KR20030080002A - 순환 암 세포를 신속하고 효과적으로 분리하기 위한 방법및 시약 - Google Patents

순환 암 세포를 신속하고 효과적으로 분리하기 위한 방법및 시약 Download PDF

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Abstract

본 발명은 순환 종양 세포를 검출하고, 상기 세포를 종양 소인 관련 분자의 변화에 대해 평가하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

순환 암 세포를 신속하고 효과적으로 분리하기 위한 방법 및 시약{METHODS AND REAGENTS FOR THE RAPID AND EFFICIENT ISOLATION OF CIRCULATING CANCER CELLS}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 1999년 2월 12일자로 출원된 미국 특허 출원 제09/248,388호의 일부 계속 출원으로서, 이는 본 명세서에서 참고로 인용한다. 또한, 본 출원은 1998년 2월 12일자로 출원된 미국 가명세서 출원 제60/074,535호, 1998년 11월 30일자로 출원된 동제60/110,279호, 1998년 11월 30일자로 출원된 동제60/110,202호, 2001년 2월 16일자로 출원된 동제60/268,859호, 2001년 2월 20일자로 각각 출원된 동제60/269,270호 및 동제60/269,271호의 우선권을 주장한다. 상기의 가명세서 출원 모두의 개시 내용은 본 명세서에서 참고로 인용한다.
발명의 분야
본 발명은 종양학 및 진단 테스트 분야에 관한 것이다. 본 발명은 암의 검진, 시기 결정, 화학 요법 치료 반응을 위한 모니터링, 암 재발 등에 대하여 유용하다. 보다 상세하게는, 본 발명은 종양 세포, 또는 생물학적 샘플로부터 분리한 기타의 희귀 세포의 분석 및 계수를 돕는 시약, 방법 및 테스트 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은 핵산, 단백질 및 탄수화물과 같은 종양 소인을 분석하여 치료적처치 전략 디자인에서 임상의를 돕기 위한 물질 및 방법을 제공한다.
발명의 배경
미국에서는 매년 약 600,000 명의 새로운 암 발병이 진단되고 있으며, 미국 내 5명중 1명꼴로 암 또는 이의 치료와 관련된 합병증으로 사망하고 있다. 이러한 질환의 치료 및 진단을 개선시키고자 하는 것에 상당한 노력을 지속적으로 기울이고 있다.
대부분의 암 환자는 환자의 원발 종양으로 인하여 사망하지는 않는다. 그 대신에 환자들은 초기 종양으로부터 분리되어 신체를 통하여 종종 원위의 부위로까지 이동하는 악성 세포에 의하여 형성된 다발성의 광범위한 종양 콜로니로의 전이에 의하여 사망하게 된다. 원발 종양이 초기 시기에서 검출될 경우, 이는 종종 수술, 방사선 치료 또는 화학요법 또는 이들 치료법의 조합에 의하여 제거될 수 있다. 불행하게도, 전이성 콜로니는 검출과 제거가 더욱 곤란하며, 종종 이를 성공적으로 치료하는 것이 불가능한 경우도 있다. 그러므로, 임상적인 측면에서, 전이는 암의 정상적인 진행 과정에서의 제2의 주요한 사건으로서 간주될 수 있다. 또한, 전이능은 악성 종양을 독특하게 특성화하는 성질이 된다.
암 전이는 순차적인 사건의 복합적 시리즈를 포함한다. 이는
1) 원발 유전자좌로부터 주변 조직으로의 연장,
2) 체내 공동 및 혈관으로의 침투,
3) 순환계를 통하여 원위 부위로 종양 세포의 방출,
4) 정지 부위에서의 조직의 재침습,
5) 종양 세포 생존, 혈관신생 및 종양 성장을 돕기 위한 새로운 환경으로의 적응 등이 있다.
암 및 암 전이의 복잡성 및 수년간 암 환자의 치료에서의 실패를 바탕으로 하여 치료를 가이드하고 전이 또는 재발에 대한 이러한 치료의 효과를 모니터하기 위한 진단 테스트를 개발하기 위한 많은 연구가 수행되어 왔었다. 이러한 테스트는 아마도 암의 검진, 유방 종양에 대한 유방조영술 또는 전립선암에 대한 직장 손가락 검사와 같은 비교적 덜 복잡한 테스트를 대체하는데 사용될 수 있다. 이러한 목적에 대하여 지난 20 년간 다수의 테스트가 개발되어 왔었다. 제1의 시도 중 하나는 암배아 항원 (CEA)에 대한 면역 분석 제제가 있다. 이러한 항원은 태아 세포에서 나타나며, 특정의 암에서의 종양 세포에 대하여 다시 나타난다. CEA 뿐 아니라, 기타의 많은 종양 항원, 예컨대 PSA, CA 15.3, CA125, PSMA 및 CA27.29에 대한 테스트의 유용성을 평가하고자 하는 시도가 이루어져 왔었다. 그러나, 혈액중의 이러한 항원의 출현은 일반적으로 전조가 나타나는 것은 아니며, 종종 환자에 대한 가망이 없을 때 검출되곤 한다. 그러나, 최근 수년간 한 테스트가 암, 환언하면 전립선암에 대한 전립선 특이성 항원 (PSA)의 조기 검출에서의 유용성이 있는 것으로 입증되었다. 추적 신체 검사 및 생검을 사용한 경우, PSA 테스트는 최량으로 치료할 경우 전립선암을 조기에 검출하는데 괄목할만한 역할을 한다.
PSA 테스트의 성공에도 불구하고, 이러한 테스트에 대하여서 많은 과제가 요구되고 있다. 예를 들면, 고 농도의 PSA는 항상 암과 상관관계를 갖지도 않으며 종양의 전이성 잠재력의 징후가 되는 것으로 나타나지도 않는다. 이는 부분적으로PSA가 정상의 전립선 조직 뿐 아니라, 미지의 기타 요인의 성분이 된다는 사실에 기인할 수 있다. 게다가, 높은 비율의 전립선암 환자는 생명을 위협하지는 않는 국소 질환을 지속적으로 갖게 될 것이다. 전이될 암을 가진 환자와 그러하지 않은 암 환자간의 보다 우수한 조화를 얻기 위한 요구를 토대로 하여 전립선 세포가 순환중인지의 여부를 결정하기 위한 시도가 이루어졌었다. 고농도의 PSA 농도 및 생검 데이타 이외에, 순환중인 종양 세포의 존재는 환자가 얼마나 강력하게 치료되어야만 하는지에 관한 징후를 나타내게 된다.
순환중인 전립선 종양 세포의 존재를 결정하기 위한 하나의 접근법은 혈중의 PSA에 대한 전령 RNA의 발현에 대하여 테스트하는 것이다. 이는 혈액 샘플로부터 단핵 세포를 밀도 분리하고, 그후 이들 세포로부터 mRNA 모두를 분리하고, PSA에 대한 역전사 효소 PCR을 수행하는 힘든 작업을 통하여 수행된다. 오늘날까지, 문헌 [Gomella LG.J. of Urology, 158:326-337 (1997)], 혈중 이러한 세포의 존재와, 강력한 치료를 요하는 환자를 예측하는 능력간에는 어떠한 상관관계도 존재하지 않는다. 정량적으로 수행하는, 다수의 경우에서 즉 생물학적 샘플 단위 부피당 종양 세포의 수를 결정하는 것이 불가능하지 않다면 PCR은 곤란하다는 것이 주목할만하다. 또한, 이러한 기법을 사용할 경우 거짓 양성 반응이 관찰되곤 하였다. 또다른 단점은 조사한 샘플 크기를 기초로 한 이러한 기법의 감도에는 유한의 실제 한계가 존재한다는 점이다. 통상적으로 이러한 테스트는 적혈구 세포를 방해하지 않으면서 정제된 105∼106개의 세포에 수행된다. 이는 혈액 0.1 ㎖당 종양 세포 1 개의 실제적인 감도 하한치에 해당한다. 그래서, 시그날이 검출될 수 있기 이전에 혈액 1 ㎖당 종양 세포 약 10 개가 존재하여야만 한다. 추가의 고려 사항으로서, 종양 세포는 종종 유전학적으로 불안정하다. 따라서, 유전적 재배열 및 서열 변화를 갖는 종양 세포는, PCR 프라이머와 표적 서열간의 필수 서열 상보성이 손실될 수 있기 때문에, PCR 분석에서 존재하지 않을 수 있다.
요컨대, 유용한 진단 테스트는 매우 민감하고 신뢰성이 있는 정량적 테스트가 되어야만 한다. 혈액 1 ㎖당 단일의 종양 세포의 존재를 검출할 수 있는 혈액 테스트를 개발할 수 있을 경우, 순환중인 총 세포 평균 3,000∼4,000 개에 해당하게 된다. 동물에서의 종양을 형성하기 위한 접종량 연구는 세포 3,000∼4,000개의 주사가 실제로 종양의 형성을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다. 추가로, 3,000∼4,000 개의 순환중인 세포가 종양 중의 총 세포 0.01%를 나타내는 경우, 이는 약 4×107개의 총 세포를 포함하게 된다. 이러한 수의 세포를 포함하는 종양은 현존하는 어떠한 기법에 의하여서도 가시화될 수 없다. 그래서, 종양 세포가 암의 조기 시기에서 탈락되는 경우, 전술한 감도를 갖는 테스트는 암을 검출하게 된다. 종양 세포가 종양 크기와 관련한 특정의 기능적 관계에서 탈락되는 경우, 정량적 테스트는 종양 부하를 평가하기에 이로운 테스트가 된다. 현재까지 아주 이른 시기의 암에서의 순환중인 암 세포의 존재와 관련한 정보는 존재하지 아니하였었다. 또한, 이러한 세포의 존재 및 이러한 정보의 잠재력에 관한 의학 문헌에서도 상당한 의구심이 존재한다. 일반적인 견해로는 종양은 초기에는 한 부위에 국한되어 있으며, 그리하여 질환의 조기 시기에서는 순환중인 세포가 존재한다 하더라도 소수가 존재하게 된다. 또한, 암 세포를 조기에 검출할 수 있는 능력이 유용한 정보를 제공하게 될 것이라는 것에 대하여서도 의구심이 존재하게 된다.
이러한 사항을 토대로 하여, 2차 종양의 형성 이전에 전이의 잠재력을 갖는 순환중인 이들 세포를 식별하는 방법이 매우 바람직한데, 특히 암에서 조기에 식별하는 것이 바람직하다. 이러한 테스트가 종래의 면역분석법에 비하여 잇점을 갖는다는 것을 인식하기 위하여, 감도가 매우 높은 면역분석법은 작용성 감도의 하한이 10-17몰이 되는 것으로 간주한다. 하나의 종양 세포가 1 ㎖의 혈액으로부터 포획되어 이를 분석할 수 있을 경우, 세포당 100,000 개의 수용체로 가정하여 표면 수용체의 몰수는 10-19몰이 된다. 약 300 개의 분자가 세포상에서 검출될 수 있기 때문에, 이러한 분석은 10-22몰 정도의 작용성 감도를 갖게 되는데, 이는 주목할만한 것이다. 이러한 희귀 세포의 분리에서의 감도 레벨을 달성하고, 그리고, 이의 특성화를 손상시키거나 또는 방해하지 않도록 하는 방식으로 이러한 세포를 분리하는 것은 엄청난 일이 된다.
다수의 실험실 및 임상적 절차는 생물학적 샘플로부터 희귀 세포를 분리하기 위한 생체특이성 친화력 반응을 사용한다. 이러한 반응은 진단 테스트, 또는 광범위한 표적 물질, 특히 생물학적 실체, 예컨대 세포, 단백질, 박테리아, 바이러스, 핵산 서열 등의 분리에 통상적으로 사용된다.
해당 물질과, 표적 물질이 특이적으로 결합되는 또다른 물질간의 복합체 형성에 기초한 전술한 표적 물질을 분석 또는 분석하는 다양한 방법이 이용 가능하다. 미결합 물질로부터의 복합체의 분리는 중력을 이용하여, 예를 들면 침강 또는, 표적 물질에 커플링된 미분 입자 또는 비이드의 원심분리에 의하여 달성될 수 있다. 필요할 경우, 이러한 입자 또는 비이드는 결합/유리 분리 단계를 촉진하기 위하여 자성을 띨 수도 있다. 자기 입자는 면역 및 기타의 생체특이성 친화력 반응에서의 용도로 인하여 당업계에 주지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,554,088호 및 문헌 [Immunoassays for Clinical Chemistry, p. 147-162, Hunter et al. eds., Churchill Livingston, Edinburgh (1983)]. 일반적으로, 이를 위하여 자기 또는 중력 분리를 돕는 임의의 물질을 사용할 수 있다. 그러나, 이러한 자기 분리 수단이 선택한 방법이 된다는 것은 자명할 것이다.
자기 입자는 대 (1.5∼약 50 미크론), 소 (0.7∼1.5 미크론) 또는 콜로이드 (<200 ㎚)의 크기를 기준으로 하여 분류할 수 있으며, 또한, 이들은 나노입자로 지칭된다. 또한, 자성 유체 또는 자성 유체형 물질로 주지되어 있고 통상의 자성 유체의 다수의 특성을 갖는 콜로이드 크기는 때때로 본 명세서에서 콜로이드성, 초상자성 입자로서 언급된다.
전술한 유형의 작은 자기 입자는 생체 특이성 친화력 반응을 비롯한 분석에서 매우 유용한데, 이는 생체작용성 중합체 (예, 단백질)로 간편하게 코팅되고, 매우 큰 표면적을 제공하며, 타당한 반응 역학을 제공하기 때문이다. 0.7∼1.5 미크론의 자기 입자는 예를 들면 미국 특허 제3,970,518호, 동제4,018,886호, 동제4,230,685호, 동제4,267,234호, 동제4,452,773호, 동제4,554,088호 및동제4,659,678호를 비롯한 특허 문헌에 기재되어 있다. 이러한 특정의 입자는 면역학적 시약에 대한 유용한 고형 지지체로서 개시되어 있다.
자기 분리가 수행될 수 있는 효율 및 자기 표지된 세포의 회수 및 순도는 다수의 요인에 의하여 변경될 것이다. 이러한 요인으로는 하기와 같은 것이 있다.
·분리하고자 하는 세포의 수,
·이러한 세포의 수용체 또는 에피토프 밀도,
·세포당 자기 부하,
·자기 물질의 비특이성 결합 (NSB),
·포획된 비표적 세포의 잔류물
·사용된 기법,
·용기의 특성,
·용기 표면의 특성
·매체의 점도,
·사용된 자기 분리 장치.
시스템의 비특이성 결합의 정도가 실질적으로 일정할 경우, 통상의 경우에서와 같이 표적군이 감소하는 것과 마찬가지로 순도도 감소하게 된다.
예를 들면, 초기 혼합물 중에서 0.25%인 모집단의 80%를 회수하는 0.8% NSB를 포함하는 시스템은 순도가 25%가 된다. 반면, 초기 모집단이 0.01% (106개의 방관자 세포 중의 1 개의 표적 세포)이고 NSB는 0.001%인 경우, 순도는 8%가 된다.그래서, 검체 혼합물 중의 고순도의 표적 물질은 표적 물질의 보다 특이적이고 효율적인 수집을 생성하게 된다. 희귀 세포, 예컨대 순환중인 존재하는 상피 유도 종양 세포와 같은 희귀 세포의 검출 및 분석을 돕기 위하여서는 극도로 낮은 비특이성 결합이 필요하거나 또는 이롭게 된다.
표적화된 세포의 모집단이 작을수록, 자기 표지하고 회수하는 것이 더욱 곤란하게 될 것이라는 사실은 다소 명백하지는 않다. 또한, 표지 및 회수는 사용된 자기 입자의 특성에 따라 크게 달라지게 된다. 예를 들면, 세포를 거대한 자기 입자, 예컨대 Dynal 비이드를 사용하여 배양하는 경우, 세포는 시스템의 혼합에 의하여 생성된 충돌을 통하여 표지되는데, 이는 비이드가 너무 커서 효과적으로 분산되지 못하기 때문이다. 그래서, 세포가 혈액 1 ㎖ 중에 세포 1 개 이하의 빈도로 모집단중에 존재하는 경우, 표지된 표적 세포의 확율은 시스템에 첨가되는 자기 입자의 수 및 혼합 시간의 길이와 관련되어 있다. 상당 시간 동안 이러한 입자와 세포를 혼합하는 것이 해로울 수 있기 때문에, 입자의 농도는 가능한한 크게 증가시키는 것이 필요할 것이다. 그러나, 분리시 다량의 자기 입자와 혼합된 희귀 세포 대신에 기타의 혈액 세포와 혼합된 희귀 세포를 사용할 수 있기 때문에, 첨가될 수 있는 자기 입자의 함량에 대한 한계치가 존재한다. 분리시 다량의 자기 입자와 혼합되는 상태는 해당 세포를 계수하거나 또는 이들을 조사할 수 있는 능력을 크게 개선시키지는 않는다.
상기를 기초로 하여, 높은 자기성, 낮은 비특이성 결합, 콜로이드성 자기 입자를 사용한 외부장 장치를 사용한 고 구배 자기 분리는, 특히 해당 세포 서브세트가 전체 모집단의 작은 부분을 포함하는 경우 진핵 세포의 혼합 모집단으로부터 해당 세포 서브세트를 분리하기 위하여 선택한 방법이다. 이러한 물질은 분산성을 갖기 때문에 혈중 종양 세포와 같이 희귀 사건을 용이하게 찾고 자기 표지시키게 된다. 종양 세포 분석에 대한 자기 분리가 성공적이 되도록 하기 위하여, 자기 입자는 조혈 세포상에 존재하지 않는 에피토프에 대하여 특이성을 지녀야만 한다.
발명의 개요
일단 종양 세포가 순환중인 것으로 판별될 경우, 분리된 세포를 표현형 또는 생화학적으로 추가로 특성화하는 것이 바람직하다. 그래서, 악성 표현형과 관련된 특정의 종양 소인 관련 분자, 예컨대 핵산 분자, 단백질 또는 탄수화물을 분석할 수 있다. 임상의가 암의 유형을 진단하고 화학치료적 인터벤션 전략의 효율을 평가하는 것을 돕기 위하여 순환중인 것으로 판별된 종양 세포내에 또는 세포상에 존재하는 소정의 종양 소인 관련 분자의 발현도를 측정하는 방법이 제공된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 악성의 존재에 대하여 환자를 평가하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 조혈 및 비조혈 악성 세포를 포함할 것으로 의심되는 혼합 세포군을 포함하는 환자로부터 생물학적 표본을 얻는 방법이 수반된다. 그후, 기타의 샘플 성분을 실질적으로 제외시키도록 악성 세포와 특이적으로 반응하는 검출 가능하게 표지된 리간드와 생물학적 표본을 혼합한 샘플을 준비한다. 샘플은 상기 악성 세포를 특이적으로 표지시키는 1 이상의 시약과 접촉하게 된다. 이러한 샘플의 분석은 표지된 세포의 존재 및 수, 악성의 존재를 표시하는 세포의 검출을 측정하기 위하여 수행하며, 존재하는 표지된 세포의 수가 클수록, 악성의 엄중성이 더 크게 된다. 이러한 방법은 1 이상의 종양 소인 관련 분자내에서의 변화를 위한 표지된 세포의 평가를 더 포함한다. 한 구체예에서, 이러한 평가는 결합 친화력을 갖는 검출 가능하게 표지된 시약을 상기 분자와 접촉시키는 것을 포함한다. 종양 소인 관련 분자로는 단백질, 핵산 또는 탄수화물 등이 될 수 있으며, 이들은 종래의 방법을 사용하여 평가된다.
이러한 방법의 한 구체예에서, 악성 세포는 다중변수 유세포분석, 면역형광 현미경 검사, 레이저 주사 세포측정, 명시야 베이스 화상 분석, 모세량 측정법, 스펙트럼 화상 분석 매뉴얼 세포 분석, CellSpotter (등록상표) 분석, Cell Tracks 분석 및 자동화된 세포 분석으로 구성된 군에서 선택된 방법에 의해 분석된다.
본 발명의 방법은 종양을 제거하기 위하여 의료, 방사선 또는 수술 치료후 순환중인 잔여 암 세포를 분석하는데 사용할 수 있다. 또한, 이러한 방법은 질환의 발생, 재발 및/또는 진행의 징후로서 포함된 종양 소인 분자에서의 변화, 순환중인 종양 세포의 존재 및 수에 대하여 환자를 평가하기 위하여 수년간 주기적으로 수행할 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 이러한 방법은 치료의 효율을 예측하기 위한 수단으로서, 종양 소인 관련 분자에서의 변화를 측정하는 방법이 제공된다. 이러한 방법의 예로는 환자로부터 샘플을 얻는 단계; 존재할 경우 샘플로수터 순환중인 악성 세포를 분리 및 계수하는 단계; 치료의 효능을 예측하기 위한 수단으로서 샘플중에 존재하는 각각의 세포상에서의 1 이상의 소정의 종양 소인 관련 분자의 수를 측정하는 단계를 포함한다. 또한, 이러한 방법을 사용하여 시간 경과에 따른 소정의 치료 섭생의 적절한 투여량을 평가하고 및/또는 치료의 효율을 모니터링하는 잇점을 갖는다. 그래서, 본 발명의 방법은 단순 혈액 테스트를 기초로 한 "전신" 생검을 제공하게 된다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 순환으로부터 분리된 종양 세포를 배양하는 방법이 제공된다. 이러한 세포는 이에 감도를 평가하기 위한 치료제와 접촉될 수 있다. 또한, 이러한 세포는 변화될 수 있거나 또는 변화될 수 없는 종양 소인 관련 분자에 대한 공급원을 제공한다. 그래서, 본 발명은 순환으로부터 분리된 종양 세포 또는 이의 배양물을 모두 포함하게 된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 분리된 순환중인 종양 세포로부터 유도된 종양 백신이 개시되어 있다. 이러한 종양 백신은 순환중인 종양 세포, 이의 단편, 또는 정제된 종양 소인 관련 분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 종양 덩어리내에 존재하는 세포에 대한 순환중인 종양 세포에서의 변화를 정위치에서 식별하는 방법을 제공한다. 이러한 방법의 예로는 환자로부터 종양 덩어리의 생검 표본을 얻는 단계 및, 필요할 경우 존재하는, 환자로부터의 순환중인 종양 세포를 분리하는 단계를 포함한다. 표본 및 분리된 순환중인 종양 세포를, 다수의 종양 소인 관련 분자, 예컨대 임의로 검출 가능하게 표지된 제제를 검출하는 제제의 2중 패널과 접촉시킨다. 상기 순환중인 종양 세포 중에 그리고 상기 표본 중에 존재하는 임의의 종양 관련 소인 관련 분자를 분석하여 종양 소인 관련 분자가 상기 생검 표본에 대하여 순환중인 종양 세포내에서 변화되었는지의 여부를 결정하게 된다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 비-조혈 악성 세포의 존재에 대하여 환자의 샘플을 스크리닝하기 위한 키트가 제공된다. 본 발명의 키트의 예로는, i) 자기 코어 물질, 단백질 베이스 코팅 물질 및, 상기 베이스 코팅 물질에 직접 또는 간접 커플링된 악성 세포의 제1의 특징적 결정자에 특이적으로 결합하는 항체; ii) 악성 세포의 제2의 특징적 결정자에 대한 결합 특이성을 갖는 1 이상의 항체; iii) 분석으로부터 악성 세포를 제외한 샘플 성분을 배제시키기 위한 세포 특이성 염료; iv) CellSpotter (등록상표) 카트리지 또는 셀트랙스(Cell Tracks) 카트리지로 구성된 군에서 선택된 장치; 종양 소인 관련 분자에 대한 결합 친화력을 갖는 1 이상의 검출 가능하게 표지된 제제를 포함하는 코팅된 자기 나노입자를 포함한다. 이러한 키트는 비표적 세포에 대한 결합 친화력을 갖는 항체, 생물학적 완충액, 삼투화 완충액, 프로토콜 및 임의로 정보 시이트를 임의로 포함할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명의 샘플 제조 방법의 단계를 도시하는 개략도이다.
도 2A∼도 2D는 본 발명의 CellSpotter (등록상표) 챔버의 각종 구체예를 도시한다. 패널 2A: 2 개의 요크 각을 이루는 자석을 포함하는 홀더 및 챔버; 패널 2B: 2 개의 각을 이루는 자석으로 생성된 장에서 무작위 배치된 자기 나노입자로 표지된 세포 궤적 (쇄선으로 표기함)의 컴퓨터 시뮬레이션; 패널 2C: 페널 2B에 도시한 바와 같은 자석의 사이에 배치된 CellSpotter (등록상표) 챔버내에서의 세포의 궤적의 확대도; 패널 2D: 챔버 표면의 상면도. 수평선은 강자성 장 라인을 따라 정렬된 자기 나노입자이다.
