CN111019991A - 一种酶解制备祁蛇多肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酶解制备祁蛇多肽的方法，包括以下步骤：将新鲜宰杀的祁蛇去皮、去内脏后洗净沥干，置于绞肉机中搅成肉糜；将肉糜置于容器中，并向容器内加入重量为肉糜2.5倍的水，搅拌均匀，得混合溶液，将混合溶液静置2～2.5小时；然后依次向混合溶液中加入木瓜蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶和碱性酶进行酶解，从而将祁蛇中蕴含的丰富活性蛋白质片段切割成活性更强、更易吸收的小分子多肽。该法可显著提高祁蛇蛇肉中多肽的溶出率，在祁蛇的药用及多肽的制备领域均有较高的应用价值。

Description

一种酶解制备祁蛇多肽的方法
技术领域
本发明涉及动物多肽分解技术领域，尤其是涉及一种酶解制备祁蛇多肽的方法。
背景技术
祁蛇(蕲蛇)为常用中药，始载于《开宝本草》。祁蛇肉性温、咸，入肝经，有小毒，有祛风湿，舒筋络，止痉，攻毒功效。现代医学研究证明，祁蛇主要活性成分有蛋白质和氨基酸、磷脂类以及核苷类成分以及甾体、多肽、矿物质等。祁蛇水提物能激活纤溶***；醇提物可增强巨噬细胞吞噬能力，显著增加炭粒廓清率。
目前，国内以祁蛇为主药通过传统干浸法制备的常见市售药酒多达30余种，其中较经典的为祁蛇药酒(按部颁标准中药成方制剂第五册执行，曾由祁门药厂生产，畅销全国，享誉东南亚，现已停产)、虎骨酒(由天津老字号达仁堂制药二厂生产)、蕲蛇风湿酒(国药准字Z43020964，九芝堂股份有限公司生产)及蕲蛇药酒(国药准字Z36021523，江西众源药业有限公司生产)。近期本项目组在分析国内部分蛇酒样品时均发现有不同程度的絮状沉淀，而酒中的蛋白质/多肽的含量均较低，有的样品几乎难以检出蛋白质/多肽。据文献报道，通过传统提取方法制备的蕲蛇乙醇提取物中的总蛋白含量为1.360g，而其中肽类成分的融出率仅为5.48％[3-4]。显然，祁蛇作为我国特有的名贵的动物类药材，通过传统的水提、酒提，其中的有效多肽往往难以有效溶出，损失率高达84％以上，从而造成了天然名贵药材资源的极大浪费。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶解制备祁蛇多肽的方法，解决传统水提、酒提工艺多肽难以有效分解溶出的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种酶解制备祁蛇多肽的方法，包括以下步骤：
1)、将新鲜宰杀的祁蛇去皮、去内脏后洗净沥干，置于绞肉机中搅成肉糜；
2)将肉糜置于容器中，并向容器内加入重量为肉糜2.5倍的水，搅拌均匀，得混合溶液，将混合溶液静置2～2.5小时；
3)将步骤2)中的混合溶液加热至45～55℃，再向容器中加入木瓜蛋白酶静置酶解1.5～3小时；所述木瓜蛋白酶的加入量按照与混合溶液的体积比为2～4g/100ml进行添加；
4)待步骤3)酶解完成后向混合溶液中加入枯草杆菌中性蛋白酶静置酶解1～3小时，酶解过程中混入溶液的温度保持45～55℃；所述枯草杆菌中性蛋白酶的加入量按照与混合溶液的体积比为2～4g/100ml进行添加；
5)待步骤4)酶解完成后向混合溶液中加入碱性酶静置酶解1～3小时，酶解过程中混入溶液的温度保持45～55℃；所述碱性酶的加入量按照与混合溶液的体积比为2～4g/100ml进行添加。
所述木瓜蛋白酶酶活力为10万u/g，枯草杆菌中性蛋白酶酶活力为10万 u/g，碱性酶酶活力为10万u/g。
优选的，所述步骤3)中木瓜蛋白酶的质量与混合溶液的体积比为 3.5g/100ml；静置时间为2.5小时。所述步骤4)中枯草杆菌中性蛋白酶的质量与混合溶液的体积比为3.5g/100ml；静置时间为1.5小时。所述步骤5)中碱性酶的质量与混合溶液的体积比为2g/100ml或4g/100ml；静置时间为2.5 小时。所述步骤3)、步骤4)和步骤5)中的温度保持在55℃。
本发明的有益效果：通过本发明的酶解工艺对祁蛇进行深加工与利用，将祁蛇中蕴含的丰富活性蛋白质片段切割成活性更强、更易吸收的小分子多肽，为探索更高效利用祁蛇资源提供理论依据。通过木瓜蛋白酶酶、枯草杆菌中性蛋白酶和碱性酶共同作用，对祁蛇蛇肉蛋白质中不同位置的分子链进行酶解切断，从而得到不同形式的多肽，增加祁蛇多肽的多样性和整体含量。
