CN111053803A - 一种具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物，它由苦参总黄酮和甘草总黄酮组成。本发明通过提取、萃取、富集等方法制备苦参和甘草的总黄酮部位，并由二者复配而成。体外研究表明该组合物不仅直接抑制革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌的生长，同时能够降低生物被膜形成和葡萄球菌黄素的含量；体内研究证实可以明显减少金黄色葡萄球菌感染所致小鼠***腺泡增生及腺泡炎性细胞浸润，显著降低各模型组小鼠乳腺组织载菌量及乳腺组织IL‑1β、IL‑2及TNF‑α炎症因子含量。本发明可实现苦参和甘草药材的综合利用和产业的提质增效，实现变废为宝，具有很好的经济效应、社会效益，符合可持续发展战略。

Description

一种具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及一种中药组合物，尤其是涉及一种具有防治金黄色葡萄球菌感染，尤其是***炎的苦参和甘草活性成分的组合物及其制备方法与应用。
背景技术
苦参始载于《神农本草经》，列为中品，为豆科槐属植物苦参Sophora flavescensAit.的干燥根，具有清热燥湿、杀虫、利尿等功效，用于治疗热痢、便血、黄疸尿闭、湿疹、湿疮，皮肤瘙痒，疥癬麻风等。甘草始载于《神农本草经》，列为上品，为豆科甘草属植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药之功效，常用于脾胃虚弱、心悸气短、咳嗽痰多、四肢挛急疼痛、痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性等。
作为应用历史悠久的大宗中药材，苦参和甘草的现代化学成分及药理作用相关研究亦较为深入。苦参中报道的化学成分主要包括生物碱类、黄酮类、木脂素类、三萜皂苷类、酚酸类和少量的苯丙素类以及长链脂肪酸类成分。生物碱类和黄酮类成分被认为是其主要的生物活性物质，苦参生物碱类成分主要为苦参碱、氧化苦参碱、金雀花碱等喹诺里西啶类生物碱；苦参黄酮类成分主要为异戊烯基取代黄酮类成分，如苦参酮、苦参新醇、槐属二氢黄酮等，其异戊烯基侧链主要取代位置为A环的6位和(或)8位。苦参生物碱的抗菌、抗肿瘤活性在临床上有较好的应用前景，目前已上市的以苦参碱为主要成分的制剂包括苦参片、复方苦参注射液、复方苦参洗剂等。在苦参药物制剂开发过程中，通常采用酸水提取结合碱水沉淀法提取苦参中的总生物碱部位或苦参碱、氧化苦参碱单体成分，提取之后的部位作为药渣被大量废弃。
目前报道的甘草中化学成分主要包括三萜皂苷类、黄酮类、香豆素类、生物碱类、新木脂素类、多糖类等成分。其中，三萜皂苷类成分和黄酮类成分是其代表性活性成分，皂苷类成分主要为甘草甜素、甘草酸、甘草次酸、乌拉尔甘草皂苷、甘草皂苷等；甘草黄酮类化合物的基本母核为二氢黄酮类，甘草中同样含有异戊烯基黄酮类成分，其异戊烯基侧链主要取代位置为B环。目前甘草制剂主要集中于其皂苷类成分的开发，如甘草酸二氨、异甘草酸镁注射液、复方甘草酸苷注射液等，甘草酸制剂是当前肝病领域中用于抗炎保肝治疗的一线药物之一，市场份额及需求量巨大。在甘草酸制剂的制药过程中，同样产生了大量的药渣，无论苦参或甘草制剂的药渣中仍然富含丰富的黄酮类成分，其作为药渣进行填埋不仅污染土地和水源，给生态环境带来巨大的压力，而且造成严重的资源浪费。同为豆科根茎类药用植物，苦参和甘草主要分布于我国生态环境较为脆弱的西北地区，长期的挖根取药势必进一步加剧当地的生态恶化，因此对其进行资源综合利用，实现资源的吃干榨尽符合绿色、可持续发展战。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是革兰氏阳性菌代表，为一种常见的引起人和动物感染的食源性致病微生物。随着抗菌药物的广泛使用，尤其是奶牛等经济价值较高的动物滥用抗生素，导致金黄色葡萄球菌产生耐药性细菌出现，并成为全球不容忽视的严重问题。且金黄色葡萄球菌通过产生生物被膜及葡萄球菌黄素，使其更加难以清除且危害性更大。***炎为乳腺细胞及乳腺间质的炎症，是奶牛养殖场中的高发病，经抗生素治愈后极易复发。引起***炎症的病原菌，约85％为链球菌、化脓性链球菌等，5％为葡萄球菌，其它有结核杆菌，布氏杆菌等。临床实践中多采用长期低剂量抗生素灌注及浸泡进行防治，导致了奶产品中抗生素残留，并进一步导致抗生素在人类的蓄积。