도 3A∼도 3D는 유방암 환자로부터 처리한 혈액 샘플에서 채취한 CellSpotter (등록상표) 챔버내의 프레임의 형광 화상을 도시하는 일련의 현미경 사진을 도시한다. 패널 3A: 내부 대조예, 백혈구 및 종양 세포로부터의 핵을 도시하는 Dapi 화상; 패널 3B: 5 개의 대조 세포의 형광을 도시하는 DiOC16 화상; 패널 3C: 하나는 밝게 염색하고 다른 하나는 흐리게 염색한 2 개의 후보 종양 세포 및 5 개의 대조 세포의 형광을 도시하는 CK-PE 화상; 패널 3D: 백혈구의 형광을 도시하며 염색을 하지 않은 대조 세포를 도시하는 CD45-APC, 흐리게 PE 염색된 박스는 APC 염색을 나타내며, 다른 박스는 APC 염색을 나타내는데, 이는 CTC를 포함한다는 것을 확인한다.
도 4는 종양 세포 후보의 분류를 도시한다. 유방암 환자 샘플로부터의 종양 세포 후보의 6 개의 줄의 썸네일(thumbnail). 줄 201, 202 및 204는 종양 세포의 존재를 표시하는 것을 체크한 것이다. 복합체에서의 썸네일은 DAPI (자주색) 및 CK-PE 염색의 복합이다. L-APC = CD45 APC를 사용한 백혈구 염색, CNTL = DiOC16으로 염색한 대조 세포 염색, EC-PE = 시토케라틴-PE로 염색한 상피 세포 염색, NADYE = DAPI로 염색한 핵산.
도 5는 기지의 수의 종양 세포를 말초 혈액으로 스파이크 처리하고, 현미경 (패널 A) 및 유세포분석 (패널 B)에 의해 면역자기 선택 및 분석후 회복되는 모델 실험의 결과를 도시한다.
도 6은 환자가 이 연구에 참여한지 48, 175 및 300 일 경과후 도시한 유방의 암종의 원위 전이를 갖는 환자로부터의 혈액 10 ㎖로부터 면역자기 세포 선택후 얻은 세포 현탁액의 유세포분석을 나타낸다. 면역자기 선택후, 세포를 상피 세포 특이성 피코에리트린 (PE) 공액 모노클론 항체, 백혈구 특이성 CD45 PerCP 공액 모노클론 항체 및 핵산 염료를 사용하여 염색하였다. 핵산 염료에 대한 한계치를 통과하는 사건은 리스트모드로 포착하였으며, 샘플의 85%를 분석하였다. 종양 세포를 강조하여 흑색으로 도시하였으며, 이의 갯수는 오른쪽 상단에 표기하였다. 잔류 백혈구 및 부스러기로 구성된 배경 사건은 회색으로 도시하였다.
도 7A∼도 7H는 유방의 활성 암종을 갖는 8 명의 환자에 대한 여러 시점에서의 질환의 임상적 활성 및 혈액 10 ㎖ 중의 상피 세포 갯수를 도시한다. 이러한 질환의 임상적 활성은 하기 표 IV에서 설명한 바와 같이 카테고리 1∼4로 분류하였다. 상부측의 바아는 화학요법의 시간 길이를 나타낸다. 패널 A, 아드리아마이신 (ADR) 90 및 110 ㎎/㎡ 각각, 패널 B, ADR 30 ㎎/㎡/주, 비노렐빈 (Vin) 20 ㎎/㎡/주, ADR 160 ㎎, ADR 20 ㎎/㎡/주, 패널 C, 빈크리스틴 (Vinc) 0.7 ㎎/㎡/주, 메토트렉세이트 (MTX) 30 ㎎/㎡/주, 패널 D, 빈블라스틴 (Vinb) 7 ㎎/㎡/주, ADR 20 ㎎/㎡/주, Vinb 6 ㎎/㎡/주, 5-플루오로우라실 (5FU) 700 ㎎/㎡/주. 패널 E, Vin 20 ㎎/㎡/주; 5FU 800 ㎎/㎡/주 + 류코보린 50 ㎎/㎡/주. 패널 F, 이포스파미드 (IF) 18 ㎎/㎡/주; 5FU 850 ㎎/㎡/주 + 류코보린 35 ㎎/㎡/주, 5FU 605 ㎎/㎡/주; Vin 20 ㎎/㎡/주 + 류코보린 30 ㎎/㎡/주. 패널 G, Vin 20 ㎎/㎡/주, 패널 H, Vin 20 ㎎/㎡/주.
도 8A∼도 8D는 유방 암종의 병력이 있는 환자의 말초 혈액으로부터의 면역자기 선택된 세포의 분석후 얻은 결과를 도시하는 일련의 현미경 사진이다. 패널A, 시토케라틴에 대한 양성 염색된 수술후 3년 경과된 환자 (T2N1M0)의 세포. 패널 B, 라이트 김사로 염색된 완전 완화의 수술후 8년 경과된 환자 (T2N1M1)의 세포. 패널 C 및 패널 D, 라이트 김사로 염색된 수술후 (T2N0M0) 2년 경과된 환자의 세포. 100배의 대물 렌즈를 갖는 Pixera 디지탈 카메라를 사용하여 화상을 촬영하였다.
도 9A∼도 9C는 전립선암 환자 3명에게서 순환중인 상피 세포 갯수와 질환의 엄중도간의 상관관계를 도시하는 일련의 그래프이다.
도 10A∼도 10H는 CAP를 갖는 8 명의 환자의 혈중 0, 1, 2, 7, 12, 17 및 25 주의 간격에서 측정한 CTC 및 PSA 농도를 나타낸다. 이 기간 중에 질환의 임상적 활성의 상당한 변화가 없는 것이 환자 샘플 (A-D)에서 밝혀졌다. 그러나, 질환 활성은 이들 환자 샘플 (E-H)에서 증가하였다. 도 10E에서의 환자 샘플에 대한 CTC 계수 및 PSA 농도간의 상관 계수 R은 0.42이고, 도 10F에서의 환자 샘플의 경우에는 0.87이었고, 도 10G에서의 환자 샘플의 경우 0.65이고, 도 10H에서의 환자 샘플의 경우에는 0.98이었다. 패널의 상단부의 바아는 호르몬 치료를 받은 것을 나타낸다. 도 10B에서의 환자 샘플에서, CTC 갯수는 대조군의 99% 신뢰 레벨 이상으로 증가하지는 않았다.
도 11A 및 도 11B는 CAP를 사용한 2 명의 환자의 혈중의 0, 1, 2, 7, 12, 17 및 25 주의 간격으로 측정한 PSA 농도 및 CTC 갯수를 도시하는 한쌍의 그래프이다. 상단부의 바아는 호르몬 치료를 받은 것을 나타낸다. 환자 모두 화학요법 치료를 받았으며, 투여된 약물과 투여 시간은 도면의 하부에 화살표를 사용하여 나타냈다.
도 12는 결장암을 가진 환자에게서 순환중인 상피 세포 갯수가 종양의 수술 제거후 크게 감소하였다는 것을 나타낸 그래프이다.
도 13은 결장의 전이성 질환 환자에게서의 순환중인 상피 세포 갯수가 전이 질환의 경중도 및 정도와 함께 증가하였다는 것을 도시하는 그래프이다.
도 14는 원발성 종양으로부터 성장중인 전이로 암의 진행을 도시하는 개략도이다.
도 15A∼도 15D는 유세포분석 분석에 의하여 측정한 바와 같이 혈중 CTC 및 HER-2+-CTC를 도시하는 4 개의 산란도이다. 혈액 5 ㎖로부터 EpCAM 자성 유체 선택된 세포의 다중변수 유세포분석 분석은 유방암 환자에게서 얻었다. 백혈구 및 비이드는 작은 검은색 점으로 도시하였으며, 이의 위치는 패널에 표시하였다. 회색점은 부스러기를 도시한다. CTC는 커다란 검은색 점이고, CTC를 구별하는데 사용한 기준은 각 패널의 부위에 기재하였다. 시토케라틴 대 HER-2의 상관적 디스플레이에서, 세포가 HER-2를 발현하는 것 이상의 경계는 쇄선으로 나타냈다.
도 16A∼도 16D는 3 명의 유방암 환자의 CTC 및 세포주에서의 HER-2 밀도의 정량화를 도시하는 산란도 및 히스토그램이다. 패널 16A, 혈액 5 ㎖로부터 면역자기적으로 선택되고 CD45 및 시토케라틴 발현상에서 게이트된 백혈구, PC3 세포 및 SKBR-3 세포의 형질발현. HER-2의 발현도는 PC3 및 SKBR-3 세포에 대한 HER-2 발현의 정량적 평가를 기준으로 하여 4 개의 카테고리 (-, +, ++, +++)로 세분하였다. (-) 5,000 개 이하의 수용체에서 발현 없음 (WBC), (+) 5,000∼50,000 개의 수용체에서 발현 (PC-3), (++) 50,000∼500,000 개의 수용체에서 발현, (+++) 500,000 개 초과에서 수용체에서 발현 (SKBR-3). 패널 16B, 16C 및 16D는 3 명의 환자로부터 CTC상에서 시토케라틴 및 HER-2의 발현을 도시한다. (표 XII로부터 유방암 환자 2, 20 및 25). CTC만이 패널에 도시되었다.
도 17A∼도 17C는 질환 진행중에 HER-2 과발현의 획득을 도시하는 일련의 그래프이다. 기준선에서 HER-2-CTC를 갖는 3 명의 유방암 환자의 치료 중의 CTC 및 이의 질환이 추적중에 진행되었다. 바아는 각 시점에서 CTC의 총 갯수를 나타낸다. 각각의 바아내에서, HER-2의 여러가지 농도를 발현시키는 CTC의 갯수는로 나타내었다.
치료 일수 및 유형은 도면의 상단에 기재하였다. 패널 17C에 도시한 메게스트롤 아세테이트를 매일 투여하였다. HER-2는 치료전에 CTC상에서 발현되지 않았다. HER-2 양성으로의 전환에 의해 나타난 CTC의 표현형에서의 변화는 CTC의 갯수가 증가되었기 때문에 3명 모두의 환자에서 뚜렷이 검출되었다.
도 18A∼도 18C는 질환 진행중에 HER-2+CTC를 갖는 환자에게서 CTC상에서의 HER-2 농도에서의 변동을 나타내는 일련의 그래프이다. 기준선에서의 HER-2+CTC를 갖는 3 명의 유방암 환자의 치료 과정 중의 CTC 및 이의 질환이 추적중에 진행되었다. 기타의 표시는 도 17에 나타낸다. 패널 18B에 도시한 엑세메스탄을 매일 투여하였다. CTC의 일부는 치료 중에 HER-2를 발현시켰다. 환자 23 및 25의 치료 중에 CTC가 실질적으로 증가하였다.
도 19A∼도 19C는 안정한 질환을 갖는 환자에게서 CTC에 대한 HER-2 밀도의 변동을 나타내는 일련의 그래프이다. 기준선에서의 HER-2+CTC를 갖는 3 명의 유방암 환자의 치료 과정 중의 CTC 및 이의 질환이 추적중에 진행되었다. 기타의 표시는 도 17에 나타낸다. 아나스트로졸 (패널 19B)를 매일 투여하였다. 상단부 패널의 환자에게서의 CTC는 치료 중에 증가한 반면, 2 개의 하단부 패널의 환자에게서의 CTC는 감소되었다.
도 20은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 프로토콜의 개략도이다.
발명의 상세한 설명
바람직한 구체예에 의하면, 본 발명은 생물학적 샘플로부터 희귀 표적 생체 실체의 신속하고 효과적인 분리를 위한 조성물, 방법 및 키트를 제공하고자 한다. 기재된 방법은 비특이적으로 결합되거나 또는 포획된 세포의 선택을 최소화하는 동시에 혈액 샘플 중에 존재하는 종양 세포를 효과적으로 분리하고 특성화하는데 사용될 수 있다.
암 시기결정 시스템은 암이 해부학적으로 얼마나 멀리까지 퍼졌는가 그리고, 유사한 예측 및 치료를 갖는 환자를 동일한 시기결정 그룹에 포함시키는 시도를 기술한다. 시기라는 개념은 대부분의 형태의 백혈병을 제외하고 모든 암에 적용될 수 있다. 벽혈병은 모든 혈액과 관련되어 있기 때문에, 이들은 기타의 암과 같이 해부학적으로 국소화되지 않아서 시기 결정이라는 개념은 이러한 유형의 암에는 적용되지 않는다. 몇몇 형태의 백혈병은 질환이 얼마나 진행되었는가에 대한 각종의 방법을 반영하는 시기 결정 시스템을 갖는다. 대부분의 고형암의 경우 즉 포괄적 시기 그룹 및 TNM 시스템의 2 가지의 관련된 암 시기 결정 시스템이 있다.
포괄적 시기 그룹 (로마 숫자 시기 결정) 시스템에서, 케이스는 로마 숫자 I부터 IV로 표시한 4 개의 시기로 나누거나 또는 "재발"로서 분류한다. 일반적으로, 시기 I 또는 초기 시기의 암은 일반적으로 치유 가능한 작은 국소화된 암인 반면, 시기 IV는 일반적으로 수술 불가능하거나 전이성 암을 나타낸다. 시기 II 및 III의 암은 일반적으로 국소 진행되고 및/또는 국소 림프절의 병발을 갖는 것이다. 실제로, 이들 시기는 정확하게 정의되나, 이의 정의는 각 유형의 암에 대하여서는 상이하다. 또한, 해당 시기에 대한 예후는 암 그 자체의 유형에 따라 다르며, 그래서 시기 II의 비-소세포 폐암은 시기 II의 경부암과는 상이한 예후를 갖는 것을 인지하는 것이 중요하다.
전술한 바와 같이, 암은 원발 종양이 제거된 후 수개월 또는 수년후 복귀하는 것이 일반적인데, 왜냐하면 암 세포는 이미 파괴되어 원발 종양이 발견될 때까지 암 세포는 원위의 위치에 머무르고 있기 때문이며, 이 당시에는 검출되기에 충분히 큰 종양을 형성하지 않는다. 때때로, 초기 수술에서 원발 종양의 극히 일부가 남게 되어 차후에 커다란 종양으로 성장한다. 모든 가시적 종양이 제거된 후 재발한 암을 재발성 질환으로 지칭한다. 원발 종양 부위에서 재발하는 질환은 국소성 재발이며, 전이되어 재발하는 질환은 원위성 재발로 지칭한다. 원위성 재발은 일반적으로 시기 IV 질환과 통상적으로 유사하게 치료된다. (때때로 이들 용어를 번갈아 사용하기도 한다). 국소성 재발의 유의성은 암의 유형에 따라 원위성 재발과는크게 다를 수 있다.
고형 종양의 경우, 시기 I∼IV가 실제로 "TNM" 시스템으로 지칭되는 보다 상세한 시기 결정 시스템으로 정의된다. 이러한 시스템에서, TNM은 종양, 결절 및 전이를 나타낸다. 이들 각각을 전체 시기를 제시하기 위하여 별도로 분리하여 숫자로 분류하였다. 그래서, T1N1M0 암이라는 것은 환자가 T1 종양, N1 결절 병발 및 원위성 전이가 없는 경우를 말한다. 물론, T, N 및 M의 정의는 각각의 암에 대하여 특이적이기는 하나, 이의 의미를 가능한한 넓게 정의하는 것이 가능하다.
T: 종양 - 원발 종양의 정도를 분류하며, 통상적으로 T0∼T4로 나타낸다. T0이라는 것은 원위 조직을 침습조차 하지 않은 종양을 나타낸다. 이를 "정위치"로 지칭한다. 반대로, T4는 직접 확장에 의하여 기타의 장기를 침습하고, 통상적으로 수술이 불가능한 커다란 원발 종양을 나타낸다.
N: 림프절 - 국부의 림프절 병발의 양을 분류한다. 원발 종양의 부위를 배농시킨 림프절만이 이러한 분류로 간주되는 것으로 이해하는 것이 중요하다. 원위 림프절의 병발은 전이성 질환으로 간주한다. 림프절이 국부에 있는 것만의 정의는 암의 유형에 따라 다르다. N0은 림프절 병발이 없는 것을 지칭하며, N4는 광범위한 병발을 의미한다. 일반적으로 보다 광범위한 병발은 병발된 결절의 보다 큰 확대 그리고 보다 더 원위의 (그러나, 여전히 국부적인) 결절 병발을 의미한다.
M: 전이 - M은 전이가 없는 경우를 M0, 전이가 있는 경우를 M1으로 한다. 전체적인 시기 결정 시스템으로서, T 및 N의 정확한 정의는 각각의 상이한 유형의 암에 대하여 상이하다.
대부분의 종양학자들은 TNM 시스템이 보다 정확한 카테고리를 제공하기 때문에 I∼IV 시스템보다 더 정확한 것으로 간주한다. 그러나, 2 개의 시스템은 실제로 관련되어 있다. I∼IV 그룹은 실제로 TNM 시스템을 사용하여 정의된다. 예를 들면, 시기 II 비-소세포 폐암이란 T1 또는 T2 원발 종양, N1 림프절 병발 및 무 전이 (M0)를 의미한다.
많은 임상의들은 암이 초기 시기에서 장기에 국한된 질환인 것으로 판단하고 있다. 본 명세서에서 제시된 데이터를 기초로 하면, 이러한 개념이 옳지 않다는 것을 알 수 있다. 사실상, 데이타에 의하면, 암은 통상의 방법을 사용하여 처음 검출될 때까지는 전신성 질환이 된다. 그래서, 순환중인 종양 세포의 존재는 유방조영술 또는 PSA의 측정과 같은 기타의 테스트 대신에 또는 이와 함께 암을 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 표적 세포상에 또는 세포내에서 결합된 마커에 대하여 적절한 모노클론 항체를 사용함으로써, 또는 세포 단백질 발현에 대한 기타의 분석을 사용함으로써 또는 세포성 mRNA의 분석에 의하여 이러한 세포의 장기 기원을 예를 들면 유방, 전립선, 결장, 폐, 난소 또는 기타의 비-조혈 암을 용이하게 검출할 수 있다. 그래서, 종양의 임상적 징후가 실질적으로 없으면서 암 세포를 검출할 수 있는 경우, 기원의 장기 뿐 아니라 이들의 존재를 식별할 수가 있게 된다. 높은 정도의 감도 및 특이성으로 작용하는 본 명세서에 기재된 본 발명의 비교적 단순한 혈액 테스트를 사용하여 스크린을 수행할 수 있기 때문에, 테스트는 "전신 생검"의 개념이 될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 설명된 데이타를 토대로 하여 암은 잠재적으로 매우 해로운 전이성 세포의 존재를 특징으로 하는 혈액 매개 질환의 개념을갖게 되어 이에 따라 치료하게 된다. 예를 들면 수술후 순환중인 종양 세포의 검출 가능한 증거가 절대적으로 없는 경우, 방사선, 호르몬 치료 또는 화학 치료와 같은 추적 치료가 필요한지의 여부는 추가의 임상 실험으로부터 결정될 수 있다. 이러한 치료의 댓가를 고려해 보았을때 환자의 치료의 필요성 또는 이의 효능을 예측하는 것은 임상적 정보의 유의적이고도 이로운 사항이 된다.
또한, 순환중인 종양 세포의 수가 질환의 개시로부터 이의 최종 시기까지의 질환의 진행 시기와 관련되어 있다.
본 명세서에서 사용한 바와 같은 용어 "표적 생체실체"라는 것은 각종의 해당 생물학적 또는 의학적 소재를 의미하는 것이며, 이는 표본내에 존재하는 "비-표적" 물질과는 구별될 수 있다. 이의 예로는 호르몬, 단백질, 펩티드, 렉틴, 올리고뉴클레오티드, 약물, 화합물, 핵산 분자 (예, RNA 및/또는 DNA) 및 생물학적 기원의 입자상 분석물 등이 있으며, 상기 생물학적 기원의 입자상 분석물은 세포, 바이러스, 박테리아 등의 생체입자를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 희귀 세포, 예컨대 모체 순환 중인 태아 세포 또는 순환중인 암 세포는 본 발명의 조성물, 방법 및 키트를 사용하여 비-표적 세포 및/또는 기타의 생체실체로부터 효과적으로 분리될 수 있다.
용어 "생물학적 표본"라는 것은 말초 혈액, 조직 균등질, 유두 흡인물, 결장 세척물, 가래, 기관지 세척물 및 사람 검체로부터 얻을 수 있는 세포의 임의의 기타의 공급원을 비롯한 세포 함유 체액 등이 있으나, 이들에 제한되지 않는다. 조직 균등물의 예로는 유방암 환자에서의 전초림프절로부터 얻을 수 있다. 전술한 표적생체실체와 관련하여 사용시 용어 "결정인자"라는 것은 면역 반응을 종종 유발하는 거대분자 항원상에 존재하는 화학적 모자이크를 지칭하는 것이다. 또한, 결정인자는 "에피토프"와 번갈아서 사용할 수도 있다. 결정인자는 생체특이성 리간드 또는 생체특이성 시약에 의하여 특이적으로 결합될 수 있으며, 이는 특이성 결합 물질 (예, 리간드 또는 시약)로의 선택적 결합에 참여하고 그리고 이를 초래하며, 이에 선택적으로 결합되는 표적 생체실체의 일부분을 지칭하는 것이며, 이의 존재는 발생할 선택적 결합을 필요로 한다. 기본적인 용어로서, 결정인자는 특이적 결합쌍 반응에서 이에 대한 결합 친화력을 갖는 제제, 리간드 및/또는 시약에 의하여 인지되는 표적 생체실체상에서의 분자 접촉 부위가 된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "특이성 결합쌍"이라는 것은 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 핵산 (RNA 또는 DNA) 하이브리드화 서열, Fc 수용체 또는 마우스 IgG-단백질 A, 아비딘-비오틴, 스트렙타비딘-비오틴 및 바이러스-수용체 상호작용 등을 포함한다. "유전자 특이성 프로빙"이라는 것은 종양 소인 관련 분자에 상보성인 핵산 분자가 이러한 분자의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용되는 방법을 의미한다. 이러한 핵산은 검출 가능하게 표지될 수 있거나 또는 표지되지 않을 수도 있다. 기타의 다양한 결정 인자-특이성 결합 물질 조합은 본 발명의 방법을 수행하는데 사용하는 것으로 간주하며, 이는 당업자에게 자명할 것이다. 본 명세서에서 사용한 용어 "종양 소인"이라는 것은 악성 질환에 대한 소인상 감수성 또는 소인을 지칭하는 것이다. 악성 질환에 대한 소인 또는 감수성은 유전되거나 또는 조절곤란한 세포성 증식을 유도하는신체 세포 돌연변이로 인한 것일 수도 있다. 용어 "종양 소인 관련 분자"라는 것은 세포가 정상 표현형에서 악성 표현형으로 진행될수록 생화학적으로 변형되거나 또는 변종 발현되는 세포내 그리고 세포외 분자를 의미한다. 이러한 분자의 예로는 호르몬, 호르몬 조절된 단백질, 종양 유전자, 종양 억제제 단백질, 세포자멸사 관련 분자, 세포 주기 및 증식 관련 분자, 암과 관련된 탄수화물 분자, 세포골격잔 단백질 및, 세포-대-세포 접촉의 유지에 연관된 단백질 등이 있으나, 이에 제한된 것은 아니다. 단백질, 핵산 및 탄수화물을 비롯한 종양 소인 관련 분자의 분석 방법은 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, Inc. NY, NY (1999)]에서 알 수 있다. 종양 소인 관련된 분자의 변화된 발현 레벨 또는 변형된 분자 구조의 평가는 임상의에게 치료 설계를 돕기 위한 중요한 정보 및 모니터링 전략을 제공하게 된다.
용어 "악성 세포"라는 것은 세포성 증식 및/또는 국소화의 정상의 엄격 조절이 상실되도록 생화학적으로 및/또는 표현형적으로 변화된 세포를 지칭한다. 악성 세포는 순환중에는 정상적으로는 존재하지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "항체"의 예로는 면역글로불린, 모노클론 또는 폴리클론 항체, 면역반응성 면역글로불린 단편, 예컨대 F(ab) 및 단일쇄 항체 (sfV) 등이 있다. 또한, 본 발명에는 통상적으로 생성된 항체와 유사한 특이성을 갖는 결정인자를 특이적으로 인지하는 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 조합물 등을 사용하는 것을 간주할 수 있다. 전술한 바와 같이 상보성 핵산은 "특이성 결합쌍"의 의미에 포함되는 것으로 한다. 용어 "측정 가능하게 표지한다"라는것은 물리적 수단 또는 화학적 수단에 의한 직접 또는 간접적 검출 또는 측정이 테스트 샘플 중의 표적 생체실체의 존재를 나타내는 임의의 물질을 지칭하는 것이다. 검출 가능한 표지의 대표적인 예로는 흡광, 형광, 반사, 광산란, 인광 또는 발광성에 기초한 직접 또는 간접적으로 검출 가능한 분자 또는 이온; 이의 방사성 특성에 의하여 검출 가능한 분자 또는 이온; 핵자기 공명 또는 상자성 특성에 의하여 검출 가능한 분자 또는 이온 등이 있으나, 이에 제한된 것은 아니다. 예를 들면 흡광 또는 형광에 기초하여 간접적으로 검출 가능한 분자의 군에는 적절한 물질이 예를 들면 비흡광 분자에서 흡광 분자로 또는 비형광 분자에서 형광 분자로 전환을 야기하는 각종의 효소를 들 수 있다.
