttttt 1920
tttttttttt tgtgggctat atgtgaacat cttttatgta atatatctta ctcaggacag 1980
tactaagtaa aaaaataaca tgcattttgt attgatctct tttattttgt taaacttact 2040
cacattttca cagattctgc aagtggttcc catacttttt catgcaactg tacatgtcaa 2100
ctcactctca ttaaagtatt cgtagactgt tagcttaggg ttatggttag tagaataagt 2160
tgacatgtac ttgcaaagtt acttatagtc agtagaatgt ctgttgggaa gcatcaaaat 2220
aaagtgttag cagatattaa gcagaccgtc gactaatact cagatagttg acttgttgca 2280
aagttactta tagccgacag aaggtctaaa ggggagcatc aaaataaagt gttacctgtt 2340
tgtttgtttt gtttttttcc ttctgaaaaa ataaataaat aaataaaata aaaaaaataa 2400
aaataaatca acagaatcag ataaccaatt tcatttcatc tcatcagctg agatattatt 2460
acccagactg atagcaagtt ttctttcatt taatgtcatt attctgtctc atttaatcaa 2520
ccttgcctca ttattgccgg ctgtgtgcat gactttgaat taatgagact ataatcttaa 2580
tgaataatca gacactgtga gatgcctatc agtcttgtta gattatttca ccgttcttag 2640
gtggattgtc tcctcgcagt gggaaaacat gcagagaaca ctggtataat ttcatttctc 2700
atttcaaatc tccattcaga tatttatatg gaaagctttt ctaccacctg gtgtgcgtga 2760
attattggca ctgatctgaa actcttaaat tagtcaaact gaatgcagcc taaatgacac 2820
attcacaacc cttaaaacag ataaacaaac agtgcagtca actcttgtta ctgtgtgtcc 2880
aacaggagga gatgtttgtc ccrtaccctc tgcatacttt aagaaatcag gcaggaaaca 2940
tgtgccacag caagcccttc ccgatcccag gctccaagag tgagattcag cagatatcgg 3000
tgaggagatg ggagtgggtc gccttagcgt tgtgtgtttc attgattagt aattggaaat 3060
acactgcaaa aaatggaaag gaggaaggaa atatcaaaat taagaaactg atatgatcat 3120
acatatcaaa ctagctaaaa catctcgagt ctataaagcc caaagtatac ttctttttta 3180
tcgaatgcat agcttttcaa agtactccat ttgacagcat gcgtgaatgc atgcggtcaa 3240
cacatgcgct ctagaaagtt tcatctttgt ccagtgtctg ctctattttc tccagaagtt 3300
attaccgata aaaatgtgtt tgtattcttt taaattacaa gttgcagctc tctcatgacc 3360
ccctcacaca agagcttgtc agtgaaggtg tcacttgttg ttgcacggta ttttattgtt 3420
gttgttccgt tttagtttcg ttttctactg tgaaacaacg gcccaggcca gtactgccac 3480
cttgtggaaa aactgattag tgcaaaacaa attcaatgca cacgtgtgac ctgcgagctg 3540
acctccatta caaaaaatat ttgattactg agtattttca tcttgttttc cagtacaaat 3600
atgtaaagat attcttaaat caagatgcat gggaagcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3660
aatctgaaaa atatatcaaa attaagtgac tttataattg aaaaaaatct gccaaagggg 3720
taagaaaaaa atcttgtttt ctcttgaaat taagcttatt tttctgaccc cactggcaga 3780
tttttgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtt ttatgcataa actcacttta 3840
tttcgacaca tttttcagaa aataagactt actatcgtaa gtcatttttc ttgtcaagta 3900
aatgtatttt ggtttaagaa tgtttagata tttctactaa aaaaacaaga caaaaatact 3960
aagatgatca ttttttgcag tgtataagct tgtgctgtaa agtgagaagc cttatagatt 4020
cgagagtttt cagcctccca gacaagtttt agcttgttta ataagtatcg tagttcttaa 4080
ttttgatatt tcggtctatt tttttttttt tttttttttt ttttgtggat tatgtttctg 4140
tggatcttca tttatggtga cacttgaaag tacatctttt aaattaagcg atacaatgca 4200
aaatagtgtc ttaatctgtg tttttttcct tgctttccac taataagaat ctaaacatgc 4260
ttaaaaccgt aaacttaaga gattaggatt tcatagaaga atacattttg ttttcatctt 4320
gaattatgtt tgtttattta tttatttatt tatttattta ttagttaaca aatagtttct 4380
ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctcaattaat taattaatta 4440
attaattttt attttttgct ggtgttattc ttaaaatgcc acttgaaata ttgagaatat 4500
gcatgttaat ctccttaaac agcatccaca tccatgcatt tgaatacagg ttaagcgttc 4560