根据《兽药管理条例》、《饲料和饲料添加剂管理条例》有关规定，已发布停止生产、进口、经营、使用部分药物饲料添加剂，主要包括土霉素预混剂、土霉素钙预混剂、亚甲基水杨酸杆菌肽预混剂、那西肽预混剂、杆菌肽锌预混剂、恩拉霉素预混剂、喹烯酮预混剂、黄霉素预混剂、黄霉素预混剂(发酵)、维吉尼亚霉素预混剂等10种添加剂。因此，从中药及天然药物中寻找新型替代抗生素类饲料添加剂成分是行业共识和必由之路。通过本发明的开展，为苦参和甘草的资源价值发现及其综合开发利用提供科学依据，同时为奶牛***炎及其他金黄色葡萄球菌感染的日化用品、中成药和中兽药的开发研发提供参考，并为畜牧养殖业替代抗生素研究提供支撑。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种具有防治金黄色葡萄球菌感染，尤其对***炎具有很好防治作用的苦参总黄酮和甘草总黄酮的组合物，本发明经过体外研究表明该组合物不仅直接抑制革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌的生长，同时能够降低生物被膜形成和葡萄球菌黄素的含量；体内研究证实该活性组合物可以明显减少金黄色葡萄球菌感染所致小鼠***腺泡增生及腺泡炎性细胞浸润，显著降低各模型组小鼠乳腺组织载菌量及乳腺组织IL-1β、IL-2及TNF-α炎症因子含量，有望防治奶牛***炎的发生和发展，并可防治临床其它金黄色葡萄球菌感染引起的人、畜疾病。本发明的另一目的是提供上述苦参总黄酮和甘草总黄酮组合物的制备方法及其应用。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物，它由苦参总黄酮和甘草总黄酮组成。
作为优选方案，以上所述的一种具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物，苦参总黄酮和甘草总黄酮的质量比为1:4-4:1。特别优选质量比为1:1、2:1或者1:2。
本发明所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取苦参药材、粉碎，加入5-20倍质量的乙酸乙酯或95％乙醇，浸泡，提取3次，过滤，滤液浓缩得苦参浸膏备用；
(2)取甘草药材、粉碎，加入5-20倍质量的乙酸乙酯或95％乙醇，浸泡，提取3次，过滤，滤液浓缩得甘草浸膏备用；
(3)采用碳酸钠溶液提取-稀盐酸沉淀方法、大孔吸附树脂柱层析法或者聚酰胺柱层析法从步骤(1)苦参浸膏中富集得苦参总黄酮；
(4)采用碳酸钠溶液提取-稀盐酸沉淀方法、大孔吸附树脂柱层析法或者聚酰胺柱层析法从步骤(2)甘草浸膏中富集得甘草总黄酮；
(5)取步骤(3)苦参总黄酮与步骤(4)甘草总黄酮按1:4-4:1进行复配，混合均匀，即为苦参-甘草活性组合物。
作为优选方案，以上所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，步骤(1)和步骤(2)的原料为苦参和甘草的药材饮片或者苦参注射液、甘草酸制剂生产过程的废弃药渣。
作为优选方案，以上所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，步骤(3)和步骤(4)中碳酸钠溶液提取-稀盐酸沉淀法包括如下步骤：取浸膏，加入浸膏重量2-10倍体积量的稀碳酸钠溶液，搅拌均匀，静置6-24h，过滤取滤液，重复以上操作，合并2次滤液，向滤液中加入稀盐酸调pH值至4，充分搅拌，静置6-24h，过滤滤渣后水洗至pH值为5～6，干燥得总黄酮。
作为优选方案，以上所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，步骤(3)和步骤(4)中大孔吸附树脂柱层析法或聚酰胺柱层析法制备总黄酮的方法如下：取浸膏，用2-10倍无水乙醇溶解浸膏，取上清液进行大孔吸附树脂或聚酰胺柱层析，先分别用水或体积浓度10％的乙醇洗脱，再用体积浓度为30％-95％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得总黄酮。
作为优选方案，以上所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，步骤(1)和步骤(2)中提取方法为加热回流、超声波辅助提取、冷浸法、渗漉法等中的一种或多种。作为特别优先方案，提取方法为渗滤法。
作为特别优选方案，以上所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，步骤(1)中苦参浸膏制备方法为：取苦参药材、粉碎，置于敞口玻璃柱内，加入10倍量的乙酸乙酯浸泡过夜，以3ml/min的流速收集渗漉液，其后依次加入6倍量和3倍量的乙酸乙酯浸泡12h，并依次以5ml/min和8ml/min的流速收集渗滤液，合并渗滤液，减压浓缩得苦参浸膏备用。
