CN111041027B - 一种Atg12基因敲除细胞系构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种Atg12基因敲除细胞系构建方法及其应用，提供了用于敲除人结肠癌细胞Atg12基因的SgRNA、构建CRISPR‑Cas9载体，以及构建Atg12基因敲除细胞系的方法。本发明筛选获得的Atg12基因靶点，从多个靶点中优选出来的活性最好的靶点，高效靶向Atg12基因，而且对F2～F5代细胞敲除分析，敲除效率很高，位点均已被切割断，100％成功敲除；蛋白表达分析无Atg12蛋白，此方法可广泛应用于Atg12基因功能研究和药物研发等方面。

Description

一种Atg12基因敲除细胞系构建方法及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种Atg12基因敲除细胞系构建方法及其应用。
背景技术
细胞自噬(Autophagy)是在自噬相关基因(Autophagy related gene,Atg)的调控下，利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质。其中Atg12扮演着重要的角色。细胞自噬与细胞凋亡、细胞衰老类似，介导的调控涉及了细胞的生理和病理等，均具有重要的生物学意义
细胞自噬中，损坏的蛋白或功能失调细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物)中进行降解并得以循环利用。自噬调节不当会引发多种不良影响，如肿瘤的诱发、传染病的产生以及过快衰老等。自噬发生时，微管相关蛋白(LC3-I)与磷脂酰乙醇胺(PE)结合形成LC3-II。然后进入细胞膜，促进自噬体的形成。自噬体与溶酶体融合降解内部物质，同时LC3-II会发生降解。
Atg12和Atg8结合***都属于泛素样蛋白质结合***。其主要过程是泛素作为前体被合成，被特殊的蛋白酶体剪切暴露C-端的甘氨酸残基，进而被E1酶活化，活化的泛素被转移到E2酶上并形成复合物。一种E3连接酶识别目标蛋白并将泛素从E2酶转移到具有赖氨酸残基的靶蛋白上。Atg 12的C-端具有甘氨酸残基，其中Atg7具有E1样酶活性，Atg10具有E2样酶活性，目前还没有发现E3样酶。Atg12的C-端186位甘氨酸与Atg7的507半胱氨酸结合激活Atg12，然后Atg12被转移到Atg10，最终与Atg5的第149位亮氨酸结合并形成复合物。Atg12-Atg5复合物又进一步与Atg16结合形成Atg12-Atg5-Atg16复合物。与Atg16结合后将促进暴露位于Atg5上的膜结合位点，从而有助于复合物与膜结合。研究证明，Atg12-Atg5-Atg16复合物具有E3样酶生物学活性，主要通过激活Atg3酶活性，促进Atg8从Atg3转移到底物磷脂酰乙醇胺(PE)上，进而完成自噬关键环节。
自噬可选择性降解蛋白质、内质网、线粒体、细菌及病毒等。通过药物或基因干预技术人为地调控自噬，以观察其在体内、外模型中的作用。
但目前自噬机制研究还并不完善，研制一种有效的调控研究工具成为亟需解决的问题。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种Atg12基因敲除细胞系构建方法及其应用。
为达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种高效敲除人Atg12基因的SgRNA、条件性诱导人结肠癌细胞Atg12基因敲除细胞系及其构建方法。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
本发明第一个方面，提出了一种敲除Atg12基因的SgRNA。
根据本发明的实施例，所述Atg12基因为结肠细胞的Atg12基因。
根据本发明的实施例，所述的SgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。根据本发明实施例的效果，细胞系中基因组的Atg12基因靶点处100％发生切割，靶点活性高，基因组中Atg12开放阅读框被完全破坏。
本发明第二个方面，提出了含有前面所述SgRNA的表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体为LentiCRISPRV2-Atg12。根据本发明实施例的效果，细胞系中基因组的Atg12基因靶点处发生切割。
在一些实施例中，前面所述的表达载体具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。根据本发明实施例的效果，细胞系中基因组的Atg12基因靶点处发生切割，靶点活性高。
本发明第三个方面，提出了一种敲除人结肠癌细胞Atg12基因的CRISPR-Cas9表达***。根据本发明的实施例，该表达***含有前面任一项所述的表达载体LentiCRISPRV2-Atg12，包括Cas9基因和Atg12-SgRNA表达载体。根据本发明实施例的效果，细胞系中基因组的Atg12基因靶点处发生切割，靶点活性高和可靠。
本发明第四个方面，提出了一种敲除Atg12基因载体***。所述***含有前面任一所述的SgRNA、前面任一所述表达载体或前面任一所述表达***。根据本发明实施例的效果，细胞系中基因组的Atg12基因靶点处发生切割，靶点活性高。
本发明第五个方面，提出了前面任一项所述的SgRNA在敲除细胞Atg12基因中的应用，所述细胞为结肠细胞。根据本发明实施例的效果，细胞系中基因组的Atg12基因靶点处发生切割，靶点活性高。
本发明第六个方面，提出了前面任一项所述的表达载体在敲除结肠癌细胞Atg12基因中的应用。根据本发明实施例的效果，细胞系中基因组的Atg12基因靶点处发生切割，靶点活性高。
本发明第七个方面，提出了前面任一项所述的表达***在敲除结肠癌细胞Atg12基因中的应用。根据本发明实施例的效果，细胞系中基因组的Atg12基因靶点处发生切割，靶点活性高。
本发明第八个方面，提出了一种敲除Atg12基因的方法，包括以下步骤：
1)合成编码前面所述SgRNA的DNA序列；
2)将步骤1)合成DNA序列与酶切过的LentiCRISPR-V2载体连接、转化成LentiCRISPRV2-Atg12慢病毒载体；
3)将步骤2)构建的LentiCRISPRV2-Atg12慢病毒载体与包装载体共转染到293FT细胞，生产慢病毒，将慢病毒侵染到HCT8人结肠细胞系，敲除Atg12基因。根据本发明实施例的，所述Atg12基因为结肠细胞Atg12基因。根据本发明实施例的效果，细胞系中基因组的Atg12基因靶点处发生100％切割，靶点活性高。
