CN110041422B

CN110041422B - 大口黑鲈生长相关的snp位点及其应用

Info

Publication number: CN110041422B
Application number: CN201810037972.6A
Authority: CN
Inventors: 李胜杰; 樊佳佳; 姜鹏; 白俊杰; 孙建国; 吴建开
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2018-01-16
Filing date: 2018-01-16
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2038-01-16
Also published as: CN110041422A

Abstract

本发明公开了大口黑鲈生长相关的SNP位点及其应用，所述生长相关的SNP位点位于HSC70‑1基因序列第821、2804位碱基。本发明发现在HSC70‑1的C+821G位置存在等位基因C和等位基因G，组成三种基因型CC、GC和GG，在A+2804T位置存在等位基因A和等位基因T，组成三种基因型AA、AT和TT。当第821和2804碱基位置基因型为CC和TT的个体的生长性状明显优于其他基因型的个体。利用该现象将生产中保留CC和TT基因型的大口黑鲈亲本，去除其他基因型的个体，便可快速获得生长速度快且遗传稳定的大口黑鲈品种，即本发明SNP位点可应用于快速生长大口黑鲈亲本的筛选。

Description

大口黑鲈生长相关的SNP位点及其应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及大口黑鲈生长性状关联的SNP位点及其应用。

背景技术

大口黑鲈(Micropterus salmoides L.)，又称加州鲈，原产于北美洲，具有适应性强、生长快、病害少、耐低温、生长周期短以及味道鲜美等优点，是重要的淡水养殖鱼类之一。1983年从中国台湾引种到广东省，现在全国大部分地区均有养殖。但是，引种30多年来，由于生产单位不注重亲本留种须遵守的操作规程，也没能定期从原产地补充和引进亲本，导致养殖大口黑鲈的遗传多样性降低，从而使生产性能也降低，主要表现在生长速度下降、饵料转化效率低、抗病力也大幅下降。其中，生长速度关系到大口黑鲈产量的高低，养殖效益的大小。大口黑鲈生长退化的趋势直接制约着大口黑鲈养殖业的发展。因此，改良大口黑鲈生长速度的工作非常重要。

挑选优质亲鱼是提高养殖鱼类生长速度的主要方法之一，其目的是为了改变养殖群体的遗传结构，使后代获得更快的生长速度、更好的抗病能力的遗传特点。在生产中，其传统方法是挑选个体较大、身体健壮的鱼作为留种亲本，即根据表型来决定亲鱼是否留种。这种方法方便、快捷、简单，但受人为因素影响很大，加上大口黑鲈属于肉食性为主的鱼类，掠食性强，饵料不足是会互相残食，致使其生长悬殊较大。如此可见，仅从表型判断大口黑鲈亲本质量往往达不到理想的效果。随着分子生物学和遗传学的发展，已涌现出很多种遗传标记，如AFLP、RAPD、SSR、SNP等标记，其中，SNP标记因分布广泛，适宜高通量自动化分析，遗传稳定，日益成为遗传育种研究中首选的遗传标记。若这些遗传标记能与生产性状相关联在一起，即可实现从DNA水平上进行选择育种，克服了传统方法受人为因素影响大的不利因素，提高了选择的准确性，并且可实现在早期鉴定出具有优良性状的个体，筛选出优良的后备亲本，从而缩短育种周期，加快育种进程。通过发现与大口黑鲈快速生长相关的分子标记，提高快长亲本的筛选效率。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种与大口黑鲈生长性状相关的SNP位点。

本发明的另一个目的在于提供一种筛选快速生长大口黑鲈亲本的方法。

本发明所采取的技术方案是：

大口黑鲈HSC70-1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述所述大口黑鲈HSC70-1的基因序列为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，其第821位S为碱基C或G，第2804位W为碱基A或T。