용어 "실질적으로 배제한다"라는 것은 생체특이성 리간드 또는 생체특이성 시약과 이의 해당 표적 결정인자간의 결합 반응의 특이성을 지칭하는 것이다. 생체특이성 리간드 및 시약은 이의 표적 결정인자에 대한 특이성 결합 활성을 지니나, 이는 또한 기타의 샘플 성분으로의 저 농도 비-특이성 결합을 나타낼 수도 있다.
용어 "초기 시기의 암"이라는 것은 "시기 I" 또는 "시기 II"의 암과 번갈아 사용할 수 있으며, 이는 장기 국한된 것으로 임상적으로 결정되는 암을 지칭한다. 또한, 암의 크기가 너무 작아서 유방암 환자의 경우 유방조영술, 또는 폐암 환자의 경우 X-선과 같은 통상의 방법에 의하여 검출되지 않는 암도 포함한다. 유방조영술이 약 2×108개의 세포를 갖는 종양을 검출할 수 있는 반면, 본 발명의 방법은 이정도의 크기 또는 이보다 더 작은 종양으로부터의 순환중인 암 세포를 검출할 수있어야만 한다.
본 명세서에서 사용한 바와 같은 용어 "농축"이라는 것은 초기의 생물학적 샘플 중의 비에 비하여 처리된 분석 샘플 중의 비-표적 물질에 대한 표적 생체실체 (예, 종양 세포)의 비율을 실질적으로 증가시키는 과정을 지칭하는 것이다. 말초 혈액을 출발 물질로 사용한 경우, 적혈구 세포는 농축 정도의 평가시 이에 포함시키지 않았다. 본 발명의 방법을 사용하면, 순환중인 상피 세포는 적어도 2,500 배, 더욱 바람직하게는 5,000배, 가장 바람직하게는 10,000배의 정도로 백혈구에 대하여 농축될 수 있다.
본 명세서에서 분리된 순환중인 종양 세포와 관련하여 사용된 용어 "클론 확대(expansion)"라는 것은 배양물 중의 분리된 세포를 조건하에 두어 세포를 증식시키는 것을 의미한다. 단일 세포를 배양하여 이들이 콜로니를 형성하고 그후 클론 증식하여 실질적으로 균질한 암 세포군을 생성할 수 있는 것이다. 이러한 세포 또는 세포 그 자체 부분을 사용하여 종양 백신을 생성할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "종양 백신"이라는 것은 면역 반응을 자극하는데 사용될 수 있는 종양 세포의 특이성 단백질을 포함하는 제제를 의미한다. 백신은 바이러스, 소단백질 또는 전세포를 포함할 수 있다. 아데노바이러스 관련 벡터로 감염된 종양 세포를 사용한 종양 백신을 생성하는 방법은 미국 특허 제6,171,597호에 개시되어 있다. 순환중인 종양 세포로부터 종양 백신을 생성하는 추가의 방법은 미국 특허 제5,993,829호에 개시되어 있다.
본 발명을 수행하는데 사용하기에 바람직한 자기 입자는 콜로이드의 양상을나타내는 입자이다. 이러한 입자는 일반적으로 약 200 ㎚ (0.20 미크론) 미만인 미크론 이하의 입도 및, 장시간 동안 용액으로부터의 비중 분리에 대한 안정성을 특징으로 한다. 기타의 다수의 잇점 이외에, 이러한 입도 범위는 세포 분석에 통상적으로 적용되는 분석 기법에 대하여서는 실질적으로 나타나지 않게 된다. 90∼150 ㎚ 및 70∼90%의 자기 중량을 갖는 입자는 본 발명에 사용하는 것으로 간주한다. 적절한 자기 입자는 자기 코어에 결합되는, 예를 들면 물리적 흡수 또는 공유 결합되며 안정화된 콜로이드성을 부여하게 되는 분자에 의하여 둘러싸이는 초상자성 물질의 결정질 코어로 이루어진다. 코팅 물질은 샘플 및 자기 코어에서 발견되는 생물학적 거대분자간의 비특이성 상호작용을 방지하기에 유효량으로 가하여야만 하는 것이 바람직하다. 이러한 생물학적 거대 분자의 예로는 탄수화물, 예컨대 비표적 세포, 렉틴, 당단백질 및 기타의 막 성분의 표면상에 시알산 잔기와 같은 탄수화물 등이 있다. 또한, 이러한 물질은 나노입자당 가능한한 많은 자기 중량을 함유하여야만 한다. 코어를 포함하는 자기 결정의 크기는 충분히 작아서 완전 자기 도메인을 포함하지 않는다. 나노입자의 크기는 충분히 작아서 브라운 에너지가 이의 자기 모멘트를 초과하게 된다. 그 결과, 북극, 남극 정렬 및, 차후의 이들 콜로이드성 자기 입자의 상호 인력/반발력은 이의 용액 안정도에 기여하게 되는 적절히 강한 자기장에서 조차도 발생하지 않는 것으로 나타났다. 마지막으로, 자기 입자는 고 자기 구배 외부장 분리기내에서 분리될 수 있어야만 한다. 이러한 특성은 샘플의 취급을 도우며, 강자성 비이드 또는 강모가 충전된 더욱 복잡한 내부 구배 클럼에 비하여 경제적 잇점을 제공한다. 전술한 특성을 갖는 자기 입자는 미국 특허제4,795,698호, 동제5,597,531호 및 동제5,698,271호에 기재된 베이스 물질의 변형에 의하여 생성될 수 있다. 이러한 베이스 물질로부터의 제조는 하기에 기재한다.
악성 종양은 이웃하는 조직을 침습하는 능력을 특징으로 한다. 일반적으로, 직경이 1 ㎜인 종양은 혈관을 생성하며, 동물 실험에 의하면 종양에 존재하는 세포의 4% 정도가 24 시간 동안 순환으로 탈락될 수 있는 것으로 나타났다. 문헌 [Butler, TP & Gullino PM, 1975 Cancer Research 35:512-516]. 종양의 탈락능은 대부분 종양의 공격성에 의존하는 것으로 보인다. 종양 세포가 연속적인 기준에서 순환으로 탈락되더라도, 소부분이 원위성 전이를 일으키지 않거나 또는 소량만이 이를 일으키는 것으로 밝혀졌다. 문헌 [Butler & Gullino, 상동]. 하기의 가정을 사용하여, 순환중인 종양 세포의 빈도를 하기와 같이 추정할 수 있다.
1. 직경이 1 ㎜인 종양은 107개의 세포를 포함하며, 4% 또는 4×105개의 세포는 24 시간 이내에 순환으로 탈락된다.
2. 종양 세포는 하나의 순환 사이클에서만 생존한다.
3. 혈액 부피는 약 5 ℓ이다.
4. 심박출량은 분당 5,000 ㎖이다.
이러한 경우, 직경이 1 ㎜인 종양을 가진 환자의 말초 혈액 중의 종양 세포의 빈도는 혈액 100 ㎖당 종양 세포 약 6개이다. 종양 중량의 증가는 순환중인 종양 세포의 빈도의 증가에 비례할 것으로 예상된다. 이러한 경우에 해당되는 것으로 발견되는 경우, 이러한 감도 레벨을 사용하여 얻을 수 있는 방법은 국소성 질환을가진 환자 뿐 아니라 원위 전이를 가진 환자에게서의 종양 부하의 평가를 돕게 된다. 국소성 질환을 가진 환자의 말초 혈액에서의 종양 세포의 검출은 초기 시기에서의 종양을 검출하는 가능성 뿐 아니라, 종양의 잠재적인 침습성과 관련한 징후를 제공하게 된다.
다수의 연구에 의하면, leukopheresis 생성물 중의 암종 세포의 존재는 자가 말초 혈액 줄기 세포 이식에 대한 유방 암종을 사용하여 환자로부터 수거한 것이 보고되어 있다. 문헌 [Brugger W., et al., (1994) Blood 83:636-640; Brockstein BE, et al., (1996), J. of Hematotherapy 5:617; Ross AA et al., (1993)Blood82:2605; Ross AA. (1998)J. of Hematotherapy, 7:9-18; Moss TJ, et al., (1994),J. Hematotherapy, 3:163-163]. 이러한 발견은 이식 산물 중의 종양 세포가 전이를 형성할 가능성을 갖고 있기 때문에 자가 이식에 대한 이러한 술식을 사용하는 것에 대한 비판이 일고 있다. 또한, leukopheresis 산물은 파종된 질환을 갖는 개개인으로부터 얻은 경우 종양 세포를 포함할 것으로 보이는 것으로 밝혀졌다. 문헌 [Brugger et al., 1994, 상동]. 그러나, 이러한 연구는 정량적인 데이타를 보고하지 않으며, 종양 세포가 국소성 질환을 갖는 환자의 말초 혈액중에서 발견될 수 있다고 보고되지도 않았다. 이러한 관찰에 의하면, 말초 혈액 중의 종양 세포의 수를 계수하는 매우 민감하고 정량적인 테스트를 사용하여 실제의 종양 부하를 결정할 수 있다는 가설을 세울 수 있다. 이러한 테스트의 가능성을 평가하기 위하여, 테스트하고자 하는 혈액 부피에 의하여서만 제한되는 순환중인 암종 세포의 정확한 계수가 가능한 민감한 세포성 분석을 개발하였다.
다수의 각종 세포 분석 플랫폼을 사용하여 농축된 샘풀중의 세포를 식별 및 계수할 수 있는 것으로 보고되었다. 이러한 분석적 플랫폼의 예로는 각각 미국 특허 제5,876,593호, 동제5,985,153호 및 동제6,136,182호에 개시되어 있는, 고급 자동 광학 주사 시스템인 셀트랙스 시스템 및, 실시예 II에 기재된 세포의 수동 관찰을 위한 현미경 검출을 사용하는 자기 세포 부동화 및 분석 시스템인 이뮤니콘의 CellSpotter (등록상표) 시스템 등이 있다. 전술한 미국 특허 출원 모두는 본 명세서에서 참고로 인용하며, 이들은 수동 또는 자동화된 정량적 및 정성적 세포 분석의 장치 및 방법을 개시하고 있다. 이러한 장치를 사용하게 되면 본 발명의 진단 및 모니터링 키트에서 잇점을 갖게 된다.
기타의 분석 플랫폼의 예로는 레이저 주사 세포측정 (Compucyte), 명시야 베이스 화상 분석 (Chromavision) 및 모세 부피측정 (Biometric Imaging) 등이 있다.
본 발명의 바람직한 구체예의 방법 및 조성물을 사용하여 혈중 순환중인 상피 세포의 계수는 혈액으로부터 상피 세포를 면역자기 선별 (농축)후, 다중변수 유세포분석에 의한 샘플의 분석에 의하여 달성한다. 면역자기 샘플 제조는 샘플 부피를 감소시키고, 표적 (상피) 세포의 104배의 농축을 얻는데 중요하다. 다중변수 유세포분석에 사용되는 시약은 상피 세포가 2 개의 광 산란기 및 3 개의 형광 변수의 리스트모드의 획득에 의하여 생성된 다중차원 공간내에서의 독특한 위치에 배치된다. 이는
1) 백혈구 (비종양성 세포)를 식별하기 위한 전-백혈구 항원인 CD45에 대한항체,
2) 잔여 적혈구 세포, 혈소판 및 기타의 비핵화 사건이 배제되도록 하는 세포 유형 특이성 또는 핵산 염료 및
3) 세포를 면역자기적으로 선택하는데 사용되는 것과는 상이한 EpCAM 에피토프에 대한 특이성을 갖는 항체 또는 시토케라틴에 대한 생체특이성 시약 또는 항체를 포함한다.
당업자라면, 농축된 종양 세포군의 분석 방법은 본 발명의 의도한 용도에 따라 달라진다는 것을 인지할 것이다. 예를 들면, 후술하는 바와 같이 암의 스크리닝 또는 질환의 재발에 대한 모니터링에서, 순환중인 상피 세포의 수는 매우 낮을 수 있다. 특정의 "정상" 레벨의 상피 세포가 존재하기 때문에 (정맥천자 중에 도입될 수도 있음), 정상 또는 종양 세포로서 상피 세포를 식별하는 분석 방법이 바람직하다. 이러한 경우, 현미경을 사용한 분석이 가장 정확한 것으로 입증되었다. 이러한 검사는 형태 검사, 기지의 종양 소인 관련 분자 (예, 종양 유전자)의 식별 등을 포함한다. 본 발명의 방법에 의하여 추가로 분석될 수 있는 적절한 종양 소인 관련 분자는 실시예 11에 제공되어 있다.
또는, 순환중인 상피 세포의 갯수가 정상의 모집단에서 관찰되는 것보다 초과하게 되는 질환 상태에서, 이러한 세포를 계수하는 분석 방법은 충분하여야만 한다. 본 명세서에서 기재된 방법에 의한 환자 상태의 결정은 정상의 모집단에 존재하는 순환중인 희귀 세포의 수의 통계적 평균치를 기준으로 하여 형성된다. 또한, 초기 시기의 암 환자에서 그리고 공격성 전이성 암을 갖는 환자에서의 순환중인 상피 세포의 레벨은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 통계적으로 측정될 수 있다.
하기의 실시예는 본 발명의 실시를 돕고자 제공한다. 이러한 실시예는 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 제한하여서는 아니된다.
실시예 1
전혈로부터 희귀 세포를 효과적으로 분리하기 위한 개선된 자기 나노입자의 배합
희귀 세포 (예, 상피 유래 종양을 갖는 환자에서의 종양 세포, 모체 혈액 중의 태아 세포 등)는 혈액 1 ㎖당 1 이하의 희귀 세포를 갖는 빈도로 제시될 수 있다. 이러한 희귀 세포를 검출하는데 필요한 혈액을 바른 표본의 갯수는 매우 크다. 백혈구 세포 5∼10×107개 중 종양 세포 10 개에 해당하는 혈액 10 ㎖ 중의 희귀 세포가 10 개라고 가정할 경우, 세포는 세포원심분리에 의하여 또는 침강에 의하여 현미경 슬라이드에 옮기고, 해당 희귀 세포에 대하여 특이성을 갖는 항체로 염색하고, 이를 수동으로 또는 자동으로 판독한다. 하나의 슬라이드에 옮겨질 수 있는 세포의 최대수는 약 500,000 개의 세포이며, 이는 혈액 10 ㎖를 처리하는데 100∼200 개의 슬라이드가 필요하다는 것을 의미한다. 이러한 접근법에 의한 분석에 소요되는 시간은 비실용적이 되며 경제적 실현 가능성도 없다. 결론적으로, 샘플 부피 감소 및, 밀도 구배 분리에 의한 적혈구 및 혈소판의 제거, 적혈구 용해 절차를 희귀 세포의 분리에 사용하여 분석하고자 하는 슬라이드의 갯수를 크게 감소시킨다. 전술한 바와 같이, 자기 농축은 세포 분리에 바람직한 방법으로서, 이상적으로는, 이러한 목적에 사용되는 나노입자는 분석전에 제거될 필요는 없다. 따라서, 나노입자는 분석 측정을 방해하지 않도록 충분히 작아야 하는데, 약 250 ㎚ 이하 정도이어야 한다. 나노입자는 필터를 살균시킬 수 있도록 220 ㎚ 이하인 것이 가장 바람직하다. 또한, 나노입자는 외부 구배 자기 분리기내의 단순 실험관, 예컨대 시험관, 원신분리관, 진공채혈관 등으로부터 세포 분리가 가능하도록 하기에 충분한 자기 반응성을 지니고, 그리고 충분히 커야만 한다. 또한, 전술한 바와 같이 내부 구배 장치는 번거로우며, 비용이 많이 들며, 희귀 세포의 회수에 비효율적이다. 또한, 나노입자 및 자기 장치는 낮은 비-특이성 결합으로 높은 재현성 회수를 산출하여야만 한다. 미국 특허 제5,597,531호에는 직접 코팅 (DC) 입자로 지칭되는 고 자기 입자의 합성이 기재되어 있는데, 이 입자는 많은 특징을 갖는다. 이들 나노 입자는 (코팅된 자기 입자계) 중합체 또는 단백질로 코팅된 결정질 자철광 또는 기타의 자기 산화물의 준구형 응집물로 이루어졌다. 이들의 구조로 인해서 (코어 직경은 코트의 두께보다 훨씬 큰 자기 코어 및 중합체 코트), 이들은 약 80∼85%의 자기 중량이 된다. 이들 나노입자의 비특이성 결합은 5∼8% 범위내이며, 그리하여 이들은 희귀 세포 분리에 그리 실용적이지는 않다. 그래서, 1 ㎖당 1 개의 세포로 존재하는 농축 세포인 경우, 포착 효율은 80%가 되며, 전혈 (백혈구 단독으로 간주함) 10 ㎖를 사용한 경우 예상되는 최상의 결과는 총 4 백만, 즉 16∼17 배의 농축물에서 8 개의 세포가 회수된다. 그러나, 미국 특허 5,597,531호에 기재된 자기 입자는 개방된 장 분리기를 사용하여 단순 시험관으로부터 분리를 수행하기 위하여 적절한 자기 성질을 갖는다. 또한, 이의 평균 크기는 상기에 제시된 한계치 이하가 되어이들은 각종의 분석 절차를 방해하지는 않는다. 이러한 물질을 사용한 광범위한 연구를 토대로 하여, 세포에 대한 비특이성 결합에 기여하는 주요 요인이 불완전 코팅으로 인한 나노입자상의 나결정질 철 산화물이 존재하는 것을 밝혀냈다. 이러한 불완전 코팅된 결정은 세포 표면상에서 음으로 하전된 시알산과 같은 생물학적 거대분자에 강하게 결합되는 생리학적 pH에서 충분히 높은 양의 하전을 갖는다. 입자를 제조하는 개선된 방법은 미국 특허 제5,698,271호에 기재되어 있다. 이들 물질은 코팅 레벨이 크기 증가된 고온 코팅 단계를 포함하는 상기 미국 특허 제5,579,531호에 기재된 것보다 개선되었다. 예를 들면 이러한 방법을 사용한 소 혈청 알부민 (BSA) 코팅으로 제조된 나노입자는 미국 특허 제5,597,531호의 DC-BSA 물질과 비교시 세포에 대한 비특이성 결합 특성을 3∼5 배 저하시킨다. 비특이성 결합에서의 감소는 직접적으로 BSA 코팅 물질의 증가된 레벨로 인한 것으로 밝혀졌다. 이러한 나노입자는 BSA 코팅을 제거하도록 처리하는 경우, 비특이성 결합은 높은 레벨로 되돌아간다. 그래서, 철 산화물 결정 표면상의 코팅된 BSA의 함량과 세포의 비특이성 결합간에는 직접적인 관계가 존재하는 것으로 결정되었다. 통상적으로, 전혈로부터의 세포를 이들 입자로 비특이성 결합시키는 것은 0.3%에 해당하는데, 이는 미국 특허 제5,579,531호에서 생성된 것보다 훨씬 우수한 것이다. 그래서, 전혈 10 ㎖로부터는 농축을 위하여 표적화된 세포를 사용하여 분리되는 비표적 세포가 약 200,000 개가 된다.
하기에서 추가로 논의할 비특이성 결합 문제점 이외에, 미국 특허 제5,579,531호 및 동제5,698,271호에 기재된 바와 같이 제조된 각종 로트의 자기입자는 희귀 세포 소모 또는 농축에 사용되며, 이의 회수는 일치하지 않는다. 종종 회수는 85∼95%가 되며, 다른 경우에는 동일한 모델 시스템을 사용하여 40∼50%가 될 수도 있다. 이러한 물질을 제조하는 방법이 상당한 범위의 크기 분산 (30 ㎚∼220 ㎚)을 산출하기 때문에, 크기 분포 및 특히 작은 나노입자의 존재는 표적 회수에 크게 영향을 미치는 것으로 추측 및 확인되었다. 작은 나노입자 (30∼70 ㎚)가 더 쉽게 분산되기 때문에, 이들은 커다란 대응부와 비교하여 세포를 선택적으로 표지시키게 된다. 내부 구배 컬럼에서와 같이 매우 높은 구배를 사용하는 경우, 이들 물질은 크기에도 불구하고 성능이 거의 차가 없게 된다. 반대로, 내부 구배를 사용하거나 또는 마이크로비이드 또는 강모 컬럼상에서 생성될 수 있는 것보다 낮은 크기의 구배를 사용하는 경우, 세포상의 작은 나노입자의 점유가 커다란 영향을 미치게 된다. 이는 DC 나노입자를 분별시키고, 회수에 대한 효과를 연구함으로써 해당 경우가 되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 연구 및 기타의 최적화 실험을 기초로 하여, 컬럼상에서 또는 나노입자를 자기 분별하기 위한 수단은 과도하게 작거나 또는 커다란 나노입자가 결여된 상태로 제조될 수 있다. 예를 들면, 평균 직경이 100 ㎚인 베이스 코팅된 입자는 80 ㎚ 이하 또는 130 ㎚ 보다 큰 물질의 미량을 포함하는 것이 생성될 수 있다. 유사하게 약 120 ㎚의 물질은 90∼95 ㎚보다 작거나 또는 160 ㎚보다 큰 상당량의 물질을 사용하지 않고도 생성될 수 있다. 이러한 물질은 회수와 관련하여 최적으로 수행되며, 이는 60∼70 ㎚의 나노 입자를 포함함으로써 최적 이하가 될 수 있다. 본 발명의 수행에 사용하기 위한 바람직한 입도 범위는 예를 들면 BSA-코팅된 자철광과 같은 베이스 코팅된 자기 입자의 경우90∼150 ㎚가 된다. 이와 같이 바람직한 범위내에 포함되는 입자는 문헌 [Liberti et al., In Fine Particles Science and Technology, 777-90, E. Pelizzetti (ed.) (1996)]에 기재된 절차를 사용하여 얻을 수 있다.
비특이성 결합의 문제점을 추가로 설명하기 위하여, 항체 공액 직접 나노입자를 생성하기 위한 다수의 경로가 시도되었다. 희귀 세포에 특이적인 모노클론 항체는 예를 들면 표준 헤테로생체작용성 화학 (이는 본 명세서에서 직접 커플링법으로 지칭함)에 의하여 DC 자기 입자상의 BSA 베이스 코팅에 직접 커플링될 수 있다. 이러한 목적에 사용된 헤테로생체작용성 링커의 예로는 설포숙신이미딜-4-[말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC) 등이 있다. 또다른 접근으로서, 비오티닐화 모노클론 항체는 베이스 코팅된 입자에 결합된 스트렙타비딘에 커플링될 수 있다. 이러한 공액 방법은 피기백 방법으로서 본 명세서에서 지칭된다. 이러한 방법에서, 스트렙타비딘은 직접 커플링 방법과 동일한 화학 작용에 의하여 베이스 코팅된 자기 입자에 커플링된다. 한 피기백 커플링 방법에서, 모노비오티닐화된 항체는 1 시간 동안 스트렙타비딘 자기 입자와 반응하도록 한 후, 잔류하는 스트렙타비딘 결합 부위를 유리 비오틴으로 종결시킨다. 희귀 세포 또는 세포 분석 단계의 분리 중에 자기 입자에 임의의 비오티닐화 항체를 결합시키는 것을 방지하기 위하여 항체 커플링후 잔류하는 스트렙타비딘 부위를 종결시키는 것이 중요하다. 또한, 이러한 스트렙타비딘 종결 수단은 비특이성 결합을 방해하기에 효과적인 것으로 나타났다. 이러한 물질을 각종의 조건하에서 비오티닐화된 형광 거대분자와 함께 배양하면 무결합 형광이 산출된다. 비교용으로, 항-EpCAM 항체 (미국 펜실베이니아주필라델피아에 소재하는 위스타 인스티튜트에서 입수한 GA73.3)를 두 방법 모두에 의하여 자기 입자에 커플링시킨다. 그후, 백혈구의 잔류물 또는 비특이성 결합 (NSB)에 대하여 뿐 아니라, 전혈로 스파이크 처리된 결장 종양 세포주 (Colo-205)로부터의 세포 선택에 대하여 자기 입자 모두를 비교하였다. 최종 샘플에 존재하는 백혈구는 자기 입자에 비특이적 결합한 백혈구와 세정 단계로부터의 세포의 잔류물의 조합이 된다. 자기 분리를 수행함으로써, 분리의 개시에서 시험관과 접촉하게 되거나 또는 분리 과정중에서 비자기적으로 수송되는 임의의 세포를 세정하는 것이 필요하다. 하기 표 I에는 2 종의 자기 입자의 비교를 나타낸다.