作为特别优选方案，以上所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，步骤(2)中甘草浸膏制备方法为：取苦参药材、粉碎，置于敞口玻璃柱内，加入10倍量的乙酸乙酯浸泡过夜，以3ml/min的流速收集渗漉液，其后依次加入6倍量和3倍量的乙酸乙酯浸泡12h，并依次以5ml/min和8ml/min的流速收集渗滤液，合并渗滤液，减压浓缩得苦参浸膏备用。
作为优选方案，以上所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，步骤(3)和步骤(4)中总黄酮部位制备方法为碳酸钠溶液提取-稀盐酸沉淀方法、大孔吸附树脂柱层析法、聚酰胺柱层析法的一种或多种。
作为优选方案，以上所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，步骤(3)和步骤(4)中所述的稀碳酸钠溶液浓度为1-5％，优选2％，稀盐酸浓度为15-20％，优选18％。
作为优选方案，以上所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，步骤(3)和步骤(4)中所述的大孔吸附树脂型号为AB-8、ADS-5、ADS-7、ADS-17、D101、HPD-100、HP20、HPD-300、HPD-400或S-8中的一种或多种。作为特别优先方案，优选氢键型选择性的ADS-17，其兼具大孔吸附树脂的物理吸附原理，同时兼具氢键的化学吸附原理，尤其适用于黄酮类成分的富集和纯化。
作为优选方案，以上所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，步骤(3)和步骤(4)中所述的聚酰胺粒径为20-100目。作为特别优先方案，优选60-80目。
作为特别优选方案，以上所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，步骤(3)中苦参总黄酮制备方法为：向步骤(1)苦参浸膏中加入重量5倍体积量的乙醇，搅拌溶解后，取上清液用聚酰胺拌样，旋转蒸发仪减压干燥至无醇味，将拌样后的样品置于ADS-17大孔吸附树脂柱，先用去离子水及35％乙醇除去未被充分吸附的和大极性成分，再用体积浓度为75％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，滤液浓缩得苦参总黄酮。
作为特别优选方案，以上所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，步骤(4)中甘草总黄酮制备方法为：向步骤(2)甘草浸膏中加入重量5倍体积量的乙醇，搅拌溶解后，取上清液用聚酰胺拌样，旋转蒸发仪减压干燥至无醇味，将拌样后的样品置于ADS-17大孔吸附树脂柱，先用去离子水及35％乙醇除去未被充分吸附的和大极性成分，再用体积浓度为75％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，滤液浓缩得甘草总黄酮。
作为优选方案，以上所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，步骤(5)中苦参总黄酮的重量百分比为50％，甘草总黄酮类成分的重量百分比为50％，二者按1:1组成。
本发明所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物可用于制备治疗***炎等疾病的日用品、中成药或者中兽药。
有益效果：本发明提供的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物，在苦参和甘草的传统应用基础上进行新用途研究，并将其应用于防治金黄色葡萄球菌感染的日化用品、中成药和中兽药的开发，和现有技术相比具有以下优点：
(1)本发明主要关注苦参和甘草的黄酮类成分，而非传统的生物碱类成分和三萜类成分，因此可采用苦参注射液、甘草酸等制剂生产过程的废弃药渣为原料制备活性组合物变废为宝，能够延伸苦参和甘草产业链，实现苦参和甘草资源的综合利用和产业的提质增效，具有很好的经济效应、社会效益、生态效益和环境效益，符合可持续发展战略。