以下将结合附图和实施例，对本发明进行较为详细的说明。
附图说明
图1为本发明酶解液双波长检测色谱图。
图2为本发明中酶解时间对图1 D峰含量的影响。
具体实施方式
实施例1：一种酶解制备祁蛇多肽的方法，包括以下步骤：
1)、将新鲜宰杀的祁蛇去皮、去内脏后洗净沥干，置于绞肉机中搅成肉糜；
2)将肉糜置于容器中，并向容器内加入重量为肉糜2.5倍的水，搅拌均匀，得混合溶液，将混合溶液静置2～2.5小时，在祁蛇内源酶的作用下先进行酶解；
3)将步骤2)中的混合溶液加热至45～55℃，调节混合溶液的PH值至 PH5.5，再向容器中加入木瓜蛋白酶静置酶解1.5～3小时。所述木瓜蛋白酶酶活力为10万u/g，所述木瓜蛋白酶的加入量按照与混合溶液的体积比为2～ 4g/100ml进行添加；
4)待步骤3)酶解完成后，调节混合溶液的PH值至PH6.8，再向混合溶液中加入枯草杆菌中性蛋白酶静置酶解1～3小时，酶解过程中混入溶液的温度保持45～55℃。所述枯草杆菌中性蛋白酶酶活力为10万u/g，所述枯草杆菌中性蛋白酶的加入量按照与混合溶液的体积比为2～4g/100ml进行添加；
5)待步骤4)酶解完成后，调节混合溶液的PH值至PH8.2，再向混合溶液中加入碱性酶静置酶解1～3小时，酶解过程中混入溶液的温度保持45～55℃；所述碱性酶酶活力为10万u/g，所述碱性酶的加入量按照与混合溶液的体积比为2～4g/100ml进行添加。
根据以上三种酶的最佳酶解温度，所述步骤3)、步骤4)和步骤5)中的混合溶液温度保持在55℃。
实施例2：
以下通过实验分析各种酶的添加量和酶解时间对多肽含量的影响。
1 材料
1.1 材料与试剂
试验用祁蛇来源于安徽省祁门县蛇伤研究所祁蛇养殖与研究中心，试验个体均为1±0.2KG的健康成年活蛇；木瓜蛋白酶食品级(99％)购于广西南宁市庞博生物有限公司生产，枯草杆菌中性蛋白酶(食品级99％)购于上海翼菁实业有限公司生产，碱性蛋白酶(食品级99％)购于苏州卓鑫生物科技有限公司生产；
乙睛(色谱纯)购于merk公司；三氟乙酸(分析纯)购于萨恩化学技术(上海)有限公司；超纯水(≥18.0Ω)来源于安徽省祁门县蛇伤研究所。
1.2 仪器与设备
自制绞肉机，安徽省祁门县蛇伤研究所；3K15型低温高速离心机，Sigma 公司；安捷伦1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；JAP电子天平，上海越平科学仪器有限公司；PHS-3E型Ph计，雷磁；HWS-24电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司。
2 试验方法
2.1 样品测定分析
2.1.1 色谱分析条件
色谱***：安捷伦1260；色谱柱：大连伊利特SinoChrom ODS-BP(250mm*4.6mm,5μm)；检测器及检测波长：二极管阵列检测器，波长214nm、280nm；流动相：A相为0.1％三氟乙酸，B相为0.1％三氟乙酸的70％乙睛；洗脱程序：时间0-60min，5％B(95％A)相，100％B(0％A)；柱温20℃；流速：0.5ml/min；进样量10μl。
2.1.2 供试液的制备
分别取适量步骤2)、步骤3)和步骤4)酶解完成后的混合溶液，终止反应，低温4℃，8000ω/min高速离心20分钟，抽取上清液，稀释一倍，经过 0.22μm的有机滤膜过滤后，做为供试品溶液。
3.测试结果与分析
3.1 酶法多肽指标的确定
取祁蛇酶解最终产物酶解液2ml，加无水酒精调制为42％Vol酒溶液，离心、冻干，加水2ml溶解，按照供试品的制备方法，制备供试液，按照高效液相色谱分析条件测试样品，测试样品，检测色谱图如图1所示，位于下方的谱线为280nm检测色谱，位于上方的谱线为214nm检测谱图，并按照色谱指纹将谱图划分为A、B、C、D、E五组指纹区。
对图1得知共有五组峰，分别命名为A峰、B峰、C峰、D峰、E峰。由图1可知，D峰在214nm处有较强吸收峰而在280nm处的吸收峰几与基线平齐。根据D峰的OD214/OD280比值推断其为高纯度的单一多肽成分。
3.2 酶加入量对酶解的影响