根据本发明的实施例，步骤1)所述合成DNA序列引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示。根据本发明实施例的效果，细胞系中基因组的Atg12基因靶点处发生100％切割，靶点活性高。
根据本发明的实施例，步骤3)所述LentiCRISPRV2-Atg12慢病毒载体、pMD2.G和psPAX2包装载体的质量比为10～11：3.5～4.5：10～11；混合后转染293FT细胞。在一些实施例中，步骤3)所述LentiCRISPRV2-Atg12慢病毒载体、pMD2.G和psPAX2包装载体的质量比为10：3.5：10。根据本发明实施例的效果，细胞系中基因组的Atg12基因靶点处发生100％切割，靶点活性高。
本发明第九个方面，提出了使用前面所述方法制备的人结肠Atg12基因敲除细胞系。
Atg12作为自噬关键分子，在细胞自噬发生过程中具有重要作用。本发明通过构建Atg12缺失的细胞系，为Atg12分子为基础的自噬相关研究提供有效工具，在宿主细胞与病原微生物相互作用机制研究以及新药创制方面表现出广泛的应用前景。
本发明具有以下有益效果：
首先，本发明研究人结肠癌细胞，运用CRISPR/Cas9***构建了一种敲除Atg12基因细胞系的构建方法，本发明细胞系中基因组的Atg12基因靶点处100％发生切割，靶点活性高，基因组中Atg12开放阅读框被完全破坏，Western-blot检测显示基因敲除组蛋白表达率极低，达到了非常理想的效果。本发明使用了单质粒LentiCRISPR***，操作简单，重复性高。本发明的细胞系是Atg12调控机制的重要研究细胞模型，可广泛应用于自噬机制、信号转导及相关的疾病治疗、新药创制等方面。
附图说明
图1为本发明实施例1中人结肠癌细胞Atg12基因敲除细胞系构建方法的流程图；
图2为本发明实施例1LentiCRISPRV2-Atg12病毒载体图谱；
图3为本发明实施例1中LentiCRISPRV2-Atg12载体的构建Atg12敲除的过程及相关检测，其中：A：F1代未转基因的HCT8细胞；B：稳转CRSPR-V2-Atg12慢病毒载体后，稳筛F2代细胞克隆；C：稳筛F3代HCT8转基因细胞；D：稳筛F3代HCT8转基因细胞；E：基因组敲除效果分析；F：基因组敲除效果分析。
图4为本发明实施例1中Atg12敲除蛋白检测结果，其中Ctrl为未敲除的实验对照组，Ko组为ATG12敲除组。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整的说明，但并不局限于此。
实施例1
根据Ensembl数据库Atg12基因序列(ENSG00000145782)，SgRNA靶点预测工具：http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design-v1，设计了成千的靶序列。将靶序列通过实验验证，靶点无切割活性；或者切割活性很低；或者存在脱靶效应，最终筛选预测靶点序列为：
CAGTCTGTGTTGCAGCTTCC(SEQ ID NO：1)；
靶点序列SEQ ID NO：1位于外显子起始密码子ATG下游第12bp处，用于敲除Atg12基因。图1为本发明的人结肠癌细胞Atg12基因敲除细胞系的步骤。
一、合成编码SgRNA的DNA序列
1)构建LentiCRISPR V2-Atg12载体
将LentiCRISPR V2载体进行BsmBI切割，回收载体骨架，通过引物合成含Atg12靶点序列的粘性末端短序列。具体步骤如下：
①LentiCRISPRV2载体在BsmBI在37C反应30min，酶消化体系如表1。
表1载体酶切体系
Figure BDA0002325392000000041
②利用引物合成含有Atg12靶点的粘性末端短链DNA片段，合成体系见表2，反应程序如表3。
表2含有Atg12靶点DNA片段合成体系
Figure BDA0002325392000000051
其中，合成含Atg12靶点的短链DNA片段的引物，核苷酸序列如下：
引物F：CACCGGGAAGCTGCAACACAGACTG(SEQ ID NO：3)；
引物R：CCTTCGACGTTGTGTCTGACCAAA(SEQ ID NO：4)。
10×T4 Ligation Buffer(货号为：NEB M0201S)；
T4 PNK(货号为：NEB M0201S)。
表3 PCR仪反应程序
Figure BDA0002325392000000052
将表3得到的反应产物稀释200倍待用。
二、将上述步骤合成的DNA序列与酶切过的LentiCRISPR-V2载体连接、转化成LentiCRISPRV2-Atg12慢病毒载体
含有靶点的短链DNA片段与载体骨架连接，室温反应10min，反应体系如表4。
表4连接反应体系
Figure BDA0002325392000000053
然后进行大肠杆菌Stbl3感受态转化，挑菌，测序，抽提质粒等。
三、将前面构建的LentiCRISPRV2-Atg12慢病毒载体与包装载体共转染到293FT细胞，生产慢病毒，将慢病毒侵染到HCT8人结肠细胞系，敲除Atg12基因
将构建好的LentiCRISPR V2-Atg12慢病毒载体(图2)和病毒包装质粒(pMD2.G和psPAX2)按照质量比为10：3.5：10混合，转染生长至60-70％汇合的293FT细胞；将纯化好的携带LentiCRISPR V2-Atg12的病毒液侵染到HCT8人结肠细胞系(图3)，最终获得了稳定表达的转入表达Cas9和Atg12-SgRNA的单载体的稳转结肠癌细胞系。
其中，慢病毒包装质粒和穿梭质粒纯化方法如下：
(1)加入1/10体积的3M醋酸钠，混匀；
(2)加入2.5倍体积的的预冷无水乙醇，混匀，-20℃静置30-60min；
(3)4℃，12000rpm离心10min，回收沉淀，用0.5-1mL预冷的75％乙醇溶解；
(4)4℃，12000rpm离心10min，轻轻地吸去上清；
(5)真空或室温干燥，无菌水50-100μL溶解沉淀，-20℃保存。
转染方法如下：
(1)293FT细胞铺板：使用10％FBS DMEM(GIBCO)细胞培养基培养293FT细胞，当细胞达到培养基70-80％时进行侵染；
(2)侵染时，加入300μL DMEM以及慢病毒包装质粒pSPAX2、pMD2.G和穿梭质粒(LentiCRISPR V2-Atg12)，质粒pSPAX2、pMD2.G和穿梭质粒含量分别为：3.5μg、10.4μg和10μg。再加入60μL转染试剂Attractene Transfection Reagent(Qiagen)，混合均匀，15-25℃静置10-15min；
(3)用PBS清洗细胞两次，并加入6mL 2％293FT细胞培养基，滴加混合液；
(4)37℃细胞培养箱培养，6h后弃去培养液，继续用2％293FT细胞培养基培养，以维持细胞活性，37℃、5％CO2培养箱内培养；