(2)本发明提供的一种具有防治金黄色葡萄球菌感染，尤其***炎的苦参-甘草活性组合物，依据中药基础理论和现代药理研究成果，通过大量实验筛选得到，由苦参总黄酮和甘草总黄酮复配制成，具有良好的抗菌、消炎活性：体外研究表明该组合物不仅直接抑制革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌的生长，同时能够降低生物被膜形成和葡萄球菌黄素的含量；体内研究证实该活性组合物可以明显减少金黄色葡萄球菌感染所致小鼠***腺泡增生及腺泡炎性细胞浸润，显著降低各模型组小鼠乳腺组织载菌量及乳腺组织IL-1β、IL-2及TNF-α炎症因子含量，有望防治奶牛***炎的发生和发展，并可防治临床其它金黄色葡萄球菌感染引起的人、畜疾病。
(3)本发明提供的制备方法工艺路线简单、便捷，较少使用有机试剂，环境友好，且自动化程度高，无毒副作用，可以用于制备防治金黄色葡萄球菌感染引起的人、畜疾病，尤其用于制备防治金黄色葡萄球菌感染的日化用品、中成药和中兽药的开发，具有重要的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
本发明所述的药材和乙醇用量均指得是重量体积比。乙醇均指的是体积浓度。苦参总黄酮和甘草总黄酮含量测定采用紫外分光光度法，苦参总黄酮以槐属二氢黄酮G为对照品，于287nm处测紫外吸收值；甘草总黄酮含量测定以芦丁为对照品，加入5％亚硝酸钠溶液，于500nm处测定吸光度。
实施例1
一种具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取苦参药材、粉碎，加入10倍量的95％乙醇，加热回流3次，合并提取液，减压浓缩得苦参浸膏备用；
(2)取甘草药材、粉碎，加入10倍量的95％乙醇，加热回流3次，合并提取液，减压浓缩得甘草浸膏备用；
(3)向步骤(1)苦参浸膏中加入其重量5倍体积量的无水乙醇，搅拌溶解后，取上清液转入D-101大孔吸附树脂柱，先用水洗去水溶性及未吸附成分，再用体积浓度为80％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得苦参总黄酮；
(4)向步骤(2)甘草浸膏中加入其重量5倍体积量的无水乙醇，搅拌溶解后，取上清液转入D-101大孔吸附树脂柱，先用水洗去水溶性及未吸附成分，再用体积浓度为80％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得甘草总黄酮；
(5)取步骤(3)苦参总黄酮与步骤(4)甘草总黄酮按重量1:4进行复配，混合均匀，即得。
采用紫外分光光度法，测得步骤(3)苦参总黄酮含量为67.14％，步骤(4)甘草总黄酮含量为64.48％。
实施例2
一种具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取苦参药渣，置于敞口玻璃柱内，加入10倍量的乙酸乙酯浸泡过夜，以3ml/min的流速收集渗漉液，其后依次加入6倍量和3倍量的乙酸乙酯浸泡12h，并依次以5ml/min和8ml/min的流速收集渗滤液，合并渗滤液，减压浓缩得苦参浸膏备用；
(2)取甘草药渣，置于敞口玻璃柱内，加入10倍量的乙酸乙酯浸泡过夜，以3ml/min的流速收集渗漉液，其后依次加入6倍量和3倍量的乙酸乙酯浸泡12h，并依次以5ml/min和8ml/min的流速收集渗滤液，合并渗滤液，减压浓缩得甘草浸膏备用；
(3)向步骤(1)苦参浸膏中加入重量5倍体积量的无水乙醇，搅拌溶解后，取上清液转入60-80目聚酰胺层析柱，先用10％乙醇洗去未吸附成分，再用体积浓度为80％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，滤液浓缩得苦参总黄酮；
(4)向步骤(2)甘草浸膏中加入重量5倍体积量的无水乙醇，搅拌溶解后，取上清液转入聚酰胺层析柱，先用10％乙醇洗去未吸附成分，再用体积浓度为80％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，滤液浓缩得甘草总黄酮；
(5)取步骤(3)苦参总黄酮与步骤(4)甘草总黄酮按重量1:2进行复配，混合均匀，既得。
采用紫外分光光度法，测得步骤(3)苦参总黄酮含量为68.58％，步骤(4)甘草总黄酮含量为67.90％。
实施例3
一种具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取苦参药材、粉碎，置于敞口玻璃柱内，加入10倍量的乙酸乙酯浸泡过夜，以3ml/min的流速收集渗漉液，其后依次加入6倍量和3倍量的乙酸乙酯浸泡12h，并依次以5ml/min和8ml/min的流速收集渗滤液，合并渗滤液，减压浓缩得苦参浸膏，备用；