上述所述大口黑鲈HSC70-1基因序列在判断大口黑鲈生长快慢中的应用。

大口黑鲈生长速度相关的SNP位点，其位于HSC70-1基因序列SEQ ID NO：2所示的第821位碱基、第2804位碱基。

上述所述SNP位点在判断大口黑鲈生长快慢中的应用。

上述所述SNP位点在筛选快速生长大口黑鲈中的应用。

一种筛选快速生长大口黑鲈的方法，检测大口黑鲈HSC70-1基因序列第821位碱基处的SNP位点是否为CC纯合体，若是，则为快速生长的大口黑鲈；或者检测HSC70-1基因序列第2804位碱基处的SNP位点是否为TT纯合体，若是，则为快速生长的大口黑鲈。

进一步的，上述所述方法，包括如下步骤：

1）提取大口黑鲈DNA；

2）以提取得到的DNA为模板，PCR检测大口黑鲈HSC70-1基因序列第821、2804位碱基处的SNP位点是否分别为CC、TT纯合体。

进一步的，所述PCR检测的具体操作为，分别利用引物P1F和P1R、P2F和P2R对大口黑鲈DNA进行初次PCR扩增，得到初次PCR产物，

P1F：5'- TGAAGCCTACCTCGGAAAAGT -3'（SEQ ID NO.3），

P1R：5'- AGCATCCTTAGTGGCCTGGCGC -3'（SEQ ID NO.4），

P2F：5'- TCCACCAGCTTATCAGACTGT -3'（SEQ ID NO.5），

P2R：5'- GGTCAACCCTCCAAGTAACTT -3'（SEQ ID NO.6）；

再将初次PCR产物分别用引物P1和P2进行延伸扩增，将所得产物经测序分析，确定大口黑鲈HSC70-1基因序列第821、2804位碱基处的SNP位点是否分别为CC、TT纯合体；

P1：5'- TTACTTAGCATAGCTCTGGACA -3'（SEQ ID NO.7），

P2：5'- CTGTAGGGGGTAACTGAAGGGT -3'（SEQ ID NO.8）。

进一步的，初次PCR扩增的反应体系为：

DNA 1μl

10×buffer 1.5μl

25mmol 的MgCl₂ 1.5μl

dNTP 0.3μl

上游引物 0.15μl

下游引物 0.15μl

Taq酶 0.3μl

H₂O 补至15μl；

初次PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸30s，24个循环；72℃延伸3min。

进一步的，延伸扩增的反应体系为：

初次PCR产物 2μl

Snapshot Mix试剂 1μl

P1引物 2μl

P2引物 2μl

水补至 6μl；

延伸扩增反应程序为：96℃预变性1min；96℃变性10s，52℃退火5s，60℃延伸30s，30个循环。

本发明的有益效果是：

（1）本发明将生产中保留CC和TT基因型的大口黑鲈亲本，去除其他基因型的个体，便可快速获得生长速度快且遗传稳定的大口黑鲈的品种。该方法与传统的方法相比，具有目的性强，作用效果直接的优点，且操作简单、检测快速、检测成本低，便于广泛推广使用。

（2）本发明大大降低了大口黑鲈亲本筛选的盲目性，可以快速获得生长速度快且遗传稳定的大口黑鲈个体。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1 与大口黑鲈生长性状相关的SNP标记的获得

本申请研究发现，大口黑鲈热激蛋白HSC70-1（heat shock cognate protein 70）的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，大口黑鲈HSC70-1基因编码区序列全长为3382 bp（SEQID NO：2），由8个外显子和7个内含子所构成。在大口黑鲈热激蛋白HSC70-1基因序列（SEQID NO：2）的第821位和2804位分别发现一个SNP位点，经过Snapshot方法分型发现第821位碱基位置存在等位基因C和等位基因G，组成三种基因型CC、GC和GG；在第2804位碱基位置存在等位基因A和等位基因T，组成三种基因型AA、AT和TT。

本实验用于关联分析的样本数为430尾的随机群体为同一批繁殖、同池养殖，且采样时间一致，因此在建立模型时不考虑时间、环境及人工饲养条件的差异。大口黑鲈HSC70-1基因第821位、2804位处不同基因型在随机群体中频率分布分别见表1和2。其中，第821位的SNP位点为CC纯合体的基因型频率较低为7.21%，第2804位的SNP位点为TT纯合体的基因型频率较低，也为7.21%。