(5)48和72h分别收集病毒原液，2000rpm离心3min，取上清液0.45μm过滤，4℃保存。
慢病毒侵染方法如下：
(1)待人结肠癌细胞长至卡式瓶底面60-80％时，用PBS清洗2次；
(2)将5mL过滤后的LentiCRISPR V2-Atg12慢病毒原液、5μL浓度为10μg/mL的Polybrene以及500μL FBS共培养，共培养12h后换液；
(3)共培养24h后替换为完全培养基继续培养；
(4)细胞系筛选稳定后，荧光显微镜观察，并检测转基因的结果。
对本发明Atg12基因的敲除做进一步地效果验证。
Atg12-KO细胞系建立与敲除验证
将上述已经转入LentiCRISPR V2-Atg12载体的稳转结肠癌细胞系，通过嘌呤霉素筛选，传代；最终获得了体外稳定细胞系。选取部分细胞抽提基因组DNA。并以基因组DNA为模板，设计用于敲除Atg12基因的引物组(表5)并扩增，扩增长度609bp，测序并分析敲除效果。
表5敲除Atg12基因的引物序列
Figure BDA0002325392000000071
通过测序分析显示本发明的细胞系Atg12基因被敲除，并且正向测序和反向测序都呈现出了套峰(图3)，说明细胞的同源染色体上的Atg12基因均被敲除，细胞为纯合子细胞系。
综上，本发明Atg12基因的靶点序列切割活性高，选取本发明构建的细胞系中的SEQ ID NO.1靶标位点进行切割，均能100％进行切割。说明本发明的靶标位点可靠，准确率为100％，可作为Atg12基因敲除的理想靶点。
Western-blot分析
1)细胞蛋白提取：收集实施例1的条件性诱导敲除Atg12基因的稳转结肠癌细胞系，PBS洗两遍，然后加入RIPA裂解液(含110μL/mL PMSF和5μL/mL蛋白酶抑制剂)，冰上裂解30min，每隔5min振荡一次，12000rpm、4℃离心并收集上清；
2)蛋白浓度测定：采用BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)进行测定，根据测得蛋白浓度，用RIPA裂解液将样品蛋白浓度调成一致，分装后于-80℃冰箱保存；
3)SDS-PAGE蛋白电泳；
4)转膜：恒流250mA-2.5h，冰上湿转；
5)封闭：3％BSA溶液中室温封闭30min；
6)一抗(鼠源ACTB(货号为：AF0003，上海碧云天生物技术有限公司)和鼠源Atg12单克隆抗体(货号为：sc-271688，圣克鲁斯生物技术有限公司)孵育抗体用封闭液稀释，4℃过夜孵育后，1×TBST洗4次，每次5min；
7)二抗(羊抗鼠的IgG(CW0102M))孵育：将对应的IgG用封闭液以1：5000稀释，室温孵育1h，用1×TBST洗4×5min/次；
8)显影和灰度分析：采用ECL化学发光试剂(购自Thermo Fisher Scientific)于化学发光凝胶成像***中进行成像显影，并采用Image lab软件进行图像编辑和Image J软件进行灰度分析。
Atg12基因敲除蛋白Western-blot结果如图4，图中Ko组的Atg12蛋白相对于对照组表达量显著减少，近乎无表达。
本发明F2～F5代细胞系的敲除验证
对本发明制备的条件性诱导敲除Atg12基因的稳转结肠癌细胞系进行传代培养，培养成F2～F5代。使用被本发明实施例1的方法，对F2～F5代细胞进行Atg12基因的敲除。发现敲除效率很高，位点均已被切割断，达到100％敲除。
构建含有的SgRNA的表达载体
一种敲除Atg12基因的CRISPR-Cas9表达***，含有SgRNA的LentiCRISPRV2-Atg12慢病毒载体、Cas9蛋白转录和Atg12-SgRNA表达载体。其中包含SgRNA的LentiCRISPRV2-Atg12慢病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2。
一种敲除Atg12基因载体***，所述***含有SgRNA、含有SgRNA的LentiCRISPRV2-Atg12慢病毒载体或表达***。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
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cagtctgtgt tgcagcttcc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc 60
caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact 120
ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt 180
gggaggtcta tataagcagc gcgttttgcc tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc 240
tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg 300
ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc 360
ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga 420
aagcgaaagg gaaaccagag gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca 480
cggcaagagg cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct 540
agaaggagag agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat 600
gggaaaaaat tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat 660
gggcaagcag ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag 720
gctgtagaca aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta 780
gatcattata taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag 840
acaccaagga agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac 900