자기 입자 스파이크 처리된Colo-205 세포의 회수율(%) NSB 및 잔류백혈구(%)
자기 입자에 직접 결합된 EpCAM 항체(로트. #120325-1) 78-82 0.1-0.3
피기백 방법에 의하여 자기 입자에결합된 EpCAM 항체(로트. #120607-2) 67-78 0.05-0.1
BSA 베이스 입자에 항체 또는 스트렙타비딘을 단순히 커플링시키는 것은 비특이성 결합을 유의적으로 감소시킨다는 것이다 (데이타는 제시하지 않음). 이는 결합에 대하여 세포에 "나" 결정면의 접근 가능성을 감소시키기 때문인 것으로 밝혀졌다. 상기의 표는 스파이크 처리된 세포의 회수가 자기 입자의 두 유형에 대하여 필적하다는 것을 예시한다. 그러나, 백혈구의 비특이성 결합은 직접 항체 커플링된 자기 입자를 사용시 3 배 이상 높다. 이러한 차이는 비교적 작기는 하나 다량의 혈액을 처리하고 분석할 경우에는 유의적이게 된다. 2 가지 유형의 자기 입자간의 차이에 대한 다수의 지지되는 관찰을 기준으로 한 타당한 설명은 피기백 커플링법을 사용하여 합성한 자기 입자상에 단백질이 다수층 존재한다는 점이다. 그리하여 자기 결정의 표면은 단백질의 다수의 층으로 광범위하게 코팅되어 입체적으로 "보호될" 것이다. 이는 자기 입자에 비표적 세포가 결합되는 것을 방지한다.
피기백 커플링 방법에서, 자기 입자상에서의 제한된 수의 스트렙타비딘 결합 부위는 비오틴-항체로 점유되며, 나머지는 전술한 종결 과정에 의하여 유리 비오틴으로 포화된다. 또다른 커플링 방법에서, 과량의 스트렙타비딘 결합 부위는 종결되며, 유리 비오틴 대신에 모노비오틴-BSA로 포화된다. 이러한 접근법에 대한 근거는 모노비오틴 BSA를 사용한 종결은 세포가 나노입자의 미코팅된 부위와 접촉하는 것을 입체적으로 추가로 억제하여야만 하며, 즉 나노입자의 더 우수한 적용율을 제공하여야만 한다. 이러한 탄소 분석에 의하면, 이러한 방법이 입자에 커플링된 단백질의 양을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 2 가지의 자기 입자 제제는 백혈구의 비특이적 결합에 대하여 그리고 전혈로부터의 스파이크 처리된 Colo 205의 회수를 분석하는 실험에서 비교된다. 결과를 하기 표 II에 나타낸다.
자기 입자 Colo 205 세포회수율(%) NSB 및 잔류백혈구(%)
유리 비오틴을 사용하여 과도한스트렙타비딘을 종결시킨 EpCAM항체 커플링된 자기 입자 B(로트 #131022-1) 93 0.08
87 0.1
85 0.1
비오틴-BSA를 사용하여 과도한스트렙타비딘을 종결시킨 EpCAM항체 커플링된 자기 입자 B(로트 #131022-2) 87 0.01
83 0.03
85 0.02
모노비오틴-BSA는 생성된 생산물의 30∼40%가 결합된 비오틴을 포함하지 않도록 BSA에 제한된 함량의 비오틴을 공액화시킴으로써 제조될 수 있다.
요컨대, 균질한 크기 분포 및 비오틴-BSA 종결된 스트렙타비딘 결합 부위를 갖는 자기 입자는 본 발명의 분석 방법에서 매우 잘 수행되었다. 스파이크 처리된 상피 종양 세포의 우수한 회수 및 비특이성 결합에서의 크기 감소 정도는 비오틴 차단된 나노입자를 사용한 경우에 비하여 이러한 입자를 사용하여 얻었다. 그래서, 이들 물질 및 결과는 추가로 최적화될 수 있는 매우 유용한 생성물을 정의하게 된다. 개선된 자성 유체 생성물은 가능한한 자기를 띠게 되며, 이는 혈액 포함 세포 (아마도 비다공성 단층으로 코팅됨)에서의 임의의 물질과 자기 코어의 가능한 모든 상호작용을 배제시키도록 코팅되며, 이의 크기 범위 및 분포가 잘 정의된다. 바람직한 경우에서, 생물학적 물질과 상호작용하지 않는 코트 물질을 사용한다. 이러한 상호작용을 피할 수 없는 경우, 이들을 차단하는 수단이 필요하다. 물질이 가능한한 자성을 띠는 경우, 미국 특허 제5,579,531호 및 동제5,698,271호에 기재된 바와 같이 생성된 물질은 바람직한 출발 물질이 된다. 이들은 베이스 코팅 물질의 완전 단층이 아니라 외관상의 커다란 자기 코어로 이루어지기 때문에 바람직하다. BSA로 코팅된 100 ㎚ 나노입자의 경우, 코어는 자철광과 같은 90 ㎚의 적절한 자기 산화물이 된다. 이러한 나노입자는 코어 및 코트 물질의 상대적인 크기로 인하여 가능한한 뚜렷하게 자성을 띤다. 이는 코팅의 기능이, 나노입자가 서로 부적절하게 상호작용하지 못하도록 하고자 하는 것임을 감안할 때, 거시적 응집을 야기하게 되는 것이 명백하다. 또한, 코팅은 콜로이드 양상을 유지하도록 용매 분자와의 충분한 상호 작용을 촉진하고, 코팅을 위한 간편한 화학적 수단을 제공한다. 또한, 미국 특허 제5,579,531호 및 동제5,698,271호의 나노입자는 단층내의 "구멍"이 입체적으로 그리고 물리적으로 다수의 방법으로 충전될 수 있는 충분한 단층 코팅을 갖기 때문에 출발 물질로서 바람직하다. 임의의 기타의 시스템에서의 혈액 성분을 갖는 코어 물질 또는 임의의 기타의 비특이성 효과의 상호작용을 방해하도록, 임의의 코팅은 자기 코어의 유효 완전 도포를 촉진하는 것이 명백하다. 나노입자 중량에 대한 자기 중량의 비율을 최대로 하기 위하여, 나노입자에 더 적은 중량의 코팅이 첨가될수록 더 우수해진다.
실시예 2
순환중인 종양 세포의 식별을 위한 반자동화 샘플 제조 및 분석
상피 유래 종양 세포의 존재에 대하여 혈액 7.5 ㎖를 처리하고 분석하는 반자동 시스템을 개발하였다. 상피 세포 기원의 세포를 면역자기 표지하고, 혈액으로부터 분리하였다. 자기 포획된 세포를 차동 형광 표지하고, 이를 분석 챔버에 넣었다. 4색 형광 화상을 사용하여 상피 세포 기원의 순환중인 종양 세포 (CTC), 조혈 세포 및 부스러기를 분화시켰다. 내부 대조예를 계수하고 크기 및 면역표현형을 기준으로 하여 종양 세포로서 잠재적으로 분류되는 모든 물질을 식별하기 위하여 포획된 화상에 대하여 알고리즘을 적용하였다. 각각의 물체의 썸네일 화상을 사용자가 종양 세포의 존재를 검출할 수 있도록 하는 사용자 인터페이스에 제시하였다. 정상의 수혈자의 혈액의 처리시, 내부 대조예는 시스템과 오퍼레이터간의 결과가 일치하며 재현가능하다는 것을 나타낸다. CTC는 전이성 유방암을 가진 환자의 혈액 샘플에서 검출되지만, 기타의 질환은 이러한 시스템을 사용하여 분석될 수 있다.
전술한 바와 같이, 종양 세포는 극히 낮은 빈도 (1 ㎖ 당 <10 세포)로 암종 환자의 혈액중에 존재할 수 있다. CTC의 존재를 검출하는데 관련된 힘든 매뉴얼 샘플 제조 및 복합한 분석 방법은 오류의 결과를 산출한다. 매우 복잡한 실험 절차의 경우, 오류 결과의 근원적인 이유는 계통적인 및/또는 무작위의 예비분석 오류, 즉 분석 방법 그 자체에서라기 보다는 샘플 제조 또는 예비 처리 단계중에 발생하는 오류의 축적의 결과로 추적될 수 있다. 예비분석 오류는 오퍼레이터간의 무작위 또는 계통적인 편차 뿐 아니라, 기법에 민감한 공정 단계로 인한 편차로서 나타날 수 있다. 그래서, 일정하지 않게 수행되는 경우 희귀 세포 분석에서의 매뉴얼 샘플 제조는 매우 높은 가변성 및 신뢰성이 없는 분석 결과를 산출할 수 있다. 그래서, 이러한 예비분석 단계를 자동화하는 것은 가변성을 최소로 하게 되며, 그리하여 더욱더 일치하는 분석 결과를 제공하게 된다. 생성된 샘플을 분석하는데 자주 사용되는분석 방법은 유세포분석 또는 현미경법이 있다. 유세포분석은 민감하며 재현가능한 반면, 연구자는 면역표현형으로 식별된 희귀 사건이 실제로 종양 세포와 일치하는 형태학적 특성을 나타낸다는 것을 확인할 수가 없을 것이다. 현미경법은 악성을 결정하는데 있어서 신뢰성을 주기는 하나, 이는 상당한 가변적 세포 손실이 샘플의 처리와 관련되어 있는 단점을 갖게 된다. 이에, 본 발명자는 반자동 4색 형광 현미경 시스템에서의 CTC의 효과적인 수집 및 분석을 가능케 하는 신규한 세포 제시 장치 및 방법을 도입하게 되었다.
하기의 물질 및 방법을 제공하여 실시예 2의 수행을 돕게 된다.
절차중의 여러 단계에 사용되는 System Buffer (미국 펜실베이니아주 헌팅던 밸리에 소재하는 이뮤니콘 코포레이션)를 사용하여 초회항원 자극 처리하였다. 이 완충액은 세포 및 시스템 성분에 시약의 비특이적 결합을 감소시키기 위하여 인산염 완충 염수, EDTA 및 단백질로 구성된다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 상피 세포 유착 분자(EpCAM)에 대하여 특이성을 갖는 모노클론 항체 (mabs)에 자기 나노입자를 결합시킨다. EpCAM 항원은 조혈 기원의 세포가 아니라 상피 기원의 세포상에서 발현된다. 문헌 [Momburg et al.,Cancer Research(1987) 47:2883-2891; Gaffey et al.,Am. J. Surg. Path.(1992) 16:593-599; Herlyn et al.,J. Immun. Meth.(1984) 73:157-167; De Leij et al.,Int. J. Cancer Suppl.(1994) 8:60-63]. 항-EpCAM 항체 이외에, CTC상에서 다수의 자기 나노입자를 가교시켜 세포의 자기 부하 및 포획 효율을 증가시킴으로써 조절된 응집을 가능케 하는 시약인 CA-EpCAM를 형성하기 위하여 자기 나노입자에 데스티오비오틴을 결합시킨다. 문헌[Liberti et al., (2001),Journal of Magnetism and Magnetic Materials225:301-307]. 각종 EpCAM 항원 밀도를 갖는 세포의 자기 포획 효율의 차를 최소로 하는, 응집물을 형성하기 위하여 CA-EpCAM의 첨가 이전에 표본에 AB 완충액 중의 스트렙타비딘 (스트렙타비딘이 첨가된 시스템 완충액)을 첨가한다. 핵산 특이성 염료 DAPI (4,6-디아미디노-2-페닐인돌) 이외에, 피코에리트린에 공액된 항-시토케라틴 (CK-PE) 및, 알로피코시아닌에 공액된 항-CD45 (CD45-APC)로 자기 포획된 세포를 형광 표지시킨다. 항-시토케라틴은 상피 기원의 세포중에 존재하는 케라틴 4, 6, 8, 10, 13 및 18을 인지한다. 세포 (이뮤니펌)의 세포질막을 투과시키는 세제를 포함하는 완충 매질에 mabs를 첨가한다. Cellfix (미국 펜실베이니아주 헌팅던 밸리에 소재하는 이뮤니콘 코포레이션)중의 최종 재현탁 완충액은 비오틴 및 세포 안정화제를 포함하는 인산염 완충 염수이다. 스트렙타비딘에 대한 높은 친화력에 의하여 비오틴은 스트렙타비딘으로부터 데스티오비오틴을 대체하는 작용을 하며, 그리하여 분석의 초기 시기에서 형성된 응집물 중의 스트렙타비딘과 자성 유체 입자상의 데스티오비오틴간의 제어된 가교결합을 역전시키게 된다.
이러한 절차의 정확성을 모니터하기 위하여, 기지의 수의 내부 대조 세포를 처리 전에 혈액에 첨가하였다. 내부 대조 세포는 미국 특허 출원 제09/801,471호의 청구 대상이며, 이 문헌은 본 명세서에서 참고로 인용하였다. 이러한 대조 세포는 암 종양 세포주로부터 성공적으로 유도될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바에 의하면, 유방암 세포주 SKBR-3로부터의 세포를 안정화시키고, 형광 막 염료 DiOC16 (몰레큘라 프로브에서 입수)을 사용하여 독특하게 표지시켜 내인성 종양 세포로부터의분화가 가능케 하였다. 약 1,000 개의 대조 세포를 각각의 표본으로 스파이크 처리하였다. 대조 세포는 EpCAM을 발현시키고, 종양 세포를 동시에 사용하여 포획시켰다. 또한, 대조 세포는 세포내 시토케라틴을 발현시키며, CK-PE를 사용한 염색은 이러한 시약의 품질을 입증한다. 첨가된 대조 세포의 회수율은 계통적인 오류만을 검출할 수 있는 외부 대조예와 달리, 각 표본에 대한 시스템 성능 및 총 시약의 표시제가 될 수 있다.
샘플 제조 시스템
이 시스템에는 원형 강철 요크로 둘러싼 17 ㎜ 직경의 공동을 갖는 4극자 구조내에 배치된 4 개의 직사각형 희토류 자석 세트로 각각 구성된 2 개의 자기 분리체를 장착하였다. 이러한 시스템에서, 각각의 분리체는 15 ㎖의 원추형 시험관을 지지할 수 있다. 또다른 시스템 배치에서, 여러가지의 시험관을 여러가지의 분리기와 함께 사용할 수 있다. 각 분석기에 이웃하게 배치되는 것은 최종 샘플을 옮긴 분석 챔버 [CellSpotter (등록상표) 챔버]를 지지하는 자석 요크이다. 이 챔버 어셈블리를 시스템으로부터 꺼내어 현미경 재물대에 배치한다. 시험관 수송은 각종의 처리 위치에서 시험관을 배치하기 위한 회전 턴테이블과 함께 자기 분리기에 그리고 자기 분리기로부터 시험관을 올리고 내리기 위한 2 개의 이동 가능한 시험관 아암으로 이루어져 있다. 또한, 흡기 및 이동 프로브의 내부 및 외부 세정을 가능케 하는 턴테이블에 프로브 워쉬볼을 장착하였다. 유체 전달 이동 및 프로브 세정을 위하여 5 ㎖ 주사기가 달린 Cavro XE1000 디지탈 주사기 펌프를 사용하였다. 폐기물의 흡기를 위하여 PharMed 튜브가 달린 Cavro SP Smart Peristaltic 펌프를 사용하였다. 대조용 유체 경로에는 2 개의 핀치 밸브 및 1 개의 3방향 밸브 (Bio-Chem)를 사용하였다. 13 AWG Inconel 튜브 (비자기성)로 제조된 별도의 흡기 및 이동 프로브는 15 ㎖의 원추형 시험관 및 챔버로의 유체 접근을 위하여 사용하였다. 정확하게 제어되는 혈장 흡기가 가능케 되는 충전된 적혈구층의 높이를 측정하는데 through-beam 광전기 센서 (옴므론)를 사용하였다. 모션 조절, 공정 조절 및 오퍼레이터 인터페이스 명령을 수행하기 위하여 8 비트 마이크로콘트롤러 구동 펌웨어를 사용하여 시스템을 제어하였다. 프로토콜 그 자체 (배양 시간, 유체 처리 단계 등)는 별도의 메모리칩에 암호화시켰다. 오퍼레이터 인터페이스는 4-바이-4 키 키패드, 2 행, 20 문자의 LCD 디스플레이 및 가청 알람으로 구성된다.
CellSpotter (등록상표) 챔버
상부면 평면 조망 면적 29.7×2.7 ㎜, 폭 4 ㎜ (약 320 ㎕ 부피)의 성형 챔버를 사용하여 생성된 샘플을 수집하였다. 챔버의 포트는 챔버의 충전이 재현반복 가능하게 그리고 효과적으로 수행될 수 있도록 설계된 플러그로 밀봉시켜 챔버의 조망 부위에 샘플의 99%를 배치하였다. 특수 검정 챔버의 중앙에 등록 마크가 있는 특수 검정 챔버를 사용하여 조명원 및 현미경 재물대의 초기 위치로부터의 챔버 중심 오프셋을 검정하도록 하였다.
CellSpotter (등록상표) 시스템
CellSpotter (등록상표) 시스템은 RS-232를 경유한 PC에 의하여 제어되는 Ludl MAC2002를 사용하여 제어하는 필터 큐브 변경자 제어, 고해상도 X, Y, Z 재물대 및 10 배율 대물 렌즈(WD 4 ㎜, NA 0.45)가 장착된 Nikon E-400 현미경을 사용하였다. 4 개의 큐브 각각에서 여기, 다이크로익 및 방출 필터는 DAPI 365 ㎚/400 ㎚/400 ㎚, DiOC16 480 ㎚/495 ㎚/510 ㎚, PE 546 ㎚/560 ㎚/580 ㎚ 및 APC 620 ㎚/660 ㎚/700 ㎚이다. 화상은 내셔날 인스트루먼츠 PCI-1424 디지탈 프레임 포착기에 연결된 Hamamatsu 12 비트, 1280×1024 픽셀 디지탈 카메라를 사용하여 얻었다. LabVIEW (등록상표) 및 IMAQ Vision Toolkit (등록상표)를 사용하여 데이타 수집 소프트웨어를 개발하였다. 데이타 분석 및 프리젠테이션 프로그램은 HTML 인터페이스를 통한 IBM의 DB-2 데이타베이스를 사용하여 기록하였다.
반자동화 샘플 제조 시스템
분석용 샘플의 제조에 관련된 단계는 도 1에 도시하였다. 15 ㎖의 원추형 시험관에 7.5 ㎖의 혈액, 6 ㎖의 시스템 완충액 및 100 ㎕ (약 1000)의 대조 세포를 넣고, 이를 혼합하였다. 샘플을 800 g에서 10 분간 원심분리하고, 이를 시스템에 넣었다. 시스템을 시험관내의 충전된 적혈구 세포의 상부에 배치하고, 프로브를 시험관에 넣어 담황갈색의 코트층을 건드리지 않고 혈장을 흡인시켰다. 시험관을 시스템으로부터 꺼내고, 6 ㎖의 AB 완충액 및 100 ㎕의 CA-EpCAM 자성 유체를 첨가하고, 이를 혼합하였다. 시험관을 시스템에 넣고, 샘플 시험관을 삽입한 후, 시스템 제어하에서 자성 분리기로부터 빼내어 분리 및 제거 시간동안 정확한 대조예를 제공하였다. 자기장내에서 자성 유체를 혈액 샘플을 통하여 측부로 이동시켜 시험관의 벽면으로 자기 표지된 CTC 및 결합된 자성 유체를 이동시킬 뿐 아니라, 잠재적 표적 세포의 표지된 효율을 증가시켰다. 20 분간 배양 및 분리후, 프로브를 시험관에 서서히 내리고, 흡인시킨 후, 혈액 셈플을 폐기하도록 버렸다. 시험관을 분리기로부터 기계적으로 이동시키고, 3 ㎖의 시스템 완충액을 시험관에 첨가하였다. 시험관을 혼합하여 수집된 세포 및 자성 유체를 재현탁시켰다. 시스템은 시험관을 자석으로 내리고, 10 분후 미수집된 물질을 흡인시켰다. 시험관을 시스템에 의하여 자석으로부터 이동시키고, 200 ㎕의 Immunoperm 및 60 ㎕의 염색 시약을 첨가하고 혼합하였다. 15 분간의 배양후, 과잉의 염색 시약을 흡인시키고, 시스템에 의하여 버리고, 시험관을 자석으로부터 이동시켰다. 250 ㎕의 Cellfix를 첨가하고 나서 10 분 경과후, 시스템은 샘플을 챔버로 전달하였다. 챔버의 부피는 약 320 ㎕이고, 시스템은 헹굼액으로서 100 ㎕의 시스템 완충액을 사용하여 시험관내의 잔류 세포를 챔버로 전달하였다. 챔버를 약간 넘치게 채워 플러그 시일로 뚜껑을 덮는 동안 공기가 포집되지 않도록 하였다. 프로브가 샘플에 닿는 각 단계후, 프로브를 시스템으로 깨끗하게 세정하여 임의의 세포 또는 시약 잔류물을 제거하였다.
CellSpotter (등록상표) 분석 챔버
도 2A에는 2 개의 자석 사이에 챔버를 지지하는 자석 요크 어셈블리 및 분석 챔버를 도시한다. 2 개의 각도 형성 자석에 대한 챔버의 최적의 위치 및 자석의 최적의 각도를 측정하기 위하여, 챔버내의 자기 표지된 세포의 이동을 모의시험하기 위하여 컴퓨터 프로그램을 기록하였다. 대물 렌즈를 챔버의 상부면으로 자석 표지된 세포 모두를 이동시키도록 하며, 이때 자석의 양극은 움직이지 않도록 한다. 또한, 챔버면에서 자석면까지의 거리는 현미경 대물 렌즈를 통한 조망이 가능케 하기에 충분히 짧아야만 한다. 도 2B는 모의실험을 도시한 것으로서, 챔버는 자석의 N극과 S극의 사이에서 윤곽으로 나타내었으며, 쇄선은 자기 표지된 세포의 궤적을나타낸다. 도 2C는 챔버내의 궤적의 확대도를 도시한다. 자기 나노입자로 표지된 모든 세포는 챔버내에서 수직 이동한다. 도 2D는 세포와 나노입자가 챔버에 도입되는 실험으로부터의 CellSpotter (등록상표) 챔버의 상면도이다. 챔버의 면에서 균일하게 분포된 수평선은 자석 장 라인을 따라 정렬된 자기 마노입자를 나타낸다.
데이타 수집
챔버의 면적은 80.2 ㎟이고, 이는 DAPI, DiOC16, CK-PE 및 CD45-APC로 염색된 어떠한 물체에 대하여서도 완전 주사되어야 한다. 대물 렌즈와 디지탈 카메라의 조합에 의하여 0.45 (0.67×0.67) ㎛2의 픽셀 크기 및 858×686 ㎛의 화상 크기를 산출한다. 완전 챔버면을 커버하기 위하여 CellSpotter (등록상표) 시스템은 챔버당 560 개의 화상 및 140 프레임을 산출하는 4 개의 필터 각각에 대하여 35 개의 화상의 4 개의 줄을 수집하였다. 샘플 테스트가 개시되면 CellSpotter (등록상표) 수집 프로그램은, 화상을 수집하고자 하는 부위, 수집한 화상의 갯수, 각 화상의 위치 및 각각의 위치에서 사용되는 현미경의 촛점을 자동적으로 결정하게 된다. 화상 수집 영역은 챔버의 에지가 화상에서 가시적이어야 하는 5 개의 위치로 X 및 Y 재물대를 이동시켜 결정한다. 소프트웨어는 에지 위치를 결정하며, 라인이 발견되는 화상 디스플레이상에서 라인을 그리며, 선택된 에지 위치를 승인 또는 무시할 수 있는 권한을 오퍼레이터에게 부여한다. 재물대의 X축에 대한 챔버의 각도 오프셋을 결정하기 위하여 챔버의 긴 에지중 하나에 2 회의 측정을 실시한다. 모든 화상은 전체 화상 부위에 걸쳐서 집속되어야만 한다. 현미경의 촛점 깊이는 10 ㎛이다. 챔버면이 10 ㎛ 이내에 대하여 평면이면 현미경 재물대, 자석 요크 및 챔버내의 기계적 허용치는 Z축에서의 각도 비틀림을 야기할 수도 있다. 시간 제약으로 인하여, 소프트웨어가 샘플 챔버상의 140 개의 화상 위치 각각에서 촛점을 반복적으로 찾는 것은 실행 가능하지 않다. 알고리즘을 개발하여 세포의 핵산 염색에 의하여 방출되는 광을 사용하여 챔버상에서의 5 개의 위치에서 촛점을 반복적으로 측정하였다. 그후, 소프트웨어는 2차 다항식 대입을 얻기 위하여 실험 집속 데이타를 대입하였으며, 이를 사용하여 샘플 챔버상의 매 화상 위치에서 집속 또는 Z-조절을 결정하였다. 이러한 반복적인 집속 절차는 사용자의 형태 형성이 가능한 크기 범위내의 세포상에서만 집속 알고리즘을 수행하기 위하여 독특한 특징을 가지며, 샘플에서의 비세포성 물체를 무시한다. 적절한 입자가 발견되지 않는 경우, 시스템은 샘플내의 교호 촛점으로 이동하게 된다. 샘플로부터의 모든 화상은 특이성 샘플 구별에 대하여 독특한 디렉토리로 로긴하게 된다.