表1大口黑鲈HSC70-1基因第821位点不同基因型在随机群体中频率分布

表2大口黑鲈HSC70-1基因第2804位点不同基因型在随机群体中频率分布

SNP与性状的关联分析

大口黑鲈HSC70-1基因第821位、2804位处不同基因型个体间生长性状的多重比较结果分别见表3和表4。第821位的CC基因型个体测量的5个生长性状(体质量、全长、头长、体高、尾柄长)的平均表型值均高于CG型和GG型个体的均值，其中CC基因型个体分别与CG和GG基因型个体在体质量和全长上存在显著差异(P＜0.05)。第2804位的TT基因型个体测量的5个生长性状(体质量、全长、头长、体高、尾柄长)的平均表型值均高于AT型和AA型个体的均值，其中TT基因型个体分别与AT和AA 基因型个体在体质量和全长上存在显著差异(P＜0.05)。

上述关联分析结果表明，本发明大口黑鲈HSC70-1基因的SNP位点所构成的基因型对体质量和全长性状有显著影响（P<0.05），基因型为CC和TT的个体的生长性状明显优于其他基因型的个体。

表3 HSC70-1基因第821位点不同基因型个体间生长性状的多重比较

表4 HSC70-1基因第2804位点不同基因型个体间生长性状的多重比较

从表1～4中的数据可知，HSC70-1基因序列（SEQ ID NO：2）的第821位和2804位的SNP位点与大口黑鲈生长性状密切相关。通过检测大口黑鲈HSC70-1基因序列（SEQ ID NO：2）的第821位处的SNP位点是否为CC纯合体，或者检测第2804位处的SNP位点是否为TT纯合体，即可快速、准确地筛选出所需要的快速生长的大口黑鲈亲本。

实施例2一种筛选快速生长大口黑鲈的方法

利用上述的SNP位点对快速生长大口黑鲈亲本进行筛选，包括如下步骤：

（一）引物序列：

根据大口黑鲈热激蛋白HSC70-1基因序列设计了两对引物进行PCR扩增，设计并合成的引物如下：

P1F：5'- TGAAGCCTACCTCGGAAAAGT -3'（SEQ ID NO.3），

P1R：5'- AGCATCCTTAGTGGCCTGGCGC -3'（SEQ ID NO.4），

P2F：5'- TCCACCAGCTTATCAGACTGT -3'（SEQ ID NO.5），

P2R：5'- GGTCAACCCTCCAAGTAACTT -3'（SEQ ID NO.6）；

引物预期扩增2条DNA带，即SEQ ID NO：9（大小为176bp）和SEQ ID NO：10（大小为222bp）。

（二）样品DNA提交（碱裂解法）：

1、剪取待检测大口黑鲈鳍条10-20 mg，装入干净的EP管中；

2、加入180 µL的50 mmol/L NaOH溶液，水浴20 min（常温），期间震荡数次；

3、加入20 µL的1mol/L Tris-HCL溶液（PH=8.0），充分涡旋震荡；

4、将样品管放入离心机12000 rpm离心10 min，吸取上清液，得大口黑鲈基因组DNA，备用。

（三）引物初次扩增的PCR体系：

初次PCR扩增的反应体系和扩增条件为：

DNA	1μl
		10×buffer	1.5μl
25mmol 的MgCl2	1.5μl
		dNTP	0.3μl
上游引物（P1F或P2F）	0.15μl
		下游引物（P1R或P2R）	0.15μl
Taq酶	0.3μl
		H2O	补至15μl