依次加入木瓜蛋白酶酶、枯草杆菌中性蛋白酶、碱性酶酶解祁蛇，加酶量与D峰含量(g/100ml)变化见表1。
表1 不同酶加入量对酶解所得D峰含量(g/100ml)变化
Figure RE-GDA0002405545770000051
由表1可见，当木瓜酶的加入量为3.5％时酶解多肽D峰含量达到最大值，故确定木瓜酶的最佳用量为3.5％；枯草杆菌中性蛋白酶加入量为3.5％时达到最大值，继续加大酶量并不能有效提高D峰的含量，故确定枯草杆菌中性蛋白酶的最佳加入量为3.5％；碱性酶加入量为4％时达到峰值。
3.3 酶解时间对酶解影响
以步骤2)中加入3％的木瓜蛋白酶酶、步骤3)中加入3％的枯草杆菌中性蛋白酶、步骤4)中加入3％的碱性酶酶解祁蛇，按照酶解反应不同的时间与D峰含量(g/100ml)做图，如图2所示，图2中排列在第一位的为PH8.2/ 碱性酶3％/55度条件下的柱形图，排在第二位的为PH6.8/枯草酶3％/55度条件下的柱形图，排在第三位的为PH5.5/木瓜酶3％/55度条件下的柱形图。
由图2可见，木瓜酶酶解时间的2.5小时，酶解多肽D峰值达到最大值，若继续增加木瓜酶酶解时间，多肽D峰无显著变化，故确定木瓜酶的酶解最佳时间为2.5小时；中性枯草酶酶解时间为1.5小时基本达到最大值，若继续酶解，多肽D峰上升的趋势也不明显，故确定中性酶酶解最佳时间为1.5小时；碱性酶酶解时间为1小时D峰含量较1.5、2及2.5小时均有所增高，在 3小时时达到最大值，但增量不大，考虑的后期加工的效率，故确定碱性酶酶解的优化时间为1小时。
以上结合附图对本发明进行了示例性描述。显然，本发明具体实现并不受上述方式的限制。只要是采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进；或未经改进，将本发明的上述构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种酶解制备祁蛇多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、将新鲜宰杀的祁蛇去皮、去内脏后洗净沥干，置于绞肉机中搅成肉糜；
2)将肉糜置于容器中，并向容器内加入重量为肉糜2.5倍的水，搅拌均匀，得混合溶液，将混合溶液静置2～2.5小时；
3)将步骤2)中的混合溶液加热至45～55℃，再向容器中加入木瓜蛋白酶静置酶解1.5～3小时；所述木瓜蛋白酶的加入量按照与混合溶液的体积比为2～4g/100ml进行添加；
4)待步骤3)酶解完成后向混合溶液中加入枯草杆菌中性蛋白酶静置酶解1～3小时，酶解过程中混入溶液的温度保持45～55℃；所述枯草杆菌中性蛋白酶的加入量按照与混合溶液的体积比为2～4g/100ml进行添加；
5)待步骤4)酶解完成后向混合溶液中加入碱性酶静置酶解1～3小时，酶解过程中混入溶液的温度保持45～55℃；所述碱性酶的加入量按照与混合溶液的体积比为2～4g/100ml进行添加。
2.如权利要求1所述的酶解制备祁蛇多肽的方法，其特征在于：所述木瓜蛋白酶酶活力为10万u/g，枯草杆菌中性蛋白酶酶活力为10万u/g，碱性酶酶活力为10万u/g。
3.如权利要求1所述的酶解制备祁蛇多肽的方法，其特征在于：所述步骤3)中木瓜蛋白酶的质量与混合溶液的体积比为3.5g/100ml；静置时间为2.5小时。
4.如权利要求1所述的酶解制备祁蛇多肽的方法，其特征在于：所述步骤4)中枯草杆菌中性蛋白酶的质量与混合溶液的体积比为3.5g/100ml；静置时间为1.5小时。
5.如权利要求1所述的酶解制备祁蛇多肽的方法，其特征在于：所述步骤5)中碱性酶的质量与混合溶液的体积比为2g/100ml或4g/100ml；静置时间为2.5小时。
6.如权利要求1所述的酶解制备祁蛇多肽的方法，其特征在于：所述步骤3)、步骤4)和步骤5)中的温度保持在55℃。
7.如权利要求1所述的酶解制备祁蛇多肽的方法，其特征在于：所述步骤3)在添加木瓜蛋白酶之前，先对混合溶液的PH值进行调节，调节至PH5.5；所述步骤4)在添加枯草杆菌中性蛋白酶之前，先对混合溶液的PH值进行调节，调节至PH6.8；所述步骤5)添加碱性酶之前，先对混合溶液的PH值进行调节，调节至PH8.2。
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