데이타 분석
도 3A∼도 3D는 유방암 환자로부터의 혈액 샘플 7.5 ㎖를 처리한 후 얻은 140 프레임중 하나의 DAPI (패널 3A), DiOC16 (패널 3B), CK-PE (패널 3C) 및 CD45-APC (패널 3D)의 화상을 도시한다. DAPI 화상에서는 다수의 세포핵이 관찰되었다. 7 개의 핵 주위에 직사각형 박스를 그렸다. 해당 DiOC16 화상에서는 동일한 7 개의 직사각형 박스가 있다. 이들 박스 중 5개에서, 둥근 형광 물질은 샘플 처리 이전에 혈액에 첨가한 대조 세포에 대하여 통상적인 것으로 나타났다. 또한, 대조 세포는 CK-PE 화상에서 나타난 동일한 5 개의 박스에서 세포의 명 염색에 의하여예시되는 바와 같이 CK-PE에 대하여 밝게 염색된다. DiOC16 (대조) 화상에서 염색되지 않은 7 개의 박스 중 2 개는 CK-PE 화상에서 염색되었다. 이들 박스 중 1 개는 2 개의 핵을 나타내며, 2 개의 세포에 해당하는 CK-PE 명 염색을 나타낸다. CD45-APC 화상은 박스내에서 염색이 없는 것으로 나타났는데, 이는 박스가 상피 세포 기원의 2 개의 세포를 포함하는 것을 확인한다. 또다른 박스는 상피 세포로서 이러한 사건을 배제시킨 CK-PE 담 염색 및 CD45-APC 명 염색을 나타낸다. 알고리즘은 DAPI, DiOC16 및 CK-PE를 염색시키는 위치에 대하여 조사하도록 샘플로부터 얻은 화상 모두에 적용한다. 염색 부위가 대조 세포 (DiOC16+, CK-, PE+)와 일치하는 경우, 소프트웨어는 대조 세포에 이러한 위치 (박스)를 할당하게 된다. 데이터 분석 소프트 웨어는 샘플내에서 발견되는 대조 세포 수를 표로 만들었다. 염색 부위가 잠재적 종양 세포 (DAPI+, DiOC16-, CK-PE+)와 일치할 경우, 소프트웨어는 데이터베이스에 이들 부위의 위치를 저장하게 된다. 소프트웨어는 줄에서의 각각의 변수에 대하여 박스 각각의 썸네일을 디스플레이한다. 이러한 썸네일의 좌측에서 우측까지는 핵 (DAPI), 세포질 시토케라틴 (CK-PE), 대조 세포 (DiOC16) 및 표면 CD45 (CD45-APC) 염색을 나타낸다. 좌측에 도시한 복합 화상은 핵 (DAPI) 및 세포질 (CK-PE) 염색의 가짜 컬러 오버레이를 나타낸다. 복합 화상 및 CD-APC 박스 이외의 체크 박스는 사용자로 하여금 줄에 나타난 화상이 종양 세포와 일치하거나 또는 백혈구 마커 CD45를 갖는 염색과 일치한다는 것을 확인하게 된다. 소프트웨어는 각 샘플에 대한 체크 박스를 표로 나타내었으며, 이의 정보는 데이터베이스에 저장한다. 유방암 환자의 샘플로부터의 CTC와 일치하는 염색 특징을 나타내는 6 개의염색 부위의 썸네일을 도 4에 도시하였다. 6 개의 염색 부위 중 3 개의 화상은 밝은 핵, 세포질 시토케라틴 염색이 존재하고, DiOC16과 CD45 염색이 존재하지 않는다는 것을 가시화한 CTC의 특징을 명백하게 나타낸다. 종양 세포의 외형에서의 차는 줄 201에서의 세포가 비교적 작고, 3 개의 종양 세포의 클러스터는 줄 202에 존재하며, 하나의 매우 큰 세포는 줄 204에 존재하는 것으로 나타났다. 줄 203에서, 대조 세포는 박스의 상부에 나타낸다. 이 부위는 대조 세포 아래의 CK-PE 양성 사건으로 인한 것으로 나타났다. 그러나, 도시된 핵은 백혈구에 속하는 것으로서, CK-PE 염색과 일치하지는 않는다. 줄 205는 4 개의 필터 모두에서 그리고 줄 206에서 양성으로 염색된 부스러기를 나타내며, CK-PE 양성 사건은 DAPI 염색과 일치하지 않는다.
시스템 성능
매뉴얼 대 시스템 샘플 제조를 비교하기 위하여, 혈액 부분표본 7.5 ㎖를 대조 세포로 스파이크 처리하고, 이를 두 방법으로 처리하였다. 6 가지의 실험에서 평균 종양 세포 회수율은 매뉴얼의 경우에는 68%이고, 시스템 샘플 제조의 경우에는 94%이고, 각각의 변이 계수는 10% 및 7%이었다. 시스템의 선형도는 5 명의 정상의 혈액 수혈자로부터 얻은 혈액 부분표본 7.5 ㎖ 중의 종양 세포주 SKBR-3의 0, 50, 100, 150 및 200 개의 세포 및 대조 세포 (n=1000)를 스파이크 처리하여 테스트하였다. 이들 25 개의 실험에서의 대조 세포의 평균 회수율은 81%이고, 변이 계수는 7.8%이었는데, 이는 샘플이 적절히 처리되었다는 것을 예시한다. 스파이크 처리된 세포수와 회수된 세포수의 상관 관계는 r2=0.99이고, 기울기는 0.84이며, 인터셉트(intercept) 3.2는 스파이크 처리된 종양 세포의 레벨과는 무관한 종양 세포 회수율 84%를 의미한다. 10 명의 수혈자로부터의 혈액 부분표본 7.5 ㎖에 0 및 10 개의 종양 세포의 스파이크 처리를 수행하여 시스템의 감도를 테스트하였다. 20 개의 실험에서의 평균 대조 세포 회수율은 85%이고, 변이 계수는 7.7%이었다. 실제의 스파이크 수의 확실성은 스파이크 처리된 세포의 수에 따라 감소한다. 2 가지의 다른 날에 실험을 수행하였는데, 하루는 10개의 세포를 스파이크 처리하는데 있어서의 변이 계수가 25%이었으며, 다른 날은 15%이었다. 스파이크 처리하지 않은 샘플에서는 처리후 종양 세포가 발견되지 않았다. 반대로, 6∼15 개의 종양 세포 범위 (평균 10.5 세포 CV 32%)의 스파이크 처리한 혈액 샘플 모두에서 검출된다. 이러한 데이터는 시스템의 감도가 처리된 혈액 부피에 의하여서만 제한된다는 것을 예시한다.
상이한 부위 및 오퍼레이터에서 샘플 제조 및 분석 시스템의 성능을 특성화하기 위하여서는, 6 개의 시스템을 다른 위치에 배치하였다. 99 명의 건강한 수혈자에게서 얻은 혈액 샘플을 이들 위치에서 2중 처리하였다. 6 개의 위치에서의 대조 세포의 평균 회수율은 77.1%이고, 변이 계수는 9.7%이었다. 예상한 바와 같이, 2중 샘플간의 재현성은 변이 계수 4.9%로 우수하였다. 잠재적 종양 세포로서 소프트웨어에 의하여 분류되는 사건의 수는 10∼304개의 사건으로서 평균 55이었다. 후보 사건의 보고에 의하면, 192 개의 혈액 샘플 중 28 개 (14.6%)에서, 하나의 세포는 CTC로 분류되며, 9 개의 샘플에서 2 개의 세포 (4.7%), 3 개의 샘플에서 3 개의 세포 (1.6%) 및 1 개의 샘플에서 13 (0.5%) CTC가 발견되었다. 하기 표 III에는 각 위치에 대한 이들 실험 결과를 도시한다. 22 명의 전이성 유방암에 대하여 치료 받은 환자에서는 16∼703 개의 (평균 116)의 후보 CTC가 발견되었다. 후보 사건의 보고에 의하면, 22 개의 혈액 샘플중 13 개에서, 3 개보다 적은 세포가 CTC로 분류된 것으로 밝혀졌으며, 4 개의 샘플에서 3∼10 개의 CTC가 발견되었으며, 5 개의 샘플에서 10 보다 많은 CTC가 발견되었다.
순환중인 종양 세포는 매우 낮은 빈도에서도 불구하고 암종 환자의 혈액 중에서 검출될 수 있다. 암 환자의 관리에서의 CTC의 잠재적 사용을 조사하기 위하여, CTC를 정확하고 신뢰성 있게 계수하고 특성화할 수 있는 시스템은 제어된 임상적 연구를 수행하여야만 한다. CTC의 갯수는 종양 부하를 나타낼 수 있으며, CTC 갯수에서의 변화는 주어진 치료의 효율을 평가하는 수단으로서 제공될 수 있다. 치료 표적의 존재 또는 부재에 대한 CTC의 분석을 사용하여 치료를 가이드할 수 있다. 건강할 것으로 생각되는 피험체의 CTC 검출은 암의 조기 검출에서의 진보를 나타낸다. 이러한 조기 검출이 가능할 경우, 고형 종양의 비침습성, "전신" 생검이 혈액 테스트에 의하여 수행될 수 있다.
이 때문에, 혈액 7.5 ㎖로부터 상피 세포를 면역자기법으로 분리하고, 동시에 표본 부피를 감소시키고, 세포를 면역형광 표지시키는 반자동 시스템을 개발하였다. 이러한 시스템은 액체 샘플 320 ㎕를 생성하는데, 이를 분석 챔버 및 자기 장치로 옮기고, 이는 샘플중의 자기 표지된 세포 모두를 분석용 챔버의 상부 내면으로 끌어당기게 된다. 4색 형광 분석을 CellSpotter (등록상표) 시스템으로 샘플에 수행하여 내부 대조 세포를 계수하고, 핵, 세포질 시토케라틴의 양성 염색 및 CD45에 대한 세포 표면 염색의 결핍에 의하여 종양 세포로 잠재적으로 분류하여 물질을 분류하게 된다. 종양 세포로서 잠재적으로 분류되는 모든 물질의 썸네일은 사용자가 최종적으로 판단할 수 있게 하는 사용자 인터페이스내에 제시하게 된다.
시스템에 의하여 수행되는 샘플 제조는 계수된 종양 세포의 높은 회수율 및 우수한 재현 가능성에 의하여 예시되는 바와 같이 혈액 샘플의 수동 제조와 비교시 잇점을 제공하게 된다. 스파이크 실험으로부터의 데이타는 시스템의 우수한 선형성 및 감도를 예시한다. 시스템의 재현성을 예시하기 위하여 99 명의 정상의 수혈자로부터 얻은 2중 혈액 샘플을 6 개의 상이한 부위에서 처리하였다. 모든 부위에서의 데이터는 내부 대조 세포의 회수율을 평가하는 것으로서 재현율을 예시한다. 내부 대조 세포의 평균 회수율은 77.1%이고, 변이 계수는 3.2% 및 11.8% (평균 9.7%)이었다. 시스템의 감도는 환자 샘플에서의 CTC를 검출하는 능력 및 정상 수혈자의 혈액중의 CTC의 구별에 의한 특이성으로 측정한다. 분석 소프트웨어는 192명의 정상의 혈액 샘플에서의 10∼304 (평균 55)의 후보 사건을 구별하며, 이러한 후보의 보고에 의하면 CTC로 분류되는 것은 평균 0.4 시간인 것으로 나타났다. 전이성 유방암에 대하여 치료받은 22 명의 환자 중에서 16∼703 (평균 116)의 후보 CTC가 발견되었으며, 0∼59 (평균 7)이 CTC로 분류되었다. 22 명의 환자중 15 명의 혈액에서 CTC의 수가 정상인에서의 평균 CTC 계수에 대한 99% 신뢰도의 간격을 갖는 상한을 초과하였다. (평균 + 2.6 * SE=0.56). 정상의 혈액 샘플에서, 13 개의 사건이 오퍼레이터에 의하여 CTC로 분류되었으나, 데이터의 보고에 의하면 이는 DiOC16으로 약하게 염색된 내부 대조 세포에 기인한 것으로 밝혀졌다. 대조 세포의 분류 착오로 인한 잠재적 가짜 양성 결과를 배제시키기 위하여, 내부 대조 세포의 첨가는 실제 환자 샘플을 실험하기 이전에 시스템과 오퍼레이터의 숙달을 예시함으로써만 수행될 수 있다. 샘플 제조 및 CTC 분석에서의 시스템과 오퍼레이터간의 일치되며 재현가능한 결과는 암종 환자의 관리에서의 CTC 레벨의 역할을 규명하기 위한 제어된 임상 연구를 수행하는 기회를 제공하게 된다.
99 명의 건강한 대조군의 192 혈액 샘플의 분석
위치 n 평균 CC CV(%) CV(%) 후보 사건 CTC
회수율(%) Across Dupl최소 최대 평균 최대 평균
1 45 75.2 11.8 7.5 19 158 61 2 0.3
2 48 80.2 6.4 6.9 10 145 40 3 0.6
3 12 85.1 3.2 2.6 43 304 119 0 0.0
4 18 76.7 11.2 4.2 23 115 60 1 0.1
5 16 77.7 5.5 3.2 17 182 60 3 0.4
6 53 74.0 9.2 5.4 13 134 46 13 0.3
총 192 77.1 9.7 4.9 10 304 55 13 0.4
n= 사건수CC=대조 세포
실시예 3
전이성 유방암에 대하여 치료받은 환자에게서 순환중인 상피 세포의 계수
하기 실시예의 실시를 돕기 위하여 하기의 방법을 제시한다.
환자환자의 동의하에 유방암, 전립선암 및 결장암 암종의 환자 및 대조군에게서 혈액 8∼20 ㎖을 얻었다. 혈액은 1년간 여러 시점에서 이들 환자 중 일부에게서 채혈하였다. 항응고제로서 EDTA를 포함하는 진공채혈관 (벡톤-디킨슨)으로 채혈하였다. 샘플을 실온에서 보관하고, 채혈후 24 시간 이내에 처리하였다. 유방암, 전립선암 및 결장암 환자로부터의 말초 혈액 샘플 그리고 악성 질환이 없는 정상의 대조군에서 순환중인 상피 세포를 계수하였다. 진단 일자, 치료 인터벤션 및 임상적 상태를 환자의 차트를 통하여 얻었다. 연구 기관의 보고위원회는 프로토콜을 승인하였다.
샘플 제조상피 세포 유착 분자 (EpCAM)에 대하여 특이성을 갖는 모노클론 항체는 상피 세포 기원의 조직과 광범위하게 반응성을 갖는다. [문헌: Stahel RA. et al.,Int. J. Cancer Suppl. 8:6-26 (1994); Momburg F. et al.,Cancer Research, 47:2883-2891 (1987); Gaffey MJ et al.,Am. J. Surg. Path. 16:593-599 (1992)]. EpCAM상의 2 가지의 상이한 에피토프를 인지하는 GA73.3 또는 MJ37 EpCAM 항체 [문헌: Herlyn D. et al., J. Immunol. Mehtods, 73:157-167 (1984), 미국 펜실베이니아주 필라델피아에 소재하는 Wistar Institute 및, MJ Mattes, De Leij L. et al., Int. J. Cancer Suppl. 8:60-63 (1993), Center for Molecular Medicine and Immunology, NJ]를 자기 나노입자 (자성 유체) (Liberti PA & Diccoli SP, 미국 특허 제5,512,332호 (1996), 미국 펜실베이니아주 헌팅던 밸리에 소재하는 이뮤니콘)에 커플링시킨다. 내경이 13 ㎜인 1회용 시험관에 15 분간 항-EpCAM 공액 자성 유체와 함께 혈액을 배양하였다. 10 분간 4 개의 대향 자석으로 이루어진 분리기 (QMS13, 미국 펜실베이니아주 헌팅던 밸리에 소재하는 이뮤니콘)에 시험관을 넣었다. 분리후, 혈액을 흡인시키고 버렸다. 시험관을 자기 분리기로부터 꺼내고, 수집된 분획을 2 ㎖의 FACS 삼투화 용액 (BDIS, 미국 캘리포니아주샌어제이 소재)으로 용기의 벽면으로부터 재현탁시키고, 이를 5 분간 자기 분리기에 넣었다. 용액을 흡인시키고, 버리고, 세포를 150 ㎕의 세포 완충액 (PBS, 1% BSA, 50 mM EDTA, 0.1% 나트륨 아지드)내에서 재현탁시키고, 여기에 피코에리트린 (PE) 공액 항-시토케라틴 (CAM5.2 모노클론 항체) 및 페리디닌 클로로필 단백질 (PerCP)-표지된 CD45를 포화 상태로 첨가하였다. 15 분간 배양한 후, 세포 완충액 2 ㎖를 첨가하고, 세포 현탁액을 5 분간 자기 분리하였다. 미분리된 현탁액을 버리고, 미국 캘리포나이주 샌어제이에 소재하는 BDIS에서 시판하는 Procount 시스템에 사용된 핵산 염료를 제조업자의 지시에 따라 첨가한 완충액 0.5 ㎖에 상기 수집된 세포를 재현탁시켰다. 자성 유체에 EpCAM 항체 MJ37을 사용한 경우, GA73.3 PE를 사용하여 선택된 상피 세포를 구별하였다. 이러한 경우, 세포의 삼투화는 필요하지 않다. 유세포분석 시약은 미국 캘리포니아주 샌어제이에 소재하는 BDIS에서 제공한다.
순환중인 상피 세포의 조직 공급원을 결정하기 위한 예시의 방법은 세포화학 및 면역학적 구별 기법을 사용한다. 5% BSA를 사용하여 30 분간 비특이성 결합 부위를 결합시킨 후, 닥터 나일 밴더 (미국 뉴욕주 이타카에 소재하는 코넬 유니버시티)로부터 입수한 클론 J591, 전립선 특이성 항원 (PSMA), MUC-1 당단백질 (MUC-1, Ma695 노보카스트라), 시토케라틴 5, 6, 8, 18 (CK, 5D3, LP34, 노보카스트라)를 인지하는 1차 모노클론 항체를 슬라이드에 첨가하였다. 샘플을 20 분간 실온에서 배양하고, PBS중에서 5 분간 2회 세정한 후, 이를 2차 토끼 항-마우스 Ig (Z0259, 미국 캘리포니아주 카펜테리아에 소재하는 다코 코포레이션)에 노출시켰다. 2 회이상의 세정후, 샘플을 15 분간 알칼리-포스파타제-항-알칼리 포스파타제 (APAAP) 토끼 Ig 착체와 함께 배양하였다. 마지막으로, 효소 기질 (New Fuchsin, 미국 캘리포니아주에 소재하는 다코 코포레이션)을 첨가하여 적색 침전물이 생성되도록 하였다. 핵을 헤모톡실린으로 대조염색시켰다. 광 현미경에 연결된 Kodak 디지탈 카메라를 사용하여 데이타를 기록하였다. 데이타는 추후의 참조용으로 CD에 저장하였다.
샘플 분석
FACSCalibur 유세포분석기(미국 캘리포니아주 샌어제이의 BDIS) 상에서 샘플의 85%를 분석하였다. 핵산 염료의 형광에 대한 역가를 이용하여 리스트모드로 데이타를 얻었다. Paint-A-GatePro(미국 캘리포니아주 샌어제이의 BDIS)를 사용하여 다중변수 데이타 분석을 실시하였다. 분석 기준은 전방 광 산란에 의해 정해지는 크기, 직각 광 산란에 의해 정해지는 입도, PE 표지된 시토케라틴 모노클론 항체에 의한 양성 염색 및 PerCP 표지된 CD45 모노클론 항체에 의한 비염색을 포함하였다. 각 샘플에 대해서, 상피 세포에 전형적인 영역에 존재하는 사건(event)의 수를 10 ㎖ 혈액에 대해 정규화하였다.
전혈 내로 스파이킹된 종양 세포가 본 발명의 분석 방법을 사용하여 분리되는 경우 얻은 결과는 도 5A 및 도 5B에 도시되어 있다. 패널 5A는 현미경에 의한 분석을 나타내고 패널 5B는 유세포분석법에 의해 얻은 분석 결과를 나타낸다. 도 6A-6C는 3개의 시점에서 전이성 유방 암종 환자로부터 얻은 혈액 샘플 10 ㎖를 유세포분석한 3가지 실시예를 예시하며, 유세포분석에서 항-백혈구 대 항-상피 세포 항체의 상관관계 표시를 포함한다. 도 6의 패널 A에서는 14 사건이 검출되는 데, 이것은 상피 세포에 전형적인 위치에 존재한다. 패널 6B에서는 108 상피 세포가 검출되며, 패널 C에서는 1036 상피 세포가 검출된다.
10 ㎖ 혈액 샘플의 분석에서 핵산 염료에 대한 역치 설정을 통과하는 사건의 수는 5,000∼50,000 사건으로 다양하였다. 이들 사건은 세포 파편 및 백혈구로 구성된다. 32개의 대조군 혈액을 분석하면, 상피 세포에 대해 전형적인 영역에 존재하는 사건의 수는 0∼4/10 ㎖ 혈액(평균 1.0, SD=1.2)이었다.
8명의 유방암 환자는 연구 기간 동안 활성적인 전이성 질병을 보유하였다. 이들 환자에서 혈액 10 ㎖ 중 상피 세포의 수는 0∼1036으로 다양하였다. 질병의 활성은 주관적인 기준, 즉 뼈의 통증, 호흡곤란 등과 객관적인 기준, 즉 X-레이, 뼈 검사(bone scan), CT 스캔, MRI 및 림프절 크기 등으로 평가하였다. 환자를, 표 IV에 개시된 바와 같이 카테고리 0∼4로 분류하였다.
수술 시술 후에 질병의 임상적 활성에 따른 환자의 분류
카테고리 기준0 수술 시술 후에 어떤 시점에서도 질병의 증거가 없음1 수술 시술 후에 한 시점에서 질병의 증거가 있음2 통제하에서 질병의 증거가 있음3 활성 진행성 질병4 치명적인 질병
전이성 질병이 있는 8명의 환자의 혈액 중 상피 세포 계수의 역학은 도 7에도시되어 있다. 플롯 중 빗금친 부분은 대조군에서 양성 사건이 검출된 범위를 나타낸다. 플롯은 또한 화학요법이 실행된 때를 제시한다. 도 7의 패널 A는 치명적인 질병을 갖는 여성 환자가 연구에 참여한 시점에서 혈액 10 ㎖당 200 상피 세포를 보유함을 도시한다. 고 용량의 아드리아마이신은 상피 세포의 수를 정상 범위 내로 감소시키지만, 아드리아마이신을 중단한 후에는 다시 상승하였다. 두번째로 아드리아마이신을 투여한 후의 추세를 살펴보면, 상피 세포의 수가 유의적으로 저하되었지만, 여전히 정상 범위보다는 높았다. 도 7의 패널 B는 43주간의 한 환자의 경과를 보여준다. 연구를 시작할 때 환자는 무증상이었지만, 과거에 뼈 전이를 갖었던 것으로 알려져 있다. 상피 세포는 정상 수준보다 높게 검출되었고, 연구 과정에서 서서히 증가하였다. 고 용량의 아드리아마이신을 투여한 후에 상피 세포의 수가 약간 감소하였다. 환자의 질병 활성이 이 기간에 증가하였음은 명백하다. 도 7의 패널 C 및 D는, 질병 활성이 적은 2명의 환자를 도시한다. 이들 환자에서는, 경시적인 상피 세포의 수 변화가 질병 활성의 변화를 반영하였다. 도 7의 패널 E 및 F에 도시된 환자에서는, 말초혈 상피 세포의 수가 연구된 최종 시점에서 증가하였지만, 환자는 여전히 증상이 없었다.
도 7G에 도시된 사례에서는, 유방암 수술(T2N1M0) 3년 후에 연구된 제1 시점에서 상피 세포가 검출되지 않았다. 4주 후에, 유세포분석법으로 혈액 10 ㎖ 중 50 상피 세포가 검출되었다. 이 시점에서 환자는 질병 재발의 임상적 증후를 나타내지 않았다. 추가의 혈액 샘플을 분석하여 유세포분석으로 검출된 세포가 악성 세포와 일치하는 특징을 나타낸다는 형택학적 확증을 얻었다.
도 8A는 핵 대 세포질의 비율이 크고 시토케라틴으로 양성 염색되는 2개의 세포를 도시한다. 이 2개의 세포의 특징은 상피 세포 기원의 종양 세포와 일치하였다. 이러한 발견 4주 후에, 환자의 겨드랑이 림프절 생검을 실시하였다. 생검으로부터 얻은 세포는 악성원인 것으로 판명되었다. 이 시점에서의 X-레이는 폐 전이의 증후를 나타내지 않았지만, 2주 후에 실시된 CT 스캔에서는 폐 전이의 증거가 나타났다. 이 환자에서는 폐 전이로 인한 증상이 없었다. 겨드랑이 림프절 병발의 소실에 의해 측정되는 바와 같이 환자는 비노렐빈에 잘 반응하였다. 말초혈 상피 세포의 수는 정상 범위보다 약간 높은 수준으로 떨어졌다. 치료를 개시한 지 28주 후에, 말초혈 상피 세포의 수가 증가하였으며, 물리적 검사에 의해서 알 수 있는 바와 같이 겨드랑이 림프절의 크기가 증가하였다. 유방암의 전이 질병을 갖는 8명의 환자의 말초혈 상피 세포의 수는 연구 기간 동안 질병의 활성과 치료에 대한 반응 또는 이의 결핍을 반영하는 것이 명백하다.