（四）引物初次扩增的PCR扩增程序：

（五）对纯化的PCR产物进行单碱基延伸

使用Snapshot方法用初次获得PCR产物为模板，使引物延伸一个碱基在多态位点终止，在测序仪上检测，根据峰的颜色可知多肽位点的碱基是否为CC和TT。

延伸反应体系为：

纯化PCR产物 2μl

Snapshot Mix 试剂 1μl

延伸引物P1 2μl

延伸引物P2 2μl

水补至 6μl。

延伸引物序列为： P1：5'- TTACTTAGCATAGCTCTGGACA -3'（SEQ ID NO.7）和P2：5'- CTGTAGGGGGTAACTGAAGGGT -3'（SEQ ID NO.8）。

延伸反应条件为：

（六）在测序仪上，对延伸产物大小及峰的颜色进行检测，确定待测亲本的HSC70-1基因序列第821位碱基处的SNP位点是否为CC纯合体，若是，则为快速生长的大口黑鲈；或者检测HSC70-1基因序列第2804位碱基处的SNP位点是否为TT纯合体，若是，则为快速生长的大口黑鲈。

本检测方法可以在10个小时内操作完成，并且可以同时对多个样本进行检测，能为接下来要进行的大口黑鲈优良品种选育和鉴定提供快速准确的检测结果。我们通过对优势等位基因的鉴定，是在DNA水平上对大口黑鲈种质质量的评估，目的性更强。用该方法检测一个样品所需的成本大约为3元，成本较低，适合推广使用。

综上所述，申请人研究发现，在大口黑鲈热激蛋白HSC70-1基因序列的C+821G位置和A+2804T位置分别发现一个SNP，经过Snapshot方法分型发现在C+821G位置存在等位基因C和等位基因G，组成三种基因型CC、GC和GG，在A+2804T位置存在等位基因A和等位基因T，组成三种基因型AA、AT和TT。在检测的随机群体实验中发现，两个SNP位点对体质量和全长性状有显著影响，其在821碱基位置和2804碱基位置基因型为CC和TT的个体的生长性状明显优于其他基因型的个体。因此，根据大口黑鲈热激蛋白HSC70-1基因序列设计引物，建立了有效地鉴定具有优良生长性状且遗传稳定的亲本。利用本方法将生产中保留CC和TT基因型的大口黑鲈亲本，去除其他基因型的个体，便可快速获得生长速度快且遗传稳定的大口黑鲈品种。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 大口黑鲈生长相关的SNP位点及其应用

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 650

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Lys Gly Pro Ala Val Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser

1 5 10 15

Cys Val Gly Val Phe Gln His Gly Lys Val Glu Ile Ile Ala Asn Asp

20 25 30

Gln Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Tyr Val Ala Phe Thr Asp Ser Glu

35 40 45

Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala Lys Asn Gln Val Ala Met Asn Pro Thr

50 55 60

Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys Arg Leu Ile Gly Arg Arg Phe Asp Asp

65 70 75 80

Thr Val Val Gln Ser Asp Met Lys His Trp Pro Phe Asn Val Ile Asn

85 90 95

Asp Asn Thr Arg Pro Lys Val Gln Val Glu Tyr Lys Gly Glu Thr Lys

100 105 110

Ser Phe Tyr Pro Glu Glu Val Ser Ser Met Val Leu Thr Lys Met Lys

115 120 125

Glu Ile Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Lys Thr Val Asn Asn Ala Val Ile

130 135 140

Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ser Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp

145 150 155 160

Ala Gly Thr Ile Ser Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile Ile Asn Glu Pro

165 170 175

Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Lys Val Gly Ser Glu

180 185 190

Arg Asn Val Leu Ile Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser

195 200 205

Ile Leu Thr Ile Glu Asp Gly Ile Phe Glu Val Lys Ser Thr Ala Gly

210 215 220

Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Asn Arg Met Val Asn His

225 230 235 240

Phe Ile Ala Glu Phe Lys Arg Lys Tyr Lys Lys Asp Ile Ser Asp Asn

245 250 255

Lys Arg Ala Val Arg Arg Leu Arg Thr Ala Cys Glu Arg Ala Lys Arg

260 265 270

Thr Leu Ser Ser Ser Thr Gln Ala Ser Ile Glu Ile Asp Ser Leu Tyr

275 280 285

Glu Gly Val Asp Phe Tyr Thr Ser Ile Thr Arg Ala Arg Phe Glu Glu

290 295 300

Leu Asn Ala Asp Leu Phe Arg Gly Thr Leu Asp Pro Val Glu Lys Ser

305 310 315 320

Leu Arg Asp Ala Lys Met Asp Lys Gly Gln Ile His Asp Ile Val Leu

325 330 335

Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys Ile Gln Lys Leu Leu Gln Asp