agcaagcggc cgctgatctt cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt 960
gaattatata aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca 1020
aagagaagag tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg 1080
ttcttgggag cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc 1140
agacaattat tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg 1200
caacagcatc tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg 1260
gctgtggaaa gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa 1320
ctcatttgca ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag 1380
atttggaatc acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta 1440
atacactcct taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg 1500
gaattagata aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat 1560
ataaaattat tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta 1620
ctttctatag tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc 1680
ccaaccccga ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac 1740
agagacagat ccattcgatt agtgaacgga tcggcactgc gtgcgccaat tctgcagaca 1800
aatggcagta ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt acagtgcagg 1860
ggaaagaata gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat 1920
tacaaaaatt caaaattttc gggtttatta cagggacagc agagatccag tttggttaat 1980
taaggtaccg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct 2040
gttagagaga taattagaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg 2100
tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg 2160
gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg 2220
tggaaaggac gaaacaccgg gaagctgcaa cacagactgg ttttagagct agaaatagca 2280
agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt 2340
tgaattcgct agctaggtct tgaaaggagt gggaattggc tccggtgccc gtcagtgggc 2400
agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga ggggtcggca attgatccgg 2460
tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct 2520
ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt 2580
tcgcaacggg tttgccgcca gaacacagga ccggttctag agcgctgcca ccatggacaa 2640
gaagtacagc atcggcctgg acatcggcac caactctgtg ggctgggccg tgatcaccga 2700
cgagtacaag gtgcccagca agaaattcaa ggtgctgggc aacaccgacc ggcacagcat 2760
caagaagaac ctgatcggag ccctgctgtt cgacagcggc gaaacagccg aggccacccg 2820
gctgaagaga accgccagaa gaagatacac cagacggaag aaccggatct gctatctgca 2880
agagatcttc agcaacgaga tggccaaggt ggacgacagc ttcttccaca gactggaaga 2940
gtccttcctg gtggaagagg ataagaagca cgagcggcac cccatcttcg gcaacatcgt 3000
ggacgaggtg gcctaccacg agaagtaccc caccatctac cacctgagaa agaaactggt 3060
ggacagcacc gacaaggccg acctgcggct gatctatctg gccctggccc acatgatcaa 3120
gttccggggc cacttcctga tcgagggcga cctgaacccc gacaacagcg acgtggacaa 3180
gctgttcatc cagctggtgc agacctacaa ccagctgttc gaggaaaacc ccatcaacgc 3240
cagcggcgtg gacgccaagg ccatcctgtc tgccagactg agcaagagca gacggctgga 3300
aaatctgatc gcccagctgc ccggcgagaa gaagaatggc ctgttcggaa acctgattgc 3360