(2)取甘草药材、粉碎，置于敞口玻璃柱内，加入10倍量的乙酸乙酯浸泡过夜，以3ml/min的流速收集渗漉液，其后依次加入6倍量和3倍量的乙酸乙酯浸泡12h，并依次以5ml/min和8ml/min的流速收集渗滤液，合并渗滤液，减压浓缩得甘草浸膏，备用；
(3)向步骤(1)苦参浸膏中加入重量5倍体积量的乙醇，搅拌溶解后，取上清液用聚酰胺拌样，旋转蒸发仪减压干燥至无醇味，将拌样后的样品置于ADS-17大孔吸附树脂柱，先用去离子水及35％乙醇除去未被充分吸附的和大极性成分，再用体积浓度为75％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，滤液浓缩得苦参总黄酮；
(4)向步骤(2)甘草浸膏中加入重量5倍体积量的乙醇，搅拌溶解后，取上清液用聚酰胺拌样，旋转蒸发仪减压干燥至无醇味，将拌样后的样品置于ADS-17大孔吸附树脂柱，先用去离子水及35％乙醇除去未被充分吸附的和大极性成分，再用体积浓度为75％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，滤液浓缩得甘草总黄酮；
(5)取步骤(3)苦参总黄酮与步骤(4)甘草总黄酮按1:1重量进行复配，混合均匀，即得。
采用紫外分光光度法，测得步骤(3)苦参总黄酮含量为72.98％，步骤(4)甘草总黄酮含量为71.17％。
实施例4
一种具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取苦参药材、粉碎，置于敞口玻璃柱内，加入20倍量的乙酸乙酯浸泡过夜，以5ml/min的流速收集渗漉液，其后依次加入15倍量和10倍量的乙酸乙酯浸泡12h，并依次以10ml/min和15ml/min的流速收集渗滤液，合并渗滤液，减压浓缩得苦参浸膏备用；
(2)取甘草药材、粉碎，置于敞口玻璃柱内，加入20倍量的乙酸乙酯浸泡过夜，以5ml/min的流速收集渗漉液，其后依次加入15倍量和10倍量的乙酸乙酯浸泡12h，并依次以10ml/min和15ml/min的流速收集渗滤液，合并渗滤液，减压浓缩得甘草浸膏备用；
(3)向步骤(1)苦参浸膏中加入重量8倍体积量的乙醇，搅拌溶解后取上清液加入AB-8大孔吸附树脂柱，先用体积浓度10％的乙醇洗去未吸附成分，再用体积浓度为80％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得苦参总黄酮；
(4)向步骤(2)甘草浸膏中加入重量8倍体积量的乙醇，搅拌溶解后取上清液加入AB-8大孔吸附树脂柱，先用体积浓度10％的乙醇洗去未吸附成分，再用体积浓度为80％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得甘草总黄酮；
(5)取步骤(3)苦参总黄酮与步骤(4)甘草总黄酮按重量2:1进行复配，混合均匀，即得。
采用紫外分光光度法，测得步骤(3)苦参总黄酮含量为65.26％，步骤(4)甘草总黄酮含量为68.25％。
实施例5
一种具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取苦参药渣，置于提取罐，分别加入10倍、8倍和6倍重量的95％乙醇，加热回流提取3次，过滤，滤液浓缩得苦参浸膏，备用；
(2)取甘草药渣，置于提取罐，分别加入10倍、8倍和6倍重量的95％乙醇，加热回流提取3次，过滤，滤液浓缩得甘草浸膏，备用；
(3)向步骤(1)苦参浸膏中加入3倍药材重量的2％的碳酸钠溶液，搅拌均匀，静置12h，过滤滤液，滤渣继续加2％碳酸钠溶液，搅拌均匀，静置12h，过滤滤液，合并2次滤液；用18％稀盐酸调pH至4，充分搅拌，静置12h，过滤滤渣后水洗至pH 5-6，干燥得苦参总黄酮；
(4)向步骤(2)甘草浸膏中加入3倍药材重量的2％碳酸钠溶液，搅拌均匀，静置12h，过滤滤液，滤渣继续加2％碳酸钠溶液，搅拌均匀，静置12h，过滤滤液，合并2次滤液。用18％稀盐酸调pH至4，充分搅拌，静置12h，过滤滤渣后水洗至pH 5-6，干燥得甘草总黄酮；
(5)取步骤(3)苦参总黄酮与步骤(4)甘草总黄酮按重量比4:1进行复配，混合均匀，即为苦参-甘草组合物。
采用紫外分光光度法，测得步骤(3)苦参总黄酮含量为67.42％，步骤(4)甘草总黄酮含量为65.21％。
实施例6金黄色葡萄球菌生长抑制实验
1、药品及试剂
LB液体培养基、LB固体培养基、MH肉汤培养基、TSB培养基购自上海源叶生物科技有限公司；色谱甲醇(色谱纯)、无水乙醇(分析纯)、结晶紫(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司；摇瓶、平皿、康宁Corning全白酶标96孔微孔板购自上海化科实验器材有限公司；超纯水由本实验室Millipore密理博实验室超纯水***提供。