340 345 350

Phe Phe Asn Gly Lys Glu Leu Asn Lys Ser Ile Asn Pro Asp Glu Ala

355 360 365

Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Ile Leu Ser Gly Asp Lys

370 375 380

Ser Glu Asn Val Gln Asp Leu Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser

385 390 395 400

Leu Gly Ile Glu Thr Ala Gly Gly Val Met Thr Val Leu Ile Lys Arg

405 410 415

Asn Thr Thr Ile Pro Thr Lys Gln Thr Gln Thr Phe Thr Thr Tyr Ser

420 425 430

Asp Asn Gln Pro Gly Val Leu Ile Gln Val Tyr Glu Gly Glu Arg Ala

435 440 445

Met Thr Arg Asp Asn Asn Leu Leu Gly Lys Phe Glu Leu Thr Gly Ile

450 455 460

Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile

465 470 475 480

Asp Ala Asn Gly Ile Met Asn Val Ser Ala Val Asp Lys Ser Thr Gly

485 490 495

Lys Glu Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn Asp Lys Gly Arg Leu Ser Lys

500 505 510

Glu Asp Ile Glu Arg Met Val Gln Glu Ala Glu Lys Tyr Lys Ala Glu

515 520 525

Asp Asp Val Gln Arg Asp Lys Val Ser Ala Lys Asn Gly Leu Glu Ser

530 535 540

Tyr Ala Phe Asn Met Lys Ser Thr Val Glu Asp Glu Lys Leu Ala Gly

545 550 555 560

Lys Ile Ser Asp Glu Asp Lys Gln Lys Ile Leu Asp Lys Cys Asn Glu

565 570 575

Val Ile Gly Trp Leu Asp Lys Asn Gln Thr Ala Glu Arg Asp Glu Tyr

580 585 590

Glu His Gln Gln Lys Glu Leu Glu Lys Val Cys Asn Pro Ile Ile Thr

595 600 605

Lys Leu Tyr Gln Ser Ala Gly Gly Met Pro Gly Gly Met Pro Glu Gly

610 615 620

Met Pro Gly Gly Phe Pro Gly Ala Gly Gly Ala Ala Pro Gly Gly Gly

625 630 635 640

Ser Ser Gly Pro Thr Ile Glu Glu Val Asp

645 650

<210> 2

<211> 3382

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtctaagg gaccagcagt tggtatcgat cttgggacca cctactcctg tgttggtgtg 60