cctgagcctg ggcctgaccc ccaacttcaa gagcaacttc gacctggccg aggatgccaa 3420
actgcagctg agcaaggaca cctacgacga cgacctggac aacctgctgg cccagatcgg 3480
cgaccagtac gccgacctgt ttctggccgc caagaacctg tccgacgcca tcctgctgag 3540
cgacatcctg agagtgaaca ccgagatcac caaggccccc ctgagcgcct ctatgatcaa 3600
gagatacgac gagcaccacc aggacctgac cctgctgaaa gctctcgtgc ggcagcagct 3660
gcctgagaag tacaaagaga ttttcttcga ccagagcaag aacggctacg ccggctacat 3720
tgacggcgga gccagccagg aagagttcta caagttcatc aagcccatcc tggaaaagat 3780
ggacggcacc gaggaactgc tcgtgaagct gaacagagag gacctgctgc ggaagcagcg 3840
gaccttcgac aacggcagca tcccccacca gatccacctg ggagagctgc acgccattct 3900
gcggcggcag gaagattttt acccattcct gaaggacaac cgggaaaaga tcgagaagat 3960
cctgaccttc cgcatcccct actacgtggg ccctctggcc aggggaaaca gcagattcgc 4020
ctggatgacc agaaagagcg aggaaaccat caccccctgg aacttcgagg aagtggtgga 4080
caagggcgct tccgcccaga gcttcatcga gcggatgacc aacttcgata agaacctgcc 4140
caacgagaag gtgctgccca agcacagcct gctgtacgag tacttcaccg tgtataacga 4200
gctgaccaaa gtgaaatacg tgaccgaggg aatgagaaag cccgccttcc tgagcggcga 4260
gcagaaaaag gccatcgtgg acctgctgtt caagaccaac cggaaagtga ccgtgaagca 4320
gctgaaagag gactacttca agaaaatcga gtgcttcgac tccgtggaaa tctccggcgt 4380
ggaagatcgg ttcaacgcct ccctgggcac ataccacgat ctgctgaaaa ttatcaagga 4440
caaggacttc ctggacaatg aggaaaacga ggacattctg gaagatatcg tgctgaccct 4500
gacactgttt gaggacagag agatgatcga ggaacggctg aaaacctatg cccacctgtt 4560
cgacgacaaa gtgatgaagc agctgaagcg gcggagatac accggctggg gcaggctgag 4620
ccggaagctg atcaacggca tccgggacaa gcagtccggc aagacaatcc tggatttcct 4680
gaagtccgac ggcttcgcca acagaaactt catgcagctg atccacgacg acagcctgac 4740
ctttaaagag gacatccaga aagcccaggt gtccggccag ggcgatagcc tgcacgagca 4800
cattgccaat ctggccggca gccccgccat taagaagggc atcctgcaga cagtgaaggt 4860
ggtggacgag ctcgtgaaag tgatgggccg gcacaagccc gagaacatcg tgatcgaaat 4920
ggccagagag aaccagacca cccagaaggg acagaagaac agccgcgaga gaatgaagcg 4980
gatcgaagag ggcatcaaag agctgggcag ccagatcctg aaagaacacc ccgtggaaaa 5040
cacccagctg cagaacgaga agctgtacct gtactacctg cagaatgggc gggatatgta 5100
cgtggaccag gaactggaca tcaaccggct gtccgactac gatgtggacc atatcgtgcc 5160
tcagagcttt ctgaaggacg actccatcga caacaaggtg ctgaccagaa gcgacaagaa 5220
ccggggcaag agcgacaacg tgccctccga agaggtcgtg aagaagatga agaactactg 5280
gcggcagctg ctgaacgcca agctgattac ccagagaaag ttcgacaatc tgaccaaggc 5340
cgagagaggc ggcctgagcg aactggataa ggccggcttc atcaagagac agctggtgga 5400
aacccggcag atcacaaagc acgtggcaca gatcctggac tcccggatga acactaagta 5460
cgacgagaat gacaagctga tccgggaagt gaaagtgatc accctgaagt ccaagctggt 5520
gtccgatttc cggaaggatt tccagtttta caaagtgcgc gagatcaaca actaccacca 5580
cgcccacgac gcctacctga acgccgtcgt gggaaccgcc ctgatcaaaa agtaccctaa 5640
gctggaaagc gagttcgtgt acggcgacta caaggtgtac gacgtgcgga agatgatcgc 5700
caagagcgag caggaaatcg gcaaggctac cgccaagtac ttcttctaca gcaacatcat 5760