2、实验菌株
金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(ATCC 25923)，来自于上海医药工业研究院馈赠。
3、实验方法
3.1菌种复苏及菌液制备
将金黄色葡萄球菌接种于LB平板，37℃活化培养18-24h，取单个菌落于LB液体培养基中37℃传代培养18-24h至对数生长期。上述菌液用无菌MH肉汤培养基调整浊度至0.5麦氏(约为1.5×109CFU/mL)，备用。
3.2MIC值的测定
参照美国临床标准协会(CLSI)M07-A9微量肉汤稀释法，取对数生长期的金黄色葡萄球菌使其稀释至浓度约为1.5×106CFU/mL，采用96孔微量板法分别测定各实施例样品对金黄色葡萄球菌的MIC值(即最低不浑浊的药物浓度)，阳性对照药为注射用青霉素钠冻干粉针剂，阴性对照组为空白培养基。各供试样品采用4倍连续稀释法，使得组合物的最终浓度为0.39～100μg/ml；青霉素钠采用10倍连续稀释法，最终浓度为10-3～10μg/ml。置于37℃培养箱中培养18-24h，于600nm处检测各孔OD值，重复3次，每次3个复孔，取均值，计算各实施例样品的抑菌率及最小抑菌浓度MIC值。
抑菌率＝(空白对照孔OD值-测试孔OD值)/空白对照孔OD值×100％
4、实验结果
从表1可以看出：各实施例25μg/ml及以上浓度均能显著抑制金黄色葡萄球菌生长，其MIC值均小于25μg/ml，尤其以实施例3的抑制效果最为明显，其抑菌效果仅比青霉素小1个数量级。
表1金黄色葡萄球菌生长抑制率及MIC值(n＝9)
Figure BDA0002366896900000091
a青霉素初始剂量为10μg/ml，且为10倍连续稀释
实施例7金黄色葡萄球菌生物被膜抑制实验
1、药品与试剂
同实施例6。
2、实验菌株
同实施例6。
3、实验方法
取对数生长期的金黄色葡萄球菌菌液，将其稀释至浓度为1.5×106CFU/mL，接种于96孔板中，置于37℃培养箱中培养36h使其被膜充分生长。之后弃去培养基，吸取200μlPBS溶液于各孔中，洗涤三次，之后每孔加入200μl甲醇，固定15min后弃去甲醇并晾干10min，每孔加入0.5％结晶紫的乙醇溶液200μl。振摇10min后弃去结晶紫溶液，每孔加入纯净水200μl，洗涤三次，晾干，每孔加入33％冰醋酸溶液。37℃振摇溶解15min，于570nm处测定OD值，重复3次，每次3个复孔，取均值，计算生物被膜生成抑制率。
4、实验结果
由表2可知：各实施例3μg/ml及以上浓度均能通过抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成，从而降低金黄色葡萄球菌感染造成的危害，尤其以实施例3对生物被膜生成的抑制效果最佳。
表2金黄色葡萄球菌生物被膜抑制率(n＝9)
Figure BDA0002366896900000101
实施例8金黄色葡萄球菌黄素生成抑制实验
1、药品与试剂
同实施例6。
2、实验菌株
同实施例6。
3、实验方法
取对数期浓度为1.5×107CFU/mL的的金黄色葡萄球菌菌液于TSB培养基中，同时加入1/16-1倍MIC浓度的各个供试样品溶液。37℃振摇共培养16h后，取10ml培养液于16600g下离心5min，弃去上清液，用10ml PBS溶液洗涤沉淀，共洗涤三次。向沉淀中加入2.5ml甲醇，55℃下水浴加热3min后于16600g下离心10min，吸取上清液于465nm处测定OD值，重复3次，每次3个复孔，取均值，计算黄素生成抑制率。
4、实验结果
由表3可知：各实施例样品在浓度为25μg/ml及以上时，均能抑制金黄色葡萄球菌黄素生成从而增强宿主的免疫清除敏感性，尤其以实施例3对葡萄球菌黄素生成抑制效果最佳。
表3金黄色葡萄球菌黄素生成抑制率(n＝9)
Figure BDA0002366896900000102
。
实施例9小鼠***炎实验
1、药品与试剂
小鼠肿瘤坏死因子(TNF-α)酶联免疫试剂盒、小鼠白介素-2(IL-2)酶联免疫试剂盒、小鼠白介素-1β(IL-1β)酶联免疫试剂盒购自于南京金益柏生物科技有限公司；苏木素-伊红染液试剂盒购自于江苏凯基生物技术股份有限公司；羧甲基纤维素钠(CMC-Na，纯度≥99％)及兽用青霉素(兽药GMP证字010号)购自百灵威生物科技有限公司。
2、实验动物