actgtaaagc gttcactcga accatgtttt ccagccctga acaaatgagc tctgtttaac 4620
tggtattgtg tgaaagactg cgactacagg ctgtcttgtt catctaatgc actattgtgt 4680
gacagctctt tcaactgaga gactaacctg tctttagaac aaaattgcct ctatcactaa 4740
atggactgtt ttcttttcaa tatatctttt tttttttttt tttttttttt ttttcacctg 4800
ctaaaataga tttcaacatt ccctgcaaag tgctttagct tcttcctagg taatgagtct 4860
tgtcacgcta accactgtac gcagccaaag tagacacata tttccatttg atttagacat 4920
tttacagtct ctgaaaattc ttctggagct acagtatata aaaaacattg caaaaacatt 4980
gaaaatggat tacctcccct aacctcggtt gtgctgcttt atgaaggctg tagtcttgac 5040
tactgtattc acaatgttta gtgcgtttaa agtttggagt ctgtgaatgg ggtcacatta 5100
tattattatg tttgtttaca cctgagatac acttaaaatg ctaagtcaaa aacagtcata 5160
tatatatttt tttatgtcat ttccatctct ctctgacctt tagtattaaa caggacatat 5220
ttgtttgcga ctgtgcttat aaatgccctt tccgcatgtg aaatcaaggc ttgcatgtca 5280
tgtccagaat agtttctgat gcctcatttt tcaacaacag cctctttgca atgtctgctg 5340
acacgggttc acaaaataaa ttctgaaatg ttaaggtcaa actgacgtaa caaacctctt 5400
atcggttgtt gtttgcaaac tggatttgtg tatatctttt tctagtgttt aggaataatt 5460
cgccatgact tggtggtctg gtttctgaac accaaacatt cttcattgaa aatgcaggtg 5520
attgtgtgtt aatgcacttg tgtttctgaa gtcagaagtt cagaaagtgt catttttgca 5580
gcttacactc ttatgggcca ttcacacaga acatgttttt ccattccact gtgctacttt 5640
tttttcattg tttttcccaa tgtaaacatg cgttagatgg acgtctttaa ctgttgcgct 5700
gctgcgcgtg tgtccgttaa gtgcatgaga ccgtaggtca tcccatttgt cattttaaat 5760
ttcagaagaa atttccgcaa cagtcttctt cttgcggcgt tacatcacaa aagtgtggac 5820
tcgtaggaag accacgagtg tttagggtgc catttgggaa aggaccatag tatgcaaaaa 5880
cagtacacca acatagtagt atgtccgaat acatagtatt caaaaaacag caggcgaaaa 5940
gtgacatact acttccacag ggattctgaa gtgagcattc gatggacaat ttactatccc 6000
gtgaggtcac gggagggaat ttatgaatag aagtgaagcg atgcaactga cactggtagg 6060
tcacatgaca gtaacaacat ggtgaatgca gtatgtcaga atttcattca tactacccat 6120
attcttacta tatataacat acttttttaa cggtcacaaa gtaaaatcaa atttagtacc 6180
tactcagaca gtacgcgact ccagtcacag caatggcatt ctaaaaaagc gttgctcaag 6240
ttaaaagaag ttcaactttc aaaaaacgca tctctagacc tcacattttt gtcgttccac 6300
agacctacgt ctcgcatttt taacagcaaa atgtgctctg tgaacctgtc cttcacacaa 6360
aatgcatttt tccattccac tgtgctactt ttctattgtc tttcaatgta aacgcgcgag 6420
acagatgtgt ttcaccgttg cgctcgtgtc tttagcagcg tctcgtgcat gatgcgttgt 6480
tctaaaaatg ctgcactaaa gttaaaataa gcttttaact tctaaaaaaa cgcatctcta 6540
cacttgtttt tttgttttct gcttcactga cagcgtctcg catttataac agcaaaaaca 6600
cgttctgtgt gaatggcctc ttagaagaaa agggtctata tagaacctta acgggttctg 6660
tcaggcattt catatttaga aacttttaaa gggtcagttc acccaaaaat gaaatttctg 6720
tcattaatta ctcaccctca tgtcgttctt tggaacacaa attaagatat ttttgatgaa 6780
atccgagagc tttctgacct ccctatgaac agcataacca atttcaaggc ccagaaagac 6840
atcactaaaa tactcaatgt gactacagtg gttcaacctc aatgttatga agcgacgaga 6900
atactttttg tgcgcaaaaa cgaaacaaaa ataatgaaag agggcggagc ttcatcagct 6960
cgcacttcgg ttgctcaaca acaacaaagc tggagaatct cacgcagcca aaatgaggat 7020
tgtcagtaac ggtgttcagc cttacattgt tcaaaccggg tgcaaatcca gcattgaatt 7080
gaccctcgtt tgtgaagcag tccgacgtaa aatgacggca tgacaataat tagtggataa 7140
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tcttttgtgc aaatccagca ttgaattgac cctcgtttgt gaagcagtcc gacgtaaaat 7260
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