전술한 실험은 콜로이드 자기(magnetic) 나노입자를 사용하여 실시하엿다. 본 실시예에서, 혈액 중에 낮은 빈도로 존재하는 종양 세포를 선별하기 위한 크기가 더 큰 자기 비드의 효율을 평가하여, 종양 세포의 선별에 미크론 크기 비드를 사용할 지 여부를 결정하였다. 그러나, 전술한 바와 같이, 이러한 적용에는 나노미터 크기의 자기 입자가 바람직한 것으로 생각된다.
전술한 바와 같이, 크기가 큰 비드를 사용할 때 다음과 같은 단점이 생긴다.
(i) 비드가 확산되기에는 너무 커서, 낮은 빈도로 존재하는 표적 세포와 비드를 충돌시키려면 혼합 절차가 필요하다는 것,
(ii) 비드가 매우 빠르게 침강되어, 추가로 연속 혼합해야 한다는 것,
(iii) 세포 주변에 크기가 큰 비드 클러스터가 생겨서 분석이 불명료해진다는 것.
따라서, 시각화 또는 분석 전에 세포로부터 크기가 큰 비드를 제거해야 한다. 본 발명에 따르면, 큰 비드를 이용한 세포 선별의 효율은, 비드의 농도를 증가시키고, 희소한 표적 세포에의 결합을 촉진하기 위해서 연속 혼합하면서 배양 시간을 늘리면 개선시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 본 실시예에서, 2.8 ㎛ 다이날(Dynal) 항-상피 세포 비드(미국 뉴욕주 다이날)를 사용하여, 거대 비드에 대한 최적 조건 하의 모델 연구에서 혈액으로부터의 종양 세포의 선별 효율을 시험하였다. 이들 비드를, 상피 종양 세포에 특이적인 모노클론 항체와 접합시킨다. 알려진 수의 종양 세포(암세포주)를 정상 혈액에 스파이킹하여 비드를 이용한 선별 후에 회수율을 측정하였다. 검출 과정에서 혈액 세포와 종양 세포를 구별하기 위해서 형광 염료로 종양 세포를 사전표지하였다. 프로토콜은 제조업자가 권장하는 바에 따랐다.
전혈(5 ㎖)을 15 ㎖ 폴리스티렌 원심분리관에 첨가하고, 20 ±3 형광 표지된 SKBR-3(유방암 세포주) 세포를 첨가하였다. 핵산 염색 염료(훽스트 33342)로 SKBR-3 세포를 사전염색하여 비드에 의한 선별 후에 검출할 수 있도록 하였다. 5 mM EDTA를 함유하는 듈베코 PBS 5 ㎖로 혈액을 희석하고, 교반기(rocker)에서 4℃에서 15분간 희석된 혈액과 혼합하였다. 50 ×106비드를 함유하는 다이날 항-상피 세포비드 100 ㎕를 혈액 샘플 중에 첨가하고, 교반기에서 혼합하면서 4℃에서 30분간 항온처리하였다. 사용된 비드의 수는 총 백혈구와 유사하였다. 즉 백혈구 세포당 비드의 수는 1개였다. 다이날 MPC 자기 분리기에 샘플 튜브를 6분간 넣어서 자기 표지된 세포를 분리하였다.
상청액을 흡입한 후에, 수거된 세포를 0.1% BSA 함유 듈베코 PBS 3 ㎖에 재현탁시켰다. 샘플 튜브를 다이날 MPC에 6분간 다시 넣어 임의의 잔류 혈액 세포를 제거하였다. 상청액을 흡입한 후에 0.1% BSA 함유 듈베코 PBS 200 ㎕에 자기 결합된 세포를 재현탁시켰다.
선택된 종양 세포, 비특이적으로 결합된 혈액 세포 및 과량의 유리 자기 비드를 함유하는 최종 샘플을 면역형광 슬라이드에 스폿하여 종양 세포를 검출하였다. 10 상이한 웰에 200 ㎕ 샘플을 스폿하여 유리 자기 비드를 분산시켰다. 각 웰에 존재하는 형광 염색된 종양 세포는 형광 현미경을 사용하여 계수하였다. 결과는 표 V에 제시되어 있다.
실험 번호 회수된 종양 세포 회수율(%)
1 16 80
2 17 85
3 10 50
4 11 54
이 결과로부터, 다이날 자기 비드에 의해 스파이킹된 종양 세포의 평균 67%가 혈액으로부터 회수됨을 확인할 수 있다. 이것이 시사하는 바는, 혈액 중에 존재하는 종양 세포를 최적 조건 하에서 크기가 더 큰 자기 비드로 효과적으로 선별할수 있다는 것이다. 그러나, 본 실시예에서는 임의의 분석을 실시하지 않고 혈액으로부터 종양 세포를 선별하는 것만을 평가하였다. 세포는 강한 형광 염료로 사전표지되었기 때문에, 회수 효율을 추가로 측정할 수 있다. 최종 샘플(200 ㎕)은 선택된 종양 세포(10-17) 외에 50 ×106비드와 비특이적으로 결합된 백혈구를 포함하였다. 비드의 크기(2.8 ㎛)는 일부 혈액 세포의 크기와 유사하였으며, 슬라이드 상의 대부분의 표면적을 차지하였다. 따라서, 회수 데이타를 얻기 위해서는 샘플을 일부 웰 상에 스폿하여 회수된 종양 세포를 검출할 수 있도록 유리 자기 비드를 충분히 분산시켜야 한다.
세포 표면 상에는 많은 비드가 존재하여 추가의 분석을 위한 선별된 종양 세포의 관찰 및 염색을 방해하였다. 본 실시예에서, 형광 핵산 염료로 종양 세포를 사전염색하였으며, 검출을 위한 추가의 염색은 필요하지 않았다. 그러나, 자기 비드 결합된 세포원 조직을 확인하는 것이 흔히 바람직하다. 이러한 확인은, 임상 샘플 중에 존재하는 종양 세포를 검출하여 특성화하기 위해서 표지된 항체를 사용하여 실시하였다. 따라서, 표적 세포의 선별 후에, 즉 분석 전에 비드를 세포 표면으로부터 제거하고 샘플로부터 분리해야 한다. 이러한 절차는 자기 나노입자를 사용한 사례에는 해당되지 않는다. 왜냐하면, 나노입자의 크기는 세포 분석을 방해하지 않기 때문이다.
요컨대, 본 실시예는 순환 종양 세포의 효과적인 분리를 위해서 본 명세서에 개시된 방법에 거대 자기 비드를 이용할 수 있음을 보여준다.
분리된 세포를 유의적으로 손상시키지 않는 세포 표면으로부터 비드를 방출시키는 데 이용가능한 몇몇 방법이 있다. 그 중 한 방법은 포함된 항원 또는 항체에 대한 친화도가 더 높은 과도하게 특이적인 경쟁 시약을 과량으로 첨가하여 세포 표면으로부터 항체를 치환하는 것이다. 이러한 종류의 기전은 펩티드(박스터 아이솔렉스 300)를 이용한 임상 적용에서 CD34 분리된 세포로부터 비드를 방출시키는 데 사용된다. 펩티드는 비드 상의 항체와 결합하는 데 있어서 CD34 항원과 경쟁하여, 세포로부터 항체-비드 복합체를 방출시킨다. 또 다른 방법은 비드와 항체간의 가역적 화학 링커를 사용하는 것이다.
자기 비드와 항체가 접합하는 동안 화학적 링커를 삽입할 수 있다. 화학적 결합은 항체로부터 비드를 방출하기 위해 적절한 조건 하에 절단될 수 있다. 현재 사용 중인 방법 중 하나는 항체를 자기 비드에 결합시키는 핵산 링커를 사용한다. 핵산 링커는 폴리뉴클레오티드이며, DNAse 효소를 사용하여 특이적으로 가수분해할 수 있다. 핵산 링커 중에 존재하는 뉴클레오티드 결합의 가수분해 후에, 세포에 결합되어 있는 항체로부터 비드를 방출시킨다. 자기 분리에 의해 방출된 비드를 세포 현탁액으로부터 제거할 수 있다. 비드로부터 유리된 세포는 현미경 또는 유세포분석에 의한 추가 분석에 이용될 수 있다.
본 실시예는 크기가 큰 자기 비드를 사용하여 혈액으로부터 종양 세포를 분리할 수 있음을 입증한다. 단, 이들 비드는 세포를 표지하기에 충분히 높은 농도로 사용되어야 하고, 분석 전에 세포로부터 방출되어야 한다.
실시예 4
치료 목적으로 유방암 수술을 한 후에 질병의 증거가 없는 환자에서의 순환하는 상피 세포의 계수
수술 1∼20년 후에 37명 환자의 말초혈에 대해 상피 세포의 존재를 유세포분석으로 조사하였다. 이들 환자들로부터 최대 7개의 말초혈 샘플을 1년에 걸쳐 취하였다. 표 VI에는 각각의 환자가 열거되어 있고, 수술시로부터 수술 후 경과 년수에서 TNM(종양, 결절 및 전이) 단계에 따라 분류하였다. 표 VI은 또한 연구 기간 동안 환자가 치료(화학 요법 또는 호르몬 요법)를 받았는 지 여부를 보여준다. 과거 원격 전이의 증거가 있었으나 연구시에는 완전히 완화된 6명의 환자 중 3명에서는, 대조군에서 발견되는 것보다 더 높은 빈도로 상피 세포가 발견되었다. 순환하는 상피 세포는 원격 전이의 증거가 없는 31명의 환자 중 9명에게서도 발견되었다.
이들 9명의 환자에서 유세포분석을 실시한 결과 상피 세포에 전형적인 영역 내에 존재하는 사건의 수가 적은 것을, 이들 사건을 종양 세포로 확인하는 것은 정당하지 않다. 면역자기 방법으로 선별된 세포를 슬라이드 상에 두어 얻은 세포학 결과는, 도 8에 도시된 바와 같이 이의 정체를 평가하는 데 상당한 도움이 된다. 도 8의 패널 A는 채혈한 시점에서 전이성 질병의 증거가 없는 환자로부터 얻은 시토케라틴에 대해 양성 염색된 2개의 세포를 나타낸다. 패널 8B는 과거 전이성 질병을 앓았지만 완전 완화된 환자로부터 얻은 세포를 도시한다. 패널 8C 및 8D는 시점 6에서 환자 25의 혈액으로부터 분리한 2개의 세포를 도시한다. 패널 8C에 도시된 세포는 악성과 일치하는 특징을 갖는 반면, 패널 8D의 세포는 정상 편평 상피 세포의 외관을 나타낸다.
치료 목적으로 유방암에 대한 수술을 시행한 후 질병의 증거가 없는 환자와 32명의 대조군의 말초혈 10 ㎖ 중에 유세포분석으로 확인된 상피 세포의 수
TNM = 종양, 결절, 전이
Ys = 1차 수술후 경과 년수
Tx = 요법, CT = 화학 요법, H = 호르몬 요법, - = 치료를 행하지 않음
1,2,3,4,5,6,7 = 상피 세포의 수가 측정된 후속 시점(년)
실시예 5
수술 시술 후에 유방암으로 진단받은 환자에서의 순환하는 상피 세포의 계수
표 VII에는 13명의 대조군과 30명의 유방암 환자를 본 발명의 분석법으로 평가하는 유사한 시험 후에 얻은 결과가 요약되어 있다. 대조군 개체에서 20 ㎖ 혈액 중 상피 세포의 수는 0-5(평균 1.5 S.D.=1.8) 범위였다. 대조적으로, 기관 한정된 유방암(TxNoMo로서 분류됨) 14명의 환자의 혈액 샘플 20 ㎖ 중 상피 세포는 평균 15.9 S.D. = 17.4, 결절 관련 환자에서는 평균 47.4 S.D. = 52.3, 그리고 원격 전이 환자에서는 평균 122 S.D. = 140이었다. 전이와 관련 없이 대조군과 유방암 환자 간의 차이는 상당히 유의적이었다[다중변수 분석(Kruskal-Wallis)에 의해 P, 0.001]. 기관 한정된 그룹과 원격 전이 그룹 간의 차이는 0.009(t 테스트)였다. 기관 한정된 유방암 환자의 상피 세포의 수는 14 사례 중 12 사례에서 컷오프 점(대조군에서의 평균값 + 3 SD = 6.9) 이상이었다. 또한, 상피 세포로서 분류되는 사건이 5 이상인 개체가 대조군에서는 없었고, 기관 한정된 유방암 환자 14명 중 2명만이 <7 사건을 나타내었다.
유세포분석을 이용하여 대조군 개체와 유방암 여성으로부터의 혈액 20 ㎖로부터 얻은 양성 사건을 분석하였다. 대조군의 혈액 중 상피 세포의 수는 유방암 환자 3그룹으로부터 각각 얻은 것과 t 테스트(P ≤0.01) 및 Kruskall-Wallis 비변수 분석(P < 0.001)에 의해 통계학적 차이가 있다. 이 표에 개시된 데이타를 사용하여 양성 실시예에 대한 예비 컷오프 값을 설정하였다. 이 값은 정상 대조군에서 순환하는 상피 세포의 수를 평균한 다음 SD를 3배하여 정하였다. 평균은 1.5였고 SD는 1.8이었다. 컷오프: 1.5 + 5.4 = 6.9. 남성과 여성 대조군 사이에 통계학적 차이는없었다.
실시예 6
전이 CAP 환자에서의 CTC 모니터링
전립선의 전이 질병을 앓고 있는 3명의 환자를, 화학 요법 치료 후에 혈중 순환성 상피 세포의 존재에 대해 평가하였다. 그 결과는 도 9에 도시되어 있다. 데이타로부터 혈중 순환성 상피 세포 수의 증가는 질병 활성과 관련되어 있음이 밝혀졌다.
0, 1, 2, 7, 12, 17 및 25주 간격으로 CTC 및 PSA를 순차 시험할 10명의 환자를 선택하였다. 8명의 환자는 호르몬-저항성 질병을 보유하고, 한명은 호르몬 요법을 거부하였고, 1명은 호르몬 감성 질병을 보유하였다. 각 지점에서의 환자의 CTC 및 PSA 농도는 도 10에 도시되어 있다. 호르몬 감성 환자는 연구 기간 동안 PSA 수준이 0.1 ng/㎖ 미만이었고, CTC 수는 대조군과 유사하였지만, 단 마지막 지점에서 14개의 종양 세포가 측정되었다(도 10A). 1주일 후에 반복된 CTC 계수는 15였고 조기 관찰을 확인하였다. 이 환자에서는 질병 진행을 제시하는 증후나 증상이 관찰되지 않았다. 3명의 환자에서는 질병이 서서히 진행되었다(도 10B 내지 D). 이들 환자의 평균 CTC 계수는 대조군(3.0 ±3.0 종양 세포/7 ㎖, P=0.002, n = 25)과 통계학적으로 달랐다. 25개의 샘플 중 6개에서는 CTC 수가 7 ㎖당 5 이상이었다. 전방 광 산란으로 CTC 크기를 평가하였으며, CTC가 5 이상인 샘플에서 이들 세포의 77% ±15%는 10 ㎛보다 컸다. 연구 기간 동안 6명의 환자는 질병 진행을 나타내었다. 이들 환자 중 4명의 CTC 및 PSA 값은 도 10E 내지 10H에 도시되어 있다. 평균CTC 계수는 대조군과 명백하게 달랐으며(범위 1∼283, n=22, 평균 45 ±65 CTC/7 ㎖), 질병이 서서히 진행되는 환자와도 통계학적으로 달랐다(P=0.008). 22개 샘플 중 19개에서는 CTC 계수가 5 이상이었고, CTC 51% ±17%는 10 ㎛보다 컸다. 이 그룹의 환자에서는 CTC 증가가 PSA 농도 증가와 유사하였다.
에스트라무스틴과 탁산 계열의 화학요법을 실시한 2명의 환자는 대조군 및 질병이 서서히 진행되는 환자와 비교하여 CTC 계수의 명확한 차이가 있었다(범위 14∼218, 평균 104 ±68 CTC/7 ㎖). 이들 환자에서 CTC의 32% ±13%만이 크기가 10 μM보다 컸다. 3 환자 그룹 사이의 CTC 크기 비교는 t 테스트로 실시하였으며, 그 결과 그룹 1과 그룹 2(P=0.04), 그룹 1과 그룹 3(P = 0.0001), 및 그룹 2와 그룹 3(P = 0.0008) 사이에는 유의적인 차이가 있었다. 양 환자에 대한 CTC와 PSA 값 그리고 화학요법 실시는 도 11에 도시되어 있다. CTC 변화는 화학요법 실시와 일치하였다. CTC의 상대적 변화는 PSA보다 더욱 확실하였으며, 양 그래프에서 CTC 계수는 PSA 수준과 유사하였다. 그러나, 실제 관계는 좋지 않았다(도 11A, R=0.17, 및 도 11B, R = 0.46).
본 발명의 방법은 CTC를 확인할 수 있으며, HRPC 진행 과정에서 CTC 변화를 평가하는 데 사용되었다. 시험관내 PC3 세포 스파이킹 실험 결과, 강한 직선 상관관계(R2=0.99) 및 우수한 회수율(74% ±9%)을 확인하였다. 7.5 ㎖ 혈액 중 0.8 ±1.2 세포의 검출 한계는 22명의 정상 남성 공여자의 혈액을 분석하여 결정하였다.
종양 1 g은 약 106세포를 혈액 내로 탈락시킨다. CTC가 국소 CAP에서 발견될 수 있다는 본 발명자들의 관찰 결과는 국소 유방암을 평가하는 이전의 실험 결과와 일치하는 것이다. 전이 CAP 환자 10명을 선택하여 6 개월간 CTC 적재량 및 혈청 PSA 농도에 대한 일련의 실험을 실시하였다. 환자를 3가지 코스로 매주, 그리고 6개월간 약 5주마다 환자를 시험하였다. 조기 호르몬 내성 전립선암(HRPC)(n=3) 또는 호르몬 감성 질병(n=1)이 있는 4명의 남성을 평가하였다. CTC 계수는 낮았지만(3.0 ±3) 대조군과 유의적으로 상이하였다(P<0.002). 전체적으로, CTC 계수의 추세는 급격히 증가하지 않았으며 PSA 패턴과 일치하였지만, 호르몬 감성 질병 환자의 경우에는 예외였다(도 10A). 이 경우, CTC 계수는 17주에서 7 ㎖ 혈액 중 14 세포로 급격히 상승하였으며, 1주 후에 확인하였다. 이것은 진성 생물학적 사건임을 시사한다. 혈청 PSA 수준은 검출가능하지 않았다. CTC 농도의 급격한 증가가 생화학적 PSA 실패로 인한 것인지를 결정해야 한다.
4명의 다른 남성은 급격한 진행성 전이 질병 또는 HRPC를 앓고 있었다. 이들의 CTC 계수는 조기 HRPC 그룹보다 유의적으로 높았다(도 10E-10H). 혈청 PSA 및 CTC 값은 상관관계가 있는 것으로 보였다. 그러나, 계산 결과 상관값은 다양하였다(도 10A, R=0.42; 도 10B, R=0.67; 도 10C, R=0.65 및 도 10D, R = 0.98). 도 10E에 도시되어 있고, 벌키한 복막뒤 질병으로 인한 폐색성 요로병증을 유발하는 전이 CAP로 인한 요독 혼수로 사망한 환자에서 전혀 다른 관계(R = 0.42)가 발생하였다. 본 발명자들은 대사 교란이 제1주에 CTC 계수의 급격한 일시적 강하를 유발할 수 있다고 가정하였다. 가장 강력한 상관관계는 도 10H에 도시된 환자에서 발생하였다(R=0.98). 이 환자는 CTC 계수의 급격한 상승을 상당히 반영한 상승 PSA 농도를 나타내었다. 그 환자는 증후성 진행을 나타내었지만, 화학요법은 실시하지 않았다.
10명의 환자 중 2명에게는 유사한 방식으로 혈청 PSA 농도 및 CTC 계수에 영향을 주는 화학요법을 실시하였다(도 11). 이들 환자는 14∼218 종양 세포/7 ㎖ 범위의 CTC 수를 유지하였다. 양 사례에서, 본 발명자들은 제1 탁소테레 투여 1주 후에 CTC 계수가 실질적으로 감소됨을 관찰하였는데, 이것은 PSA 수준의 감소와 유사하였다. 양 환자는 탁소테레의 연속 투여에도 불구하고 CTC 및 PSA 수준의 유의적인 증가를 나타내었다. 도 11B에 도시된 환자는 탁솔 요법으로 전환하였고, 도 11A에 도시된 환자는 탁소테레를 계속 사용하였다. 이들은 모두 7∼12주에 CTC 계수의 감소를 나타내었는데, 이것은 역설적으로 증가 또는 변화되지 않은 PSA 수준과 관련되어 있었다. 화학요법을 완료한 지 8주 후에, CTC 및 PSA 수준의 증가가 관찰되었다. 이들 관찰 결과는 CTC 계수가 PSA 수준과 비교하여 독립적인 예후 정보를 제공할 수 있음을 시사한다.
평균 CTC 크기는 더욱 진행된 질병이 있는 남성에서 더 작았다. 본 발명자들은 화학요법 실시 전, 과정 또는 후에 세포 분해를 제시하는 CTC 크기 변화를 발견하지 못하였으므로, 화학요법은 CTC 수를 변화시키지만, CTC 크기를 바꾸지는 않았다.
본 발명자들은 CTC 계수가 HRPC 환자에서 재현가능하게 측정될 수 있다는 결론을 내렸다. CTC 농도 변화는 질병 진행을 반영하였다. CTC 및 PSA 증가의 패턴 및 속도는 달랐으며, 이는 CTC가 PSA와 무관한 예후 정보를 제공함을 시사한다. CTC 유전자형 및 표현형의 특성하는 추가의 치료를 안내할 수 있고 화학민감성 및 내성의 기전을 해명할 수 있어 더욱 중요하다.
실시예 7
질병 활성은 결장암 환자에서의 순환 상피 세포의 수와 관련이 있다
본 발명의 분석 방법을 사용하면 각종 다른 종류의 암 환자를 평가하는 데 유리할 수 있다. 예시를 위해서, 결장암 환자의 순환 상피 세포 농도를 평가하는 데 이 방법을 사용하였다. 미국에서 매년 130,000 명 이상이 직장결장암으로 새로 진단받는다. 이들 환자 중 30∼50%는 재발하여, 이 질병으로 사망한다. 약물 효과를 문서로 증명하기 위한 치료 전후의 종양 생검의 이용율이 낮기 때문에 새로운 치료법의 합리적인 개발이 어렵다.
전이의 증거가 없는 결장암 환자를, 수술 전후에 순환 상피 세포의 존재에 대해 평가하였다. 결과는 도 12에 개시되어 있고, 표 IX에 요약되어 있다. 데이타로부터 결장암 환자의 순환 상피 세포의 수는 수술 시술 전에 더 높았다는 것이 밝혀졌다.
전이의 증거가 없는 결장암 환자의 순환 상피 세포
시험 시기 시험 환자의 수 혈액 10 ㎖ 중 유세포분석으로 검출된 순환 상피 세포
평균 ±SEM 범위
수술 전 12 42.3 ±22.0 0-234
수술 후 25 2.7 ±0.7 0-15
표 X 및 도 13은 전이의 증거가 있는 결장암 환자를 순환 상피 세포의 존재 및 수에 대해 평가하여 얻은 데이타를 제시한다. 그 결과로부터, 말초혈 중 상피 세포의 수가 수술 후에 국소 질병이 있는 환자와 비교하여 전이 질병 환자에서 더 많다는 것이 밝혀졌다. 또한, 이 결과는 전이 질병의 정도가 순환 상피 세포의 수와 관련이 있을 수 있음을 추가로 보여준다.
전이의 증거가 있는 결장암 환자의 순환 상피 세포
시험 환자의 전이 상태 시험 환자의 수 혈액 10 ㎖ 중 유세포분석으로 검출된 순환 상피 세포
평균 ±SD 범위
국부 11 3.7 ±0.6 1-6
원격, 단발 16 7.6 ±2.0 0-21
원격, 다발 8 54.0 ±25.1 5-200
정상 대조군 32 1.0 ±0.2 0-4
생체내 약물역학 평가를 위해 종양 생검을 반복하는 일반적이지 않은 접근법은 항암제의 합리적인 임상 개발을 저해한다. 본 발명의 방법은 순환 종양 세포 중에서 약물 효과를 평가할 수 있어, 이러한 제약이 극복된다. 본 발명의 면역자기 분리 및 자동화된 형광 현미경 시스템이 전이 직장결장암 환자(pts.)의 말초혈로부터 순환 상피 세포를 분리, 계수 및 특성화하는 능력을 평가하는 추가의 시험 연구를 실시하였다. 측정가능한 전이 질병을 갖는 20명의 환자가 등록하였다. 치료 개시시와 질병 재평가시(6∼10주 간격) 말초혈 50 ㎖를 얻었다. 또한, 유세포분석과 유전자 어레이로 순환 및 정위치의 암 세포를 비교하기 위해서 4명의 환자로부터 새로운 종양을 얻었다. 환자 특성은 7M/13F, 중간 연령 64(범위 41-80), 전이 질병의 중간 시점 2.7m(범위 0.6-25m)이었다. 11명의 환자에서 전이 질병에 대한 화학요법을 실시하였다. 전이 질병 부위는 간(13명), 폐(8명), 복막(5명), 소장 및 전측 복벽(각 1명)을 포함하였다. 최대 전이 병변의 직경은 5 cm(범위 1.5∼12 cm)였다. 자성 유체(ferrofluid)에 접합된 항-상피 세포 유착 분자(EpCAM)로 표지한 후에 전혈로부터 순환 상피 세포를 정제하였다. 항-시토케라틴을 이용한 유세포분석 표지로 측정한 바와 같이 회수된 상피 세포의 수의 중간값은 7/7.5 ㎖ 말초혈(범위 3∼150)이었다. 연구 결과는 표 IXB에 도시되어 있다.