ttccagcatg gcaaagttga aatcatcgcc aatgaccaag gcaacaggac cacacccagc 120

tacgtggcct tcacagacag tgagaggctg atcggagatg cagccaagaa tcaggttgcc 180

atgaacccca ccaacacagt ctttggtaag tattaaacgg ggaaattgtg gtcttgtgtc 240

actcttgcct gcgtaaaatc aaacatttta tatatagtaa atagtaaaac gccttaaagt 300

ccaatactaa ctgcttataa agagactggc acctctgtcg gtggtaaaac agtaaagtct 360

tatctatgaa ctcgaggcaa gaatggaaca agactgaaat cttaagtggc cgtattaaac 420

aacttcctca ctgtgatgac gattttcctg ccattcgtag tttccaccag aggttgaaag 480

accaaagatg gcccaaatcc ttccttggat gtctgagtga tattcttaaa ggaagcccag 540

agcatattat attttttttc cattaaaccc taaactgtct tttgcagatg ccaaacgact 600

gattggccgc aggtttgacg acacagttgt gcagtcagat atgaagcact ggccatttaa 660

tgtcatcaat gataacaccc gccccaaggt tcaagttgaa tacaaaggcg agacaaagtc 720

cttctaccca gaggaggtct catctatggt gctgacaaag atgaaggaga ttgctgaagc 780

ctacctcgga aaagtatgtt acttagcata gctctggaca saactccaaa tataaaatta 840

tatgaagtga tgctaatttt tttcttattc ccttcaagac tgtcaacaat gctgtaatta 900

cggtacccgc ctacttcaac gactcccagc gccaggccac taaggatgct ggcacaatct 960

ctggcctcaa tgtcctgcgt atcatcaatg aaccaaccgc tgctgccatt gcctatgggt 1020

tggacaagaa ggtaaataaa actagaaaac ttccaattac acttgcatga tggccaatgt 1080

accatcttga attgaggtaa taaaacataa ctgagtagat tttaaatgtt actaacttaa 1140

tttcaggttg ggtctgaaag gaacgttctc atctttgatc ttggtggtgg caccttcgat 1200

gtttccatct tgaccatcga ggatggcatc tttgaggtca agtccactgc tggagatact 1260

catcttggcg gtgaggattt cgacaaccgc atggtcaacc acttcattgc agagttcaag 1320

cgcaagtaca agaaagacat cagtgacaac aagagagctg tccgtcgcct gcgcaccgct 1380

tgcgagaggg caaagcgcac cctgtcttcc agcacccagg ccagcattga aatcgactct 1440

ctgtacgagg gagtcgactt ctatacctca atcaccaggg ctcgctttga ggagctcaac 1500

gctgacctct tccgtggcac cctggaccct gtggagaagt cgctccgtga tgccaagatg 1560

gataaagggc agattcacga catagtgttg gtcggtggct ccactcgtat ccccaagatc 1620

cagaagctgc tccaggattt cttcaatgga aaggagctca acaagagcat caatccagat 1680

gaagccgtgg cctatggagc tggtaagtaa accaaacatt tccatccaat tagagctcta 1740

gatataaatt tctactgaga agtatttttg ttgaattgtt aagagattaa catgaaaaat 1800

atccaccttc agtccctttc aaaatctaac cagccgccct tatttacagc tgtccaggct 1860

gccatcctgt ctggtgacaa gtctgagaat gtccaggact tgctgctttt ggacgtcacc 1920

cctctctccc tgggaattga gaccgctgga ggtgtcatga ctgtcctgat caaacgtaac 1980

accactattc ctaccaagca gacgcagacc ttcaccacct actctgacaa ccagcctggt 2040

gtgctcatcc aggtgaggac gctggttgat ggggttcagt tgtttgtgca attcataatt 2100

ctaacagaat taacataatt ataaattcat ttcggggatg ttggagagac tgaagtgaca 2160

ttgcatacgt ccaacaggtt tatgagggcg agcgtgccat gacaaaggac aacaacctgc 2220

tgggcaagtt tgagctgacg ggcatccccc ctgctcctcg tggtgttccc cagatagagg 2280

tgacgtttga tattgatgcc aatggaatcc ttaatgtctc tgctgtagac aagagcactg 2340

gcaaggagaa caagatcacc atcaccaatg acaagggtac aaaaaagtct gcttaaccca 2400

aataccgctg cagtgtccca acaacggatg attaaatggt aatcttgcct gttttatgcc 2460

aggtcgtctc agcaaggagg acattgaacg catggtccaa gaagctgaga agtacagggc 2520

tgaagacgac gtccagcgtg acaaggtgtc agccaaaaat ggcctggagt cgtatgcttt 2580

caacatgaag tcgaccatgg aagatgaaaa gcttgctggc aagatcagtg atgaagacaa 2640