BALB/C孕鼠，雌性，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，SPF级，实验动物合格证编号：NO.201905178，动物生产许可证号：SCXK(苏)2017-0001；屏障饲养环境***，温度20～25℃，相对湿度40～70％，换气次数10～20次/h，每日12h/12h交替照明；实验期间每日消毒地面、台面和墙面，消毒剂为新洁而灭、来苏尔、乙醇交替使用。
3、实验方法
孕鼠适应饲养一周待其分娩，分娩后6～8d后随机分为空白组、模型组、各给药组。取活化的金黄色葡萄球菌菌液，1000g离心10min，弃上清液，沉淀用生理盐水混悬，使其金黄色葡萄球菌浓度为2.0×l04CFU/ml。模型组及各给药组于第5对***处注射上述金黄色葡萄球菌悬液，每侧***各50μL，空白组在相同位置给与相同体积的生理盐水。造梦24h，各给药组灌胃本发明实施例1-5制备得到的苦参和甘草总黄酮组合物(100mg/Kg体重)，空白对照组和模型组灌胃同体积CMC-Na溶液，连续给药7天。给药7天后脱颈处死小鼠，快速剪开胸部皮肤，取第四对***至第5对***间的乳腺组织。
取部分乳腺组织进行组织病理学评价。另取部分乳腺组织中加入无菌的生理盐水(1ml/g)，冰上研磨制备乳腺组织匀浆储备液，备用。制备高盐甘露醇琼脂粉平板，取上述乳腺组织储备液，以无菌的生理盐水稀释至合适的浓度。取100μl上述菌液均匀涂布平板，置于37℃培养箱中培养16-18h，选择CFU为30-300的平板进行计数，并折算稀释前各小鼠乳腺组织的载菌量，剩余乳腺匀浆储备液测定IL-1β、IL-2及TNF-α的含量。
4、实验结果
4.1组织病理学评价
组织病理形态学观察表明：模型组小鼠乳腺腺泡病变明显，腺泡明显增生，腺泡腔内可见大量炎性细胞碎片，炎症细胞类型多样，以嗜中性粒细胞为主。各实施例组均能有效减少炎性细胞浸润，仅见乳腺腺泡上皮细胞轻微剥脱。
4.2乳腺组织载菌量
由表4可知：大量金黄色葡萄球菌在模型组小鼠乳腺组织大量增殖，各实施例组均能有效降低乳腺组织含菌量，表现出显著的体内抑菌活性，且实施例3抑制效果最佳。
表4乳腺组织载菌量及炎性因子含量(n＝10)
Figure BDA0002366896900000111
Figure BDA0002366896900000121
4.3乳腺组织生化指标
由表4可知：相比空白组，模型组小鼠乳腺组织中IL-1β、IL-2及TNF-α炎性因子含量显著增加，各实施例组均能有效降低乳腺组织炎性因子含量，表现为显著的抗炎活性，尤其以实施例3最为显著。
以上实验结果表明，本发明提供的苦参和甘草组合物具有良好的抗菌、消炎活性：体外研究表明该组合物不仅直接抑制革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌的生长，同时能够降低生物被膜形成和葡萄球菌黄素的含量；体内研究证实该活性组合物可以明显减少金黄色葡萄球菌感染所致小鼠***腺泡增生及腺泡炎性细胞浸润，显著降低各模型组小鼠乳腺组织载菌量及乳腺组织IL-1β、IL-2及TNF-α炎症因子含量，有望防治奶牛***炎的发生和发展，并可防治临床其它金黄色葡萄球菌感染引起的人、畜疾病。
本发明提供的制备方法工艺路线简单、便捷，较少使用有机试剂，环境友好，且自动化程度高；且该工艺获得的总黄酮部位纯度均大于64.48％，活性成分纯度较高，无毒副作用，可以用于制备防治金黄色葡萄球菌感染的日化用品、中成药和中兽药，具有重要的应用前景。
本发明通过不同重量配比的苦参总黄酮和甘草总黄酮组合物防治***炎活性比较可知，实施例3体外抑菌活性最优，同时体内防治***炎活性最强，即苦参总黄酮类成分和甘草总黄酮按1:1复配而成的苦参和甘草总黄酮组合物不仅对金黄色葡萄球菌的生长、生物被膜形成和葡萄球菌黄素的含量具有显著的抑制和降低作用，同时对***炎小鼠***腺泡增生、腺泡炎性细胞浸润、乳腺组织载菌量以及乳腺组织IL-1β、IL-2及TNF-α炎症因子含量的改善作用最佳，取得了很好的预料不到的技术效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物，其特征在于，它由苦参总黄酮和甘草总黄酮组成。
2.根据权利要求1所述的一种具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物，其特征在于，苦参总黄酮和甘草总黄酮的质量比为1:4-4:1。
3.权利要求1或2所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取苦参药材、粉碎，加入5-20倍质量的乙酸乙酯或95%乙醇，浸泡，提取3次，过滤，滤液浓缩得苦参浸膏备用；