[표 IXB]
전이 결장암 환자의 순환 상피 세포의 특성규명
환자 특성(N=20)
성별 7M/13F
이용가능한 새로운 종양 6
연령(년)중앙값범위 6441-80
환자당 샘플수(pts. 수)123 1334
화학요법 전(pts. 수)없음보조제전이보조제 및 전이 7974
전이 질병이 되는 시간(개월)중앙값범위 2.70-25
전이 부위(부위 수)간폐복막 1385
최대 전이 크기(cm)중앙값범위 51.5-12
생체내 약물역학 평가에 대한 본 기술의 적합성을 평가하기 위해서 표피 성장 인자 수용체와 티미딜화 신타제 발현에 대해 유세포분석으로 추가의 표현형 분석을 본 발명에 따라 실시하였다. 본 연구는 전이 직장결장암 환자의 혈액으로부터 순환 종양 세포의 분리 가능성을 입증한다. 또한, 본 발명은 종양 덩어리 내의 원 위치에 존재하는 종양 세포에 대한 순환 종양 세포의 변화를 평가하는 방법을 포함한다. 이러한 변화는, 예컨대 종양 소인 관련 분자의 취득 및 상실을 포함한다. 유전자형 또는 표현형의 변화를 조사할 수도 있다.
상기 실시예는 건강한 개체와 유방암, 전립선암 및 결장암 환자 사이의 순환 상피 세포의 수에 매우 유의적인 차이가 있음을 보여준다. 또한, 순환 상피 세포의 수의 유의적인 차이는 검출가능한 확산이 없는 환자, 국소 림프절로 확산된 환자 및 원격 전이된 환자 간에 발견되었다(Racila et al., (1998), 상기 문헌 참조). 또한, 원발 유방암종을 수술로 제거한 후 환자의 혈중 상피 세포의 수를 1년간 모니터링하였다. 이들 환자 중 일부에서는 잔류 질병이 검측되었다. 전이 질병 환자에서, 말초혈 종양 세포 계수 변화는 종양 하중 및 치료에 대한 반응과 상관관계가 있었다. 이들 연구 결과는 악성 질병의 존재를 검출하고 질병의 활성을 측정하는 객관적인 비침입성 도구로서 본 발명의 세포계 분석의 가능성을 보여준다. 세포 형태학 및 면역표현형은 분리된 세포의 악성 성질을 밝힌다.
실시예 8
분리된 상피 세포의 조직원 확인
환자에서 행한 전술한 모든 연구는 양성 종양을 비롯하여, 암 질병이 없는 정상 개체 또는 환자와 비교하여 암 환자에서 순환 상피 세포가 과도하게 존재함을 보여준다. 그러나, 이들 과량의 순환 상피 세포가 실제로 암세포인지를 입증할 필요가 있다. 이는, 암 환자 또는 암이 없는 환자로부터 취한 면역자기적으로 정제된 상피 세포를 유리 슬라이드 상에서 세포분리(cytospin)시키고 항-뮤신 처리를 한 실험으로 실시하였다. 또한, 정상 개체 유래의 포피 및 혈액에서 얻은 정상 상피 세포를 둘다 대조군으로서 사용하였으며, 이를 세포회전시켰다. 슬라이드에 암호를표시해두고 "맹(blinded)" 실험을 하는 것, 관찰자가 병리학 교육을 받은 적이 있을 것, 그리고 정상 상피 세포를 포함시켜 두는 것이 중요하다. 도 8에 도시된 바와 같이, 분리된 암 세포 대 정상 상피 세포 간의 현저한 차이가 있었다. 정상 상피 세포는 핵 대 세포질의 비율이 낮았다. 즉, 세포질은 풍부하지만, 핵은 비교적 작다. 핵에는 크로마틴이 고루 분포되어 있다. 세포는 항-뮤신으로 염색되지 않는다. 대조적으로, 2명의 유방암 환자로부터 얻은 샘플은 매우 거대한 핵과 작은 테두리의 세포질을 포함하였다. 또한, 핵 내의 어두운 반점으로 보여지는 바와 같이 크로마틴은 조직파괴되어 있고, 세포는 항-뮤신으로 강하게 염색된다. 2명의 전립선암 환자로부터 얻은 세포에서도 동일한 것이 관찰되었다. 병리학 교육을 받은 의사는 암환자 및 비암환자로부터 얻은 암호화된 슬라이드(총 21 슬라이드)를 확인하였다. 병리학 교육을 받은 의사는 모든 대조군으로부터 얻은 혈액이 암 세포를 갖지 않는 것을 옳게 확인하였으며, 슬라이드를 2번 확인하면 내부 관찰 착오가 없었다. 2명의 전립선 환자의 경우에, 이 연구에서 종양 세포가 관찰되지 않았다. 한 슬라이드를 재검하여 종양 세포를 관찰하였다. 이러한 불일치의 원인은 세포 도말 표본을 스캐닝하는 데 소요되는 시간인 것으로 보인다. 요약하면, 세포형태학 및 면역표현형은 암 환자의 혈액 중에 존재하는 과도한 상피 세포가 실제로 암세포임을 제시한다.
전술한 실험은 본 명세서에 개시된 방법으로 조기 종양 환자의 혈액 중의 암세포를 검출할 수 있음을 제시한다. 실제로, 본 발명자들은 기관 한정된 질병(조기 단계의 암)이 있는 것으로 임상적으로 확인된 27명의 환자 중 25명에서 혈중 암세포의 존재를 확인하였다. 이것은 정상적으로는 더 늦게 검출되는(109-1010종양 세포) 고형 종양에서 휠씬 일찍 암세포가 검출됨을 의미한다. 또한, 이 시험으로 유방암, 전립선암 및 결정암을 조기에, 아마도 종래의 수단에 의해 원발 종양을 검출하기 전에, 검출할 수 있다. 전립선에 대한 혈중 종양 세포의 기관 기원은, 항-전립선 특이적 막 항원(PMSA), 항-PSA(전립선 특이적 항원) 또는 남성 피험체의 전립선에 특이적인 기타 항체로 염색하여 정할 수 있다. 여성 환자의 유방암종의 경우, 항-맘모글로빈, 항-프로게스테론 수용체, 항-에스트로겐 수용체 및 항-유지방 글로불린 항원 I 및 II로 염색되는 것은 종양이 유방 기원임을 나타낸다.
본 발명자들의 시험은 기타 기관, 예컨대 췌장, 식도, 결장, 위, 폐, 난소, 신장 등으로부터 유래한 암종 세포를 검출한다. 다음 표는 유방 및 전립선 이외의 암종을 갖는 일부 환자에게 과도한 상피 세포가 관찰된 예를 보여준다.
혈액 20 ㎖당 세포수 암 진단
8 자궁 선암(1B기)
11 두부 및 경부 선암
15 폐 소세포미분화됨
14 경부 편평 세포 암종
상기 표에 개시된 각 암종은, 상응하는 항체가 순환 종양 세포의 기관 기원을 결정하는 데 사용될 수 있는 조직 특이적 항원을 발현한다.
도 14는 원발 종양 세포의 전이암으로의 진행을 보여주는 과정을 도시한 도면이다. 본 발명의 혈액 시험은, 이전에 성공적으로 암 치료를 받았고 현재 장기간동안 완전한 완화기에 있는 환자의 암 세포를 검출하는 데 사용될 수 있다. 실제로 순환 상피 세포, 즉 휴면 종양 세포가, 5년 이상 치료를 받은 적이 있고 임상적으로 종양이 없는 것으로 보이는 환자에서 발견되었다. 이것은, 분명히 성공적으로 치료된 지 수년, 심지어 수십년이 지난 후에 환자에서 재발이 일어날 수 있는 이유를 설명해준다. 실제로, 축적된 증거에 따르면 유방암은 유방절제술 약 10∼12년 후에 느린 꾸준한 속도로 재발한다는 것이 확인된다.
실시예 9
높은 PSA 수준의 환자의 혈중 종양 세포의 검출 및 음성 생검
전술한 실시예에 제시된 바와 같이, 현재 무증상인 환자의 암을 진단하는 데 본 발명을 사용하는 것이 유리하다. 이점을 예시하기 위해서, PSA 수준이 높은(> 12 ㎍/㎖) 2년 병력의 환자에서 전립선의 바늘 생검을 2주간 실시한 뒤 후술하는 바와 같이 분석하였다. 생검 결과 악성의 존재를 밝히지 못하였다. 18개월 이전에 실시된 이전의 생검 결과는 음성이었다는 것은 주목할 만하다.
20 ㎖ 혈액 샘플을 얻기 전에, 혈중 종양 세포의 발생을 증가시킬 목적으로 확대된 전립선의 가벼운 마사지와 손가락 직장 검사를 실시하였다. 본 발명의 방법을 사용하여 혈액 샘플을 농축시켰다. Wrights-Giemsa 염색을 이용하여 현미경으로 농축된 분획을 검사하였다. 분리된 세포의 형태학적 검사로 악성 특성을 밝혀냈다. 이 환자는 암이 있는 것이 확실하였다. 높은 PSA 수준이 관찰되는 것으로서, 전립선암으로 진단할 수 있을 것 같다. 본 명세서에 개시된 적절한 시약을 사용하여 세포 기원을 결정할 수 있다. 본 실시예에 제시된 결과는 본 발명의 방법을 사용하여검출되지 않았을 암을 검출할 수 있음을 제시한다.
혈액 시험의 감도를 증가시킬 수단으로서 종양 세포의 혈액 중으로의 탈락을 촉진하는 국부 맛사지를 사용하는 개념은 상당한 잇점이 있다. 분리 후에, 이러한 방법으로 순환계로 방출된 세포는 각종 상이한 목적으로 사용될 수 있다. 자성 유체로 분리한 세포의 경우, 분리된 세포를 쉽게 배양 및/또는 클로닝할 수 있다. 생성된 세포주를 이용하여 화학요법 감도 및 성장 인자 의존성과 같은 각종 악성 세포 특성을 평가할 수 있다.
실시예 10
분리된 순환 종양 세포에서의 생화학적 변화의 모니터링
암의 형성 과정에서 종양 세포의 유전자 불안정성은 경시적으로 종양 세포의 우세한 표현형의 변화를 초래할 수 있는 선택적인 성장 잇점을 갖는 새로운 클론을 산출한다. 이의 일례는 HER-2(c-erbB2) 원발-종양유전자(proto-oncogene)의 증폭으로서, 암호화된 상피 세포 성장 인자 경막 단백질 수용체의 과발현을 초래한다. 이 연구의 목적은 HER-2 수용체가 환자의 혈액 중 순환 종양 세포(CTC) 상에서 정량될 수 있는지 여부와 HER-2 발현 패턴이 치료 과정에서 변화되는 지 여부를 결정하는 것이었다. 이 정보로 임상의들은 저렴한 비용의 새로운 표적 지향적 치료 결과를 예측할 수 있게 된다. HER-2가 본 명세서에 예시되어 있지만, 종양 세포 상의 또는 그 내부의 추가의 종양 소인 관련 분자를 동일한 방식으로 동정 및 평가하는 것도 매우 바람직하다. 순환 종양 세포의 분리 후에 평가할 수 있는 적절한 종양 소인 관련 분자는 표 XI에 제시되어 있다. 악성과 관련된 핵산 또는 폴리펩티드/단백질과 같은 종양 소인 관련 분자의 변화를 검출하는 예시적 방법으로는 하기 (a) 내지 (e)가 있다.
a) 샘플 중 소정의 핵산 서열과 상응하는 야생형 핵산 서열을 비교하여 환자로부터 얻은 샘플이 돌연변이를 포함하는 지를 결정하는 방법; 또는
b) 환자의 샘플 중에 종양 소인 관련 분자 폴리펩티드의 존재를 결정하고, 만약 존재한다면, 폴리펩티드가 전길이인지 및/또는 돌연변이되는지 및/또는 정상 수준으로 발현되는지를 결정하는 방법; 또는
c) DNA 제한 맵핑을 이용하여, 환자 유래의 종양 소인 관련 분자 핵산 샘플을 제한 효소가 절단할 때 생기는 제한 패턴을 동족 정상 유전자 또는 이의 공지된 돌연변이로부터 얻은 제한 패턴과 비교하는 방법; 또는
d) 종양 소인 관련 분자 핵산 서열(정상 서열 또는 공지된 돌연변이 서열)에 결합할 수 있는 특이적 결합 구성원을 사용하는 방법[여기서 특이적 결합 구성원은 천연 또는 돌연변이된 핵산 서열 또는 이것이 암호화하는 폴리펩티드에 대한 특이성을 갖는 항체 도메인을 포함하는 서열 또는 물질과 하이브리드화가능한 핵산을 포함하고, 특이적 결합 구성원의 이의 결합 파트너에 대한 결합이 검출하능하도록 특이적 결합 구성원이 표지됨]; 또는
e) 정상 또는 돌연변이된 유전자 서열을 기준으로 한 하나 이상의 프라이머를 포함하는 PCR을 이용하여, 환자로부터 얻은 샘플 중 정상 또는 돌연변이 유전자 서열을 스크리닝하는 방법.
암호 핵산의 결실 또는 점 돌연변이로부터 생기는 단백질 분자의 변형은 당업자에게 공지된 통상의 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 이러한 방법으로는 겔 전기영동, 웨스턴 블롯팅, HPLC 및 FPLC 등이 있다. 악성과 관련된 핵산 분자의 변형도 종래의 방법으로 평가할 수 있다.
막 당단백질 상에 존재하는 탄수화물 부분의 변형도 평가할 수 있다. 당접합체와 그 위의 당을 분석하는 프로토콜은 상기 Ausubel 등의 문헌 17장에 개시되어 있다.
본 발명의 방법에서, 수술로 절제한 원발 종양 조직을 유한수의 유전자 및/또는 단백질의 발현에 대해 평가한다. 예로서 유방암을 이용하는 경우, 이러한 종양 소인 관련 분자는 HER-2, 에스트로겐 및 프로게스테론에 대한 수용체를 포함할 수 있다. 처음 진단 후에 종양 세포의 표현형 변화가 흔히 발생하기 때문에 질병이 진행되면서 문제가 발생하고, 치료가 실패한 후에 치료에 대한 내성이 생기는 것으로 추정할 수 있다. 치료 전과 그 과정에서 CTC 상의 표적 종양 소인 관련 분자의 존재를 평가하는 것이 종양의 실시간 "전 항체" 생검을 구성한다. 이러한 목표를 염두에 두고, CTC를 계수하고 종양 세포 상 또는 그 내에 존재하는 종양 소인 관련 분자의 발현을 정량 및 특성화할 수 있는 분석을 개발하였다. 본 발명자들은 본 실시예에서 전이 유방암종 환자의 혈액으로부터 유래한 CTC 상의 HER-2 발현 변화를 개시한다.
하기 재료 및 방법은 실시예 10의 실시를 용이하게 하기 위해서 제공된 것이다.
환자 군
본 연구는 조지타운 유니버시티의 롬바디 암 센터에서 실시하였다. 이 연구에 참여한 환자는 치료 중 CTC 변동을 모니터링하는 시험 연구에 등록된 III기 또는 전이 유방암 여성 24명의 더 큰 그룹으로부터 선택하였다(Walker et al. Proc. Am Soc. Clin. Onc. (2001) 19-54b). 원발 조직 블록을 얻을 수 있는 19명의 환자를 이 연구에 포함시켰다. 모든 환자는 측정가능한 질병을 갖고 있었으며, 신(neo) 보조제 화학요법을 개시하기 시작한 새로이 진단 받은 III기 환자이거나 또는 신규 내분비, 화학 또는 실험 요법을 시작한 서류로 입증된 진행성 전이 유방암 환자였다. 치료법의 선택은 치료 의사에게 일임하였다. 치료 의사도 환자도 CTC 분석 결과는 알지 못하였다. 대조군으로서 22명의 질병이 없는 21세 이상의 여성으로부터 혈액 견본을 채취하였다. 프로토콜은 IRB 승인을 받았다. 환자와 정상 대조군 피험체로부터 각각 정보로 이용할 것을 승낙 또는 허가 받았다.
임상 평가
가능하다면, 2회의 사전 등록 평가를 실시하였다. 제1 평가는 연구 시작 4주 내에, 제2 평가(기준)는 치료 개시 직전에 실시하였다. 현재의 의학 병력을 알아내고, 종양학자가 신체 검사를 실시하였다. 혈액학 분석은 특이 형태의 CBC 및 혈소판 계수; 생화학, 예컨대 뇨 분석, BUN, GOT, GPT, LDH, 크레아틴, 알칼리 포스파타제, 및 총/직접 빌리루빈을 포함하였다. 종양 평가는 물리적 측정(캘리퍼 또는 룰러) 및/또는 화상 연구(CT 스캔, MRI, 뼈 검사 등)를 기초로 한다. 요법에 대한 반응 평가는 유니온 인터내셔날 콘트라 캔서(UICC) 기준을 이용하여 정하였고(Monfardini et al. eds. UICC- Manual of Adult and Pediatric MedicalOncology, Berlin, Germany, Springer 1987, p22-38), CTC/CTC HER-2 결과를 모르는 상태에서 실시하였다. 채혈 시기 및 임상 상태의 평가는 개개의 처리 프로토콜에 따라 다르게 하였다. 모든 혈액 샘플은 10 ㎖ ACD Vacutainer 튜브(미국 뉴저지주 벡톤 디킨슨 소재)에 취하고, 실온에서 유지한 다음, 밤새 이뮤니콘으로 이송하였다. 수거 24시간 내에 샘플을 처리하였다.
HER-2 염색 조직 블록
환자의 원발 종양으로부터 얻은 조직 블록을 수거하고, 파라핀 포매된 조직 절편으로부터 슬라이드를 제조하였다. 제조자의 지시에 따라서 HercepTest(등록상표)(DAKO, 미국 캘리포니아주 카핀테리아 소재)를 사용하여 HER-2 발현에 대해 슬라이드를 평가하였다. 1명의 병리학자가 양성 및 음성 슬라이드를 검사하고, 제조자의 지침에 따라서 0 내지 3+ 등급을 사용하여 기록하였다.
샘플 조제
혈액 5 ㎖를 내경이 17 mm인 1회용 튜브(미국 피셔 사이언티픽)에 옮기고, 파열될 때까지 10분간 800 g로 원심분리하였다. 소 혈청 알부민을 포함하는 인산염 완충된 염수(PBS)를 첨가하여 부피를 10 ㎖로 하고 역전시켜 샘플을 혼합하였다. 전술한 바와 같이, 상피 세포 유착 분자(EpCAM)에 특이적인 모노클론 항체(Mab)는 상피 세포 기원의 조직과 광범위하게 반응한다. Mab VU-1D9는 EpCAM을 인식하고, 자기 나노입자(자성 유체, 미국 펜실베니아주 헌팅돈 벨리에 소재하는 이뮤니콘)에 커플링시켰다. EpCAM+세포의 "자기 적재량"을 증가시키고 세포 표면에서의 EpCAM밀도 차이로 인한 포집 효율의 변화를 감소시키기 위해서, 데스티오비오틴을 EpCAM 표지된 자기 나노입자에 커플링시켜 전술한 실시예에 개시된 바와 같은 CA-EpCAM을 형성하였다. CA-EpCAM 자성 유체와 스트렙타비딘을 함유하는 완충액을 샘플에 첨가하여 세포의 자기 표지를 증가시켰다. 이어서 CA-EpCAM 자성 유체 상의 데스티오비오틴을 후술하는 투과성 완충액 중에 함유되어 있는 비오틴으로 대체하여 CA-EpCAM과 자성 유체 사이의 가교 결합을 가역적으로 한다. 즉시 샘플을 4개의 반대 자력으로 구성된 자기 분리기에 10분간 배치하였다(QMS 17, 미국 펜실베니아주 헌팅돈 벨리에 소재하는 이뮤니콘). 10분 후에, 튜브를 분리기로부터 분리하여, 5회 전도시키고, 10분 더 자기 분리기에 두었다. 이 단계를 1회 더 반복하고 튜브를 20분간 분리기에 두었다. 분리 후에, 상청액을 흡입하여 버렸다. 튜브를 자기 분리기로부터 분리하여 용기의 벽면에 수거된 분획을 BSA 함유 PBS 3 ㎖ 중에 재현탁시켰다. 현탁액을 10분간 자기 분리기에 두고 상청액을 흡입하여 버렸다. Mab-플우로로크롬 접합체를 포화 농도로 첨가한 비오틴 함유 투과성 완충액(Immuniperm, 이뮤니콘 코포레이션) 200 ㎕ 중에 세포를 재현탁시켰다. Mab는 피코에리트린(PE) 접합된 항-시토케라틴 Mab C11을 인식하는 케라틴 4, 6, 8, 10, 13 및 18(이뮤니콘 코포레이션), 페리디닌 클로로필 단백질(Per-CP) 표지된 항-CD45(H1e-1, 미국 캘리포니아주 샌어제이의 BDIS) 및 시아닌 5(CY5) 표지된 항-HER-2로 구성되었다. HER-81로 명명한 Mab 항-HER-2는 HER-2의 세포외 도메인 상의 에피토프를 인식하고, 트라스투주맵(trastuzumab) 또는 이의 쥐 어버이 4D5를 교차 블록킹하지 않는다. 이것은BT474 유방암종 세포 상의 Kd가 10-10M인 쥐 IgG1κ였다. 15분간 Mab와 세포를 항온처리한 후에 2 ㎖의 세포 완충액(PBS, 1% BSA, 50 mM EDTA)을 첨가하고 세포 현탁액을 10분간 자기력으로 분리하였다. 비분리된 현탁액을 버린 후에, 프로카운트 시스템(프로카운트, 미국 캘리포니아주 샌어제이의 BDIS)에 사용된 핵산 염료를 첨가한 PBS 0.5 ㎖ 중에 수거된 세포를 재현탁하였다. 또한, 10,000 형광 계수 비드를 현탁액에 첨가하여 분석된 샘플 부피를 확인하였다(Flow-Set Fluorospheres, 미국 플로리다주 마이애미 소재의 쿨터).
세포주
전립선암 세포주 PC-3과 유방암 세포주 SKBR-3의 세포를 10% FCS가 보충된 10 ㎖ RPMI-1640을 함유하는 플라스크에서 배양하였다. 트립신 처리 후에 플라스크로부터 세포를 수거하고, 세척하고, 재현탁하여 목적하는 세포 농도를 얻었다. 양 세포주에서 HER-2 밀도의 정량 평가를 위해서, PE에 접합된 Mab HER-81(HER-2 PE)로 20,000 세포를 염색하였다. HER-2의 발현 농도를 검정하기 위해서, 약 3,000 세포를 함유하는 세포 현탁액 100 ㎕를 혈액 5 ㎖에 스파이킹하였다.
샘플 분석
488 nm 아르곤 이온 레이저와 635 nm 레이저 다이오드가 구비된 FACSCalibur 유세포분석기(미국 캘리포니아주 샌어제이 소재의 BDIS)에서 샘플을 분석하였다. 핵산 염료의 형광에 대한 역가를 이용하여 CellQuest(미국 캘리포니아주 샌어제이 소재의 BDIS)로 데이타를 얻었다. 샘플의 80% 또는 8000 비드를 분석한 후에 데이타를 얻는 것을 중지하였다. 리스트모드 데이타(Paint-A-GatePro, 미국 캘리포니아주 샌어제이 BIDS)에서 다중변수 데이타 분석을 실시하였다. 분석 기준은 전방 광 산란에 의해 정해지는 크기, 직각 광 산란에 의해 정해지는 과립도, PE-표지된 항-시토케라틴 MAb에 의한 양성 염색 및 PerCP-표지된 항-CD45 Mab에 의한 비염색을 포함하였다. 각 샘플에 대해서, 상피 세포에 대해 전형적인 영역에 존재하는 사건의 수에 보정 인자 1.25를 곱하여 유세포분석으로 분석되지 않는 샘플 부피에 대해 계수하였다. 공지된 수의 플루오로크롬 분자로 피코에리트린(PE)-표지된 비드를 사용하여 세포 상의 HER-2 밀도를 평가하기 위해서 유세포분석기를 조정하였다(QuantiBRITEPE, 미국 캘리포니아주 샌어제이의 BDIS). 유방암 세포주 SKBR-3과 전립선암 세포주 PC-3에서의 HER-2 밀도는, 포화 조건 하에서 PE-항-HER-2로 처리된 세포의 형광 밀도를 측정하여 평가하였다. SKBR-3 및 PC-3 세포 상의 HER-2 수용체의 평균 수는 각각 850,000 및 9,500이었다.