gcagaagatc ttggacaagt gcaacgagat tattggctgg ctggacaaga accaggtggg 2700

aattgttggt tttggaacct gtgatccacc agcttatcag actgtctatt cctgtctgct 2760

aagcgaattt agagatatat actgtagggg gtaactgaag ggtwggggtc tatatataca 2820

aacaaatatg tttctgagaa ggagaaaatg aacgataact gaaaatacgg taataaacta 2880

atttaacaaa catagccttc tgatctcagt ataggaaaaa tgcttaagtt acttggaggg 2940

ttgaccccag agttttgatt tttttcaaca tgcaaatgta taatttacta ggaagtaagc 3000

aatgggtcta ggattttgca ggtctgctaa acgtcatcag agaatggtga ttttatgtgt 3060

agacactatc gttttgtcag gctaaattat cctcatctgt gtttcaacaa tagcagagtt 3120

taaactgaac tgagtattaa ctgtcaatta attccaattg agaatatatg atttgatttg 3180

tttgtactag actgcagaaa aagatgaata tgaacaccag caacaagaac tggagagggt 3240

gtgtaacccc atcatcacca agctgtacca gagtggtggt gatgtgacag gtgggatgtc 3300

cagtggaatg ccaggcggat tccctggggc tggtggtgct ccagccgctg gaggatcctc 3360

tggaccaact tgtggagggg ga 3382

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgaagcctac ctcggaaaag t 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agcatcctta gtggcctggc gc 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tccaccagct tatcagactg t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtcaaccct ccaagtaact t 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttacttagca tagctctgga ca 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctgtaggggg taactgaagg gt 22

<210> 9

<211> 176

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgaagcctac ctcggaaaag tatgttactt agcatagctc tggacacaac tccaaatata 60

aaattatatg aagtgatgct aatttttttc ttattccctt caagactgtc aacaatgctg 120

taattacggt acccgcctac ttcaacgact cccagcgcca ggccactaag gatgct 176

<210> 10

<211> 222

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tccaccagct tatcagactg tctattcctg tctgctaagc gaatttagag atatatactg 60

tagggggtaa ctgaagggtt ggggtctata tatacaaaca aatatgtttc tgagaaggag 120

aaaatgaacg ataactgaaa atacggtaat aaactaattt aacaaacata gccttctgat 180

ctcagtatag gaaaaatgct taagttactt ggagggttga cc 222

Claims

1.一种大口黑鲈生长速度相关的SNP分子标记，其位于HSC70-1基因序列SEQ ID NO：2所示的第821位碱基、第2804位碱基，其第821位碱基为C或G，第2804位碱基为A或T。

2.检测权利要求1所述SNP分子标记的试剂在判断大口黑鲈生长快慢中的应用。

3.检测权利要求1所述SNP分子标记的试剂在筛选快速生长大口黑鲈中的应用。

4.一种筛选快速生长大口黑鲈的方法，其特征在于，检测大口黑鲈HSC70-1基因序列SEQ ID NO：2的第821位碱基处的SNP分子标记是否为CC纯合体，若是，则为快速生长的大口黑鲈；或/和，检测HSC70-1基因序列SEQ ID NO：2的第2804位碱基处的SNP分子标记是否为TT纯合体，若是，则为快速生长的大口黑鲈。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）提取大口黑鲈DNA；

2）以提取得到的DNA为模板，PCR检测大口黑鲈HSC70-1基因序列第821、2804位碱基处的SNP分子标记是否分别为CC、TT纯合体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR检测的具体操作为，分别利用引物P1F和P1R、P2F和P2R对大口黑鲈DNA进行初次PCR扩增，得到初次PCR产物，

P1F：5'- TGAAGCCTACCTCGGAAAAGT -3'（SEQ ID NO.3），

P1R：5'- AGCATCCTTAGTGGCCTGGCGC -3'（SEQ ID NO.4），

P2F：5'- TCCACCAGCTTATCAGACTGT -3'（SEQ ID NO.5），

P2R：5'- GGTCAACCCTCCAAGTAACTT -3'（SEQ ID NO.6）；

再将初次PCR产物分别用引物P1和P2进行延伸扩增，将所得产物经测序分析，确定大口黑鲈HSC70-1基因序列第821、2804位碱基处的SNP分子标记是否分别为CC、TT纯合体；

P1：5'- TTACTTAGCATAGCTCTGGACA -3'（SEQ ID NO.7），

P2：5'- CTGTAGGGGGTAACTGAAGGGT -3'（SEQ ID NO.8）。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，初次PCR扩增的反应体系为：

DNA 1μl

10×buffer 1.5μl

25mmol 的MgCl₂ 1.5μl

dNTP 0.3μl

上游引物 0.15μl

下游引物 0.15μl

Taq酶 0.3μl

H₂O 补至15μl；