gaactttttc aagaccgaga ttaccctggc caacggcgag atccggaagc ggcctctgat 5820
cgagacaaac ggcgaaaccg gggagatcgt gtgggataag ggccgggatt ttgccaccgt 5880
gcggaaagtg ctgagcatgc cccaagtgaa tatcgtgaaa aagaccgagg tgcagacagg 5940
cggcttcagc aaagagtcta tcctgcccaa gaggaacagc gataagctga tcgccagaaa 6000
gaaggactgg gaccctaaga agtacggcgg cttcgacagc cccaccgtgg cctattctgt 6060
gctggtggtg gccaaagtgg aaaagggcaa gtccaagaaa ctgaagagtg tgaaagagct 6120
gctggggatc accatcatgg aaagaagcag cttcgagaag aatcccatcg actttctgga 6180
agccaagggc tacaaagaag tgaaaaagga cctgatcatc aagctgccta agtactccct 6240
gttcgagctg gaaaacggcc ggaagagaat gctggcctct gccggcgaac tgcagaaggg 6300
aaacgaactg gccctgccct ccaaatatgt gaacttcctg tacctggcca gccactatga 6360
gaagctgaag ggctcccccg aggataatga gcagaaacag ctgtttgtgg aacagcacaa 6420
gcactacctg gacgagatca tcgagcagat cagcgagttc tccaagagag tgatcctggc 6480
cgacgctaat ctggacaaag tgctgtccgc ctacaacaag caccgggata agcccatcag 6540
agagcaggcc gagaatatca tccacctgtt taccctgacc aatctgggag cccctgccgc 6600
cttcaagtac tttgacacca ccatcgaccg gaagaggtac accagcacca aagaggtgct 6660
ggacgccacc ctgatccacc agagcatcac cggcctgtac gagacacgga tcgacctgtc 6720
tcagctggga ggcgacaagc gacctgccgc cacaaagaag gctggacagg ctaagaagaa 6780
gaaagattac aaagacgatg acgataaggg atccggcgca acaaacttct ctctgctgaa 6840
acaagccgga gatgtcgaag agaatcctgg accgatggcc aagcctttgt ctcaagaaga 6900
atccaccctc attgaaagag caacggctac aatcaacagc atccccatct ctgaagacta 6960
cagcgtcgcc agcgcagctc tctctagcga cggccgcatc ttcactggtg tcaatgtata 7020
tcattttact gggggacctt gtgcagaact cgtggtgctg ggcactgctg ctgctgcggc 7080
agctggcaac ctgacttgta tcgtcgcgat cggaaatgag aacaggggca tcttgagccc 7140
ctgcggacgg tgccgacagg tgcttctcga tctgcatcct gggatcaaag ccatagtgaa 7200
ggacagtgat ggacagccga cggcagttgg gattcgtgaa ttgctgccct ctggttatgt 7260
gtgggagggc taaacgcgtt aagtcgacaa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag 7320
attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat 7380
gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc 7440
ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg 7500
cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct 7560
ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct 7620
tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg 7680
gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac 7740
gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac cttccttccc gcggcctgct 7800
gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct 7860
ttgggccgcc tccccgcgtc gactttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt 7920
agccactttt taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa ttcactccca acgaagacaa 7980
gatctgcttt ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc 8040
tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa 8100
gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag 8160
tcagtgtgga aaatctctag cagggcccgt ttaaacccgc tgatcagcct cgactgtgcc 8220
ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg 8280
tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag 8340
gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga 8400
caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag 8460
ctggggctct agggggtatc cccacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt 8520
ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc 8580
tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg 8640
gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta 8700
gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt 8760
ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat 8820
ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa 8880
tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttaattctgt ggaatgtgtg tcagttaggg 8940
tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag 9000
tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg 9060
catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact 9120
ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag 9180
gccgaggccg cctctgcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc 9240
ctaggctttt gcaaaaagct cccgggagct tgtatatcca ttttcggatc tgatcagcac 9300
gtgttgacaa ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt ataatacgac aaggtgagga 9360
actaaaccat ggccaagttg accagtgccg ttccggtgct caccgcgcgc gacgtcgccg 9420
gagcggtcga gttctggacc gaccggctcg ggttctcccg ggacttcgtg gaggacgact 9480
tcgccggtgt ggtccgggac gacgtgaccc tgttcatcag cgcggtccag gaccaggtgg 9540
tgccggacaa caccctggcc tgggtgtggg tgcgcggcct ggacgagctg tacgccgagt 9600
ggtcggaggt cgtgtccacg aacttccggg acgcctccgg gccggccatg accgagatcg 9660
gcgagcagcc gtgggggcgg gagttcgccc tgcgcgaccc ggccggcaac tgcgtgcact 9720
tcgtggccga ggagcaggac tgacacgtgc tacgagattt cgattccacc gccgccttct 9780
atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg 9840
gggatctcat gctggagttc ttcgcccacc ccaacttgtt tattgcagct tataatggtt 9900
acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta 9960
gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctgtataccg tcgacctcta 10020
gctagagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 10080
caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag 10140
tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 10200
cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 10260
gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 10320
tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 10380
agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 10440
cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 10500
ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 10560
tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 10620
gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 10680
gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 10740
gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 10800
ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 10860
ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 10920
ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 10980
gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 11040
ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 11100
tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 11160
ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 11220
gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 11280
tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 11340
cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 11400
ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 11460
gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 11520
caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 11580
gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 11640
ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 11700
tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 11760
caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 11820
tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 11880
cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 11940
ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 12000
aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 12060
tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 12120
gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 12180
gaaaagtgcc acctgacgtc gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct 12240
cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt 12300
ggaggtcgct gagtagtgcg cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga 12360
caattgcatg aagaatctgc ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc 12420
cagatatacg cgttgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc 12480
attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc 12540
tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt 12600
aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca 12660
cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg 12720
taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca 12780
gtacatctac gtattagtca tcgctattac catgg 12815
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caccgggaag ctgcaacaca gactg 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccttcgacgt tgtgtctgac caaa 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aagcggaaac atttctaggt 20
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tacacttctt ttcttctgat gactgg 26

Claims (2)

1.一种敲除Atg12基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）合成SgRNA靶序列，所述SgRNA的靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
2）将步骤1）合成的SgRNA靶序列与酶切过的LentiCRISPR-V2载体连接、转化成LentiCRISPRV2-Atg12慢病毒载体；
3）将步骤2）构建的LentiCRISPRV2-Atg12慢病毒载体与包装载体共转染到293FT细胞，生产慢病毒，将慢病毒侵染到HCT8人结肠细胞系，敲除Atg12基因；
用于合成步骤1）所述SgRNA靶序列的引物核苷酸序列如SEQ ID NO：3~4所示；
步骤3）所述LentiCRISPRV2-Atg12慢病毒载体、pMD2.G和psPAX2包装载体质量比为10～11：3.5～4.5：10～11，混合后转染293FT细胞。
2.权利要求1所述方法在构建Atg12基因敲除的HCT8人结肠癌细胞系中的应用。
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