（2）取甘草药材、粉碎，加入5-20倍质量的乙酸乙酯或95%乙醇，浸泡，提取3次，过滤，滤液浓缩得甘草浸膏备用；
（3）采用碳酸钠溶液提取-稀盐酸沉淀方法、大孔吸附树脂柱层析法或者聚酰胺柱层析法从步骤（1）苦参浸膏中富集得苦参总黄酮；
（4）采用碳酸钠溶液提取-稀盐酸沉淀方法、大孔吸附树脂柱层析法或者聚酰胺柱层析法从步骤（2）甘草浸膏中富集得甘草总黄酮；
（5）取步骤（3）苦参总黄酮与步骤（4）甘草总黄酮按1:4-4:1进行复配，混合均匀，即为苦参-甘草活性组合物。
4.根据权利要求3所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）的原料为苦参和甘草的药材饮片或者苦参注射液、甘草酸制剂生产过程的废弃药渣。
5.根据权利要求3所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（3）和步骤（4）中碳酸钠溶液提取-稀盐酸沉淀法包括如下步骤：取浸膏，加入浸膏重量2-10倍体积量的稀碳酸钠溶液，搅拌均匀，静置6-24 h，过滤取滤液，重复以上操作，合并2次滤液，向滤液中加入稀盐酸调pH值至4，充分搅拌，静置6-24 h，过滤滤渣后水洗至pH值为 5~6，干燥得总黄酮。
6.根据权利要求3所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（3）和步骤（4）中大孔吸附树脂柱层析法或聚酰胺柱层析法制备总黄酮的方法如下：取浸膏，用2-10倍无水乙醇溶解浸膏，取上清液进行大孔吸附树脂或聚酰胺柱层析，先分别用水或体积浓度10%的乙醇洗脱，再用体积浓度为30%-95%的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得总黄酮。
7.根据权利要求3所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（3）和步骤（4）中所述的碳酸钠溶液浓度为1-5%，优选2%，稀盐酸体积浓度为15-20%，优选18%；所述的大孔吸附树脂型号为AB-8、ADS-5、ADS-7、ADS-17、D101、HPD-100、HP20、HPD-300、HPD-400或S-8中的一种或多种，优选ADS-17；所述的聚酰胺粒径为20-100目，优选60-80目。
8.根据权利要求3所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取苦参药材、粉碎，置于敞口玻璃柱内，加入10倍量的乙酸乙酯浸泡过夜，以3 ml/min的流速收集渗漉液，其后依次加入6倍量和3倍量的乙酸乙酯浸泡12 h，并依次以5 ml/min和8 ml/min的流速收集渗滤液，合并渗滤液，减压浓缩得苦参浸膏备用；
（2）取甘草药材、粉碎，置于敞口玻璃柱内，加入10倍量的乙酸乙酯浸泡过夜，以3 ml/min的流速收集渗漉液，其后依次加入6倍量和3倍量的乙酸乙酯浸泡12 h，并依次以5 ml/min和8 ml/min的流速收集渗滤液，合并渗滤液，减压浓缩得甘草浸膏备用；
（3）向步骤（1）苦参浸膏中加入重量5倍体积量的乙醇，搅拌溶解后，取上清液用聚酰胺拌样，旋转蒸发仪减压干燥至无醇味，将拌样后的样品置于ADS-17大孔吸附树脂柱，先用去离子水及体积浓度35%乙醇除去未被充分吸附的和大极性成分，再用体积浓度为75%的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得苦参总黄酮；
（4）向步骤（2）甘草浸膏中加入重量5倍体积量的乙醇，搅拌溶解后，取上清液用聚酰胺拌样，旋转蒸发仪减压干燥至无醇味，将拌样后的样品置于ADS-17大孔吸附树脂柱，先用去离子水及体积浓度35%乙醇除去未被充分吸附的和大极性成分，再用体积浓度为75%的乙醇洗脱，减压浓缩，得甘草总黄酮；
（5）取步骤（3）苦参总黄酮与步骤（4）甘草总黄酮按1:4-4:1进行复配，混合均匀，即得。
9.权利要求1或2所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物在制备防治***炎的日化用品、中成药或中兽药中的应用。
10.权利要求1或2所述的具有抗金黄色葡萄球菌作用的组合物与药学上可接受的载体制成颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂或口服液剂型。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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