CTC 계수
CTC 계수에 필요한 감도를 얻기 위해서, 기법을 조합할 필요가 있다. 먼저, EpCAM에 특이적인 MAb로 코팅된 콜로이드 상자성 입자와 세포를 혼합한 다음 자기 분리하여 혈중 EpCAM+세포가 농축된 샘플을 제조하였다. 샘플 부피와 배경 조혈 세포의 수를 감소시키기 위해서 면역자기 샘플 농축을 실시한다. 그 다음 남은 세포를 PE-항-시토케라틴으로 표지하여 상피 세포를 확인하고, PerCP-항-CD45로 표지하여 백혈구를 확인하고, Cy5-항 HER-2로 표지하여 HER-2의 발현을 측정하며, 핵산염료를 첨가하여 잔여 적혈구, 혈소판 및 기타 비핵화된 "사건"을 제외시켰다. 샘플 제조 중에 자기 분리(즉, 세척)를 이용하여 과량의 표지 시약을 제거하고, 비표적 세포가 잔류하는 것을 줄이고, 세포 현탁액을 목적하는 부피로 하였다. 샘플을 유세포분석으로 분석하여 사건을 2개의 광 산란 및 4개의 형광 변수로 특성화하였다. 패널 15(패널 A-D)는 전이성 유방암종 환자로부터 얻은 혈액 샘플 5 ㎖를 유세포분석한 일례이다. 패널 15A는 PerCP-항-CD45 대 PE-항-시토케라틴의 관계의 표시를 나타내며; 패널 15B는 PE-항-시토케라틴 대 핵산 염료를 도시하며; 패널 15C는 전방 및 직각 방향 산란을 도시하며, 패널 15D는 Cy5-항-HER-2 대 PE-항-시토케라틴을 나타낸다. 비드와 백혈구의 위치가 패널에 제시되어 있으며, 흑색으로 표시되어 있다. 패널 15A, 15B 및 15C에 도시된 게이트는 CTC에 전형적인 영역(CD45-, 시토케라틴+, >4 ㎛, 핵산+)을 제시한다. CTC(강조되어 있는 흑색의 작은 사각형)를 정성하기 위해서 사건은 모두 3개의 영역 내에 속해야 한다. 모든 다른 사건은 파편으로 구성되어 있었고, 회색으로 표시되어 있다. 패널 15D의 점선에 의해 제시되는 바와 같이 CTC가 백혈구 배경 염색을 초과하는 경우 CTC는 HER-2+인 것으로 간주된다. 도면에 제시된 동일한 게이트를 사용하여 본 연구에서의 모든 샘플을 분석하였다. 22 대조군으로부터 취한 혈액 5 ㎖에서, CTC로서 분류된 영역 내에서 피험체당 1.5 ±2.1 사건이 검출되었다. 이들 사건중 HER-2의 발현과 관련된 것은 없었다. 대조적으로, 초기 또는 새로운 계열의 요법을 개시한 측정가능한 질병이 있는 환자로부터 얻은 19개의 혈액 샘플 중 10개에서 5-214 CTC/5 ㎖가 검출되었다.
CTC에서의 HER-2 발현
CTC에서의 HER-2 발현량을 조정하기 위해서 혈액 5 ㎖를 SKBR-3(~850,000 HER-2 수용체) 및 PC-3(~9,500 HER-2 수용체) 세포로 스파이킹하고 CTC 분석을 위해 처리하였다. 시토케라틴 및 CD45 발현의 고유의 프로파일을 기준으로 하여 백혈구, PC-3 및 SKBR-3 세포를 동정하였다. 각 세포군의 Cy5-항-HER-2 염색의 형광 강도는 도 16A에 도시되어 있다. CTC 상에서의 HER-2의 발현량을 4개의 카테고리로 나누었다: (1) 발현 없음[5,000 이하의 수용체(-)], 백혈구의 경우에 전형적임 (2) PC-3의 전형적인 낮은 발현[5,000∼50,000 수용체(+)], (3) 중간 발현[50,000∼500,000 수용체(++)] 및 (4) SKBR-3의 전형적인 고 발현[>500,000 수용체(+++)]. 3명의 유방암 환자로부터 얻은 CTC 상의 시토케라틴과 HER-2의 발현은 도 16B, 16C 및 16D에 도시되어 있다. 패널 16B에 도시된 한자로부터 얻은 대부분의 CTC는 발현된 HER-2의 수준이 낮지만, 일부는 HER-2가 결여되어 있었다. HER-2 발현의 모든 수준이 패널 16C에 예시된 환자의 CTC에서 발견되었다. 패널 16D에 도시된 환자의 CTC는 전혀 또는 낮은 수준으로 HER-2를 발현하는 CTC와 높은 수준으로 HER-2를 발현하는 CTC로 나뉘는 것으로 보인다. 모든 경우에, 높은 수준으로 HER-2를 발현하는 CTC는 시토케라틴을 비교적 낮은 수준으로 발현하였다. 표 XI은 치료 양상, 치료에 대한 반응, 원발 조직에서의 HER-2 발현, 조직 생검과 CTC 평가 간의 개월 수, 기준시와 치료후의 19명의 유방암 환자로부터 얻은 CTC 그리고 CTC에서의 HER-2의 발현을 제시한다. 진단 시점에서 얻은 원발 종양의 조직 블록을 HER-2 발현에 대해 분석하였다. 진단(종양 생검)과 CTC 측정 간의 시간은 상당히달랐다(표 XI). 19명의 환자 중 7명의 조직 블록은 Herceptest 염색에 의해 HER-2(2+ 또는 3+) 양성이었다. 7명중 6명은 CTC가 검출되었으며, 6명 모두에서 CTC가 HER-2를 발현하였다(표 XII). 1명의 환자에서, CTC는 HER-2를 발현하는 반면, 조직 절편은 그렇지 않았다. HER-2를 발현하는 CTC의 비율(%)과 CTC의 표면에서의 HER-2의 밀도는 상당히 달랐다.
Pt# = 환자 번호.
반응 카테고리: P = 진행됨, R = 완전 또는 부분 반응, S = 안정.
Rx = 치료: Do = 독소루비신, Cy = 시클로포스파미드, Flu = 플루옥시메스테론, Go = 고세레린 아세테이트, An = 아나스트로졸, Exe = 엑세메스탄, Meg = 메게스트롤 아세테이트, Tam = 타목시펜, Cap = 카페시타빈, Ta = 파클리탁셀, Tr = 트라스투주맵;
시간(개월) 조직/CTC = 조직 생검과 CTC 평가 간의 개월수.
CTC: - = < 5 CTC/5 ㎖ 혈액; + = 5∼10 CTC/5 ㎖ 혈액; ++ = 10∼100 CTC/5 ㎖ 혈액; +++ = 100∼1000 CTC/5 ㎖ 혈액.
CTC 상의 HER-2 : - = <25%의 CTC가 HER-2를 발현함; + = 25∼50%의 CTC가 HER-2를 발현함; ++ = 50∼75%의 CTC가 HER-2를 발현함; +++ 75∼100%의 CTC가 HER-2를 발현함; na = CTC가 검출되지 않아 적용할 수 없음.
검토를 목적으로 HER-2를 발현하는 CTC의 비율(%)로서 HER-2 발현을 분류하였다. 이후 도면에서 4개의 상이한 밀도에서의 CTC의 실제 수는 상이한 시점에서 나타낸 것이다.
치료 과정에서 CTC의 계수 및 CTC에서의 HER-2의 발현
8명의 환자는 진행성을, 4명은 안정한 질병을 갖고, 그리고 7명은 요법에 반응하였다(표 XI). 3명의 환자에서는 치료 개시시 CTC에서 HER-2 발현이 검출되지 않았다. 3명의 환자를 모니터링한 시간 동안 이들은 모두 질병 진행을 나타내었다. 후속 측정 과정에서, CTC가 증가하였고 일정 비율의 CTC가 HER-2를 발현하였다(표 XI). 도 17은 치료 전과 그 과정중 3명의 환자에서 검출된 CTC의 수를 나타낸다. 화살표는 치료 시기를 제시한다. HER-2가 결여되거나(0) 또는 저(+), 중간(++) 또는 고(+++) 수준의 HER-2를 발현하는 CTC의 수는 막대로 표시되어 있다.
질병 진행을 나타내는 3명의 환자에서 HER-2()는 기준선 CTC로 존재하며 HER-2를 발현하는 CTC의 비율은 명백한 변화를 나타내지 않았다(도 18). 도 18A 및 도 18B에서 도시된 환자의 치료 과정에서 CTC는 서서히 증가하였다. 패널 18C에 도시된 환자의 혈중 CTC는 실질적으로 낮았으며, 치료 과정에서 증가하지 않았다. 추적 과정에서 안정한 질병을 갖는 또 다른 3명의 환자의 치료 전, 과정 및 후에 검출된 CTC의 수는 도 19에 도시되어 있다. 도 19A에 도시된 환자의 혈중 CTC 수는 증가하는 반면, 다른 2명의 환자의 CTC는 감소하지만 치료 후에도 여전히 검출가능하였다. 중요한 것은 도 19C에 예시된 환자(환자 21)를 트라스투주맵 및 파클리탁셀로 치료하였다는 것이다. CTC 중 98%는 치료 전에 HER-2를 낮은 내지 중간 수준으로 발현하였다. CTC의 수는 치료 개시 4주 후에 214에서 79로 감소하였고, 14%만이 HER-2를 발현하였다. 치료 과정에서 CTC의 수는 계속 감소하였고(23, 13 및 11 CTC), HER-2를 발현하는 CTC의 비율은 각각 78, 100 및 54%로 증가하였다. 환자의 임상 상태(안정한 질병)는 치료 후에 행한 CT와 뼈 검사를 기준으로 한 것지만, CTC의 명백한 감소가 관찰되었다.
논의
HER-2 과발현 유방암 여성의 치료를 위해 최근 승인된 트라스투주맵(Herceptin(등록상표))을, 이 질병 환자를 위해 이용가능한 요법에 중요한 처방으로서 부가하였다(Baselga et al., Proc. Am. Soc. Clin. Onc. (1995)14:103a; Pergram et al., J. Clin. Oncol. (1998) 16:2659-71; Cobleigh et al. J. Clin. Oncol. (1999) 17:2639). 이러한 표적-지향 요법의 개발 및 이용을 위해서는 "실시간"의 정확성, 감성, 특이성 및 신뢰성이 있는 시험관내 진단 분석이 필요하다. 이 분석은 소정의 요법이 유리할 것 같은 환자 아군 뿐 아니라 치료에 대한 내성이 생긴 환자 서브세트도 검출할 수 있어야 한다. 현재 트라스투주맵 요법의 후보는 형광 동일계 하이브리드화(FISH)로 측정되는 바와 같은 HER-2 유전자의 증폭 증거 또는 면역조직화학(종양의 양성 HER-2 염색)에 의한 양성 진단을 필요로 한다. 양 기술의 정확성 및 감성에 관한 논쟁은 별 문제로 하더라도(Lebeau et al., J. Clin. Oncol. (2001) 19:354-363; Kakar et al. Molecular Diagnosis(2000) 5:199-207), 이들 기술은 초기 진단 시점에서부터 질병의 재발 검출 시점까지 종양 표현형의 변화를 검출할 수 없다. 질병의 임상 경과 중에 발생하는 종양 유전자형 및 표현형 변화가 문서로 입증된 바 있으며(Vogelstein et al. N. Engl. J. Med. (1988) 319: 525-532; Pihan et al. Cancer Res. (2001) 61:2212-2219), 비용이 많이 드는 표적 지향 요법을 개시하기 전에 결정해야 한다. 대부분(>75%)의 유방암 전이는 내부(뼈, 간, 폐 등)에 있기 때문에, 일반적인 생검을 얻기 위한 사망 및 비용은 금지된다. 본 실시예에서, 본 발명자들은 혈액으로부터 분리된 상피 세포를 사용하여 종양 소인 관련 분자의 존재를 정량적으로 분석할 수 있다는 것을 발견하였다. 암환자에서 이들 세포의 수가 증가한다는 것이 시사하는 바는, 이들 세포가 종양 세포라는 것이다. 본 명세서에 입증된 바와 같이, 혈중 CTC의 수를 이용하여 종양 진행을 평가할 수 있다. 본 발명자들에 의한 이전의 연구 결과, 해당 일에 몇몇 시점에서 측정한 CTC는 변하지 않는 반면에, 질병이 진행되는 더 오랜 시간 동안 실질적인 증가가 관찰된다는 것이 밝혀졌다. 본 연구에 있어서, III기 및 IV 유방암 환자 19명 중 10명으로부터 얻은 혈액 5 ㎖ 중에서 CTC가 검출되었다. CTC가 검출된 환자의 빈도를 증가시키기 위해서, 더 다량의 혈액 부피와 샘플 제조 절차의 자동화를 이용하여 분석의 감도를 높일 수 있다. HER-2 과다발현 종양 환자로부터 얻은 CTC가 HER-2+라는 관찰 결과는 분석의 근거를 지원한다. 더욱 중요한 것은, 3명의 환자에서 HER-2-에서 HER-2+CTC로의 표현형 전환이 관찰되었다는 사실이다. HER-2 과다발현은 새로운 계열의 치료를 개시하기 전에 CTC에서 검출되지 않았지만, 치료 과정에서 동시에 실질적인 수가 증가되는 CTC 상에서는 검출되었다. HER-2+CTC로의 전환은 더욱 공격적인 표현형으로의 전환을 의미한다. HER-2 발현이 세포 분화와 관련된 세포골격 단백질인 시토케라틴의 발현과 역관계에 있다는 관찰 결과는 이러한 가설을 뒷받침한다(Schaafsma et al. in Rosen, P.P., Fechner, R.E., eds. Pathology Annual vol. 29(1994) pp. 21-62). 따라서, HER-2 발현 변화를 검출하는 능력은 HER-2 표적화된 요법과 화학 요법의 선택 측면에서 임상적으로 중요하다.
요컨대, 본 발명자들은 CTC 수준 변화로 유방암 환자의 임상 상태를 평가할 수 있고, 이들 세포 상의 항원 표적을 정량적으로 평가할 수 있음을 확인하였다. 이 정보는 개개의 환자 질병에 대해 "맞춤형(Tailor)" 치료를 할 수 있는 장점을 갖는다. HER-2가 본 명세서에 예시되어 있지만, 종양 세포가 더욱 악성으로 진행됨에 따라서 많은 다른 종양 소인 관련 분자와 마커의 변화도 일어날 수 있다. 악성과 관련된 변화를 나타내는 분자의 비제한적인 예로는 mdr, 티미딜화 신타제, FSFR, p53, ras 종양유전자, CD146, src, MUC1, uPA, PAI-1, ACT 및 기타 다수의 것이 있다. 염색체 전좌, 주요 세포 시그널링 분자에서의 점 돌연변이 및 암과 관련된 표면 탄수화물 변화는 모두 이전에 개시된 바 있다. 표 XIIa 및 b에는, 임상학자가 평가할 수 있고, 환자의 증상을 더욱 정확하게 진단할 수 있으며, 더욱 중요하게는 치료를 위한 적절한 처치법을 고안할 수 있는 생물학 분자의 목록이 제공되어 있다. 예를 들어, pS2/pNR-2+ 유방암은 환자가 내분비 요법에 반응할 가능성이 있음을 제시한다. 악성 진행 과정에서 종종 변화되고 분리된 순환 종양 세포에서 분석될 수 있는 추가의 종양 소인 관련 분자는 하기에 목록화되어 있다. 이들 목록은 단지 예시적인 것으로서, 제시된 분자에 한정되는 것은 아니다.
치료 표적
호르몬 & 호르몬 조절 단백질안드로겐 수용체카텝신 D에스트로겐 수용체에스트라디올프로게스테론 수용체소마스타틴SRC1 = 스테로이드 수용체 보조활성화제-1종양/억제제 단백질Her-2(cERB-b)EGFRrasc-fosc-junc-mycp53p63nm23 / NDP 키나제PTEN / MMAC1SMAD4 / DPC4Notch-1JAK3세포 주기 & 증식사이클린 A사이클린 B사이클린 C사이클린 D사이클린 EKi67MDR/MRP 단백질
기타 표적PSA전립선 산성 포스포타제CA 125CA 15-3CA 27-29HGC낭종 섬유증 경막 조절인자라미닌 수용체뉴런 특이적 엔올라제(NSE)알파 페토단백질CD99 / MIC2DHEA프로락틴CD66e / CEA필라그린(표피 세포)신장 세포 암종(gp200)TAG72 / CA72-4UPA-수용체(CD87)헤레굴린IPO-38티미딜화 신타제토포이소머라제 Iia글루타티온 S 트랜스퍼라제(GST)폐 내성 관련 단백질/주요 결함 단백질(LRP/MFP)O6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT)
발현 수준의 변화, 대사 작용 및/또는 XIIa 및 b에 제시된 종양 소인 관련 분자에서의 유전자 변형을 분석하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 단백질 발현 수준의 변화는 유세포분석, 레이저 스캐닝 세포분석, 면역세포화학, 셀 트랙 등으로 평가할 수 있다. 점 돌연변이와 같은 유전자 변화는 제한 효소 분해, FISH, PCR 또는 서던 하이브리드화를 이용하여 평가할 수 있다. 당단백질 및 당지질의 글리코실화 변화는 암의 공통적인 특징이며, 아마도 전이를 위해 세포-세포 상호작용을 하거나, 또는 암세포가 면역-감시를 피하도록 하여 암 세포 작용에 영향을 줄 수 있다. 인간 암에서 글리코실화 변형은 면역조직화학법, 질량 분광분석법 및 컬럼 크로마토그래피법을 사용하여 평가할 수 있다.
본 발명의 방법을 실시하기 위한 개략적 프로토콜은 도 20에 제시되어 있다.
실시예 11
암의 각종 측면을 진단하기 위한 테스트 키트
본 발명의 분석을 실시하는 데 사용된 시약을 포함하는 테스트 키트도 본 발명에 사용하는 것이 고려된다. 이러한 키트는 특정 용도로 고안된다. 시약을 조립하여 종양 세포를 비롯한 순환 희귀 세포에 대해 환자를 쉽게 스크리닝할 수 있다. 이러한 구체예에서, 키트는 자기 코어 물질, 단백질 베이스 코팅 물질 및 분리하고자 하는 암세포 상에 존재하는 특성 결정인자에 특이적으로 결합하는 생물특이적 리간드를 포함하는 콜로이드 자기 입자를 포함한다. 키트는 또한 생물특이적 리간드가 인식하는 결정인자와 다른 분리하고자 하는 암 세포 상의 제2의 특성 결정인자에 대한 친화도를 갖는 추가의 생물특이적 시약을 하나 이상 포함한다. 또한, 키트는 비핵화된 세포와 다른 비표적 샘플 성분을 분석으로부터 배제하는 세포 특이적 염료를 포함한다. 예시적 키트는 또한 하나 이상의 종양 소인 관련 분자를 검출하는 시약을 포함한다. 실시예 2에 개시된 바와 같은 셀 스폿터 또는 셀 트랙 카트리지가 키트에 제공된다.
본 발명에 따른 전형적인 키트는 자기 나노입자에 직접 또는 간접 커플링된 항-EpCAM과, 한쌍의 모노클론 항체[이중 제1 항체는 암 특이적 결정인자를 인식하고 제2 항체는 비종양 세포 결정인자, 예컨대 전체 백혈구 항원에 대한 친화도를 갖음]를 포함한다. 하나 이상의 종양 소인 관련 분자를 검출하는 시약도 키트 내에제공된다. 키트는 비핵화된 세포를 분석으로부터 제외하기 위한 핵산 염료를 포함한다. 본 발명의 키트는 경우에 따라 생물학적 완충액, 투과성 완충액, 프로토콜, 분리 용기, 분석 챔버, 양성 세포 또는 적절한 비드 그리고 정보지를 포함할 수 있다.
상기 개시된 키트를 제조하여 순환시 검출되는 특정 암세포의 진단 및 특성화를 용이하게 할 수 있다. 이 구체예에서, 키트는 상기 열거한 모든 항목을 포함하지만, 암 특이적 모노클론 항체의 패널을 포함하는 것이 바람직하다. 예로서 유방암을 이용하면, 진단 키트는 항-MUC-1, 항-에스트로겐, 항-프로게스테론 수용체 항체, 항-CA27.29, 항-CA15.3, 항-카텝신 D, 항-p53, 항-유로키나제형 플라스미노겐 활성화제, 항-표피 성장 인자, 항-표피 성장 인자 수용체, 항-BRCA1, 항-BRCA2, 항-전립선 특이적 항원, 항-플라스미노겐 활성화제 억제제, 항-Her2-neu 항체 또는 이의 서브세트를 포함할 수 있다.
종양의 제거 후에 질병 재발 및/또는 잔여 세포에 대해 환자를 모니터링하기 위한 키트도 제공된다. 이 구체예에서, 암의 종류는 이미 진단받은 상태였다. 따라서, 키트는 암에 대해 생물학적 샘플을 스크리닝하기 위해 이용되는 모든 시약을 포함할 것이며, 또한 환자에서 이전에 진단된 유형의 암에 특이적인 추가의 항체를 포함한다. 또 예로서 유방암을 이용하면, 그러한 키트는 항-MUC-1을 포함할 수 있다. 대안적으로, 키트는 항-Her2-neu를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 각종 상이한 암의 종류를 스크리닝, 진단 또는 모니터링하기 위해 주문제작될 수 있다. 예를 들어, 키트를 이용하여 전립선암을 검출하는 경우, 키트 내에 포함된 항체 또는 상보 핵산은 전립선 조직 내에 존재하는 표적 분자에 특이적일 것이다. 이러한 목적으로 적절한 항체 또는 마커로는 항-전립선 특이적 항원, 유리 PSA, 전립선 산성 포스파타제, 크레아틴 키나제, 티모신 b-15, p53, HPC1 염기성 전립선 유전자 및 전립선 특이적 막 항원 등이 있다. 결장암의 존재에 대해 환자를 스크리닝하는 경우, 암성배아 항원(CEA)에 특이적인 항체를 키트 내에 포함시킬 수 있다. 방광암 환자를 스크리닝하는 데 이용된 키트는 핵 기질 단백질(NMP22), 바르드(Bard) 방광 종양 항원(BTA) 또는 피브린 분해 산물(FDP)에 대한 항체를 포함할 수 있다. 여러 상이한 암 종류에 대한 마커 및 종양 소인 관련 분자가 공지되어 있다.
본 발명의 키트를 사용하여 분리한 세포를 형태학, 기원 기관과 관련된 RNA, 표면 및 세포내 단백질, 특히 악성과 관련된 것들에 대해 추가로 연구할 수 있다. 이러한 분자에 대한 기존의 정보를 기초로, 분리된 세포 상에서의 이들 분자의 발현으로부터 순환 세포의 분석을 통한 종양의 전이 가능성을 결정할 수 있어야 한다.
본 발명의 목적은 특이적 마커가 공지된 임의의 암에 대한 키트를 제공하는 것이다. 종양 소인 관련 분자와 유용성 및/또는 지시를 요약한 목록은 다음과 같다:
I. 종양 기원의 지시자
Muc-1유방
PSA, PSMA전립선
CEA결장
CYPRA 21-1폐
CA 125난소
시토케라틴목록 참조
항-HI67
II. 세포 주기
핵산 염료
사이클린 A, C 및 E
p27
III. 세포 생존성/아폽토시스
bax
Bcl-2
카스파제 7
카스파제 8
카스파제 9
Fas (CD95)
시토크롬 c
아멕신 V
항-메탈로프로테인아제
IV 약물 민감성
에스트로겐, 프로게스테론 & 안드로겐 수용체
HER-2/neu
V. 약물 내성
P-당단백질(MDR)
t-글루타밀시스테인 신타제
탁솔-내성-관련 유전자-1-5
시스-디아민디클로로백금 II 내성 유전자
티미딜화 신테타제
단백질 키나제 C
텔로머라제
VI. 시기결정(staging)
루이스 A
C
BRCA-1 BRCA-2
CA15.3 (Muc-1), CA 27.29, CA 19.9
LASA
p53
카텝신 D
ras 종양유전자
하기 표는 본 발명의 방법을 사용하여 분리한 세포의 조직 기원을 평가하는 데 사용될 수 있는 상이한 시토케라틴 마커를 제공한다.
[표 XIIIa]
다음은 순환 유방암 세포를 검출하는 데 사용하기 위한 키트가 본 발명의 방법의 실시를 얼마나 용이하게 하는 지를 입증한다:
전술한 바와 같이, 전혈로부터 종양 세포를 농축하는 시약, 장치 및 방법으로 키트를 개시한다. 유방암 세포를 검출하는 예시적 키트는 6개의 인자 또는 지시자를 평가하는 것을 포함한다. 분석 플랫폼은 리포터 분자 DAPi, CY2, CY3, CY3.5,CY5 및 CY5.5가 적절한 자극 및 방출 필터로 구별될 수 있도록 형성되어야 한다. 본 실시예에서 분석 플랫폼은 수은 아크 램프가 구비된 형광 현미경과, 사용된 검출 표지의 파장을 평가하기 위한 적절한 필터 세트를 사용한다. 이 방법을 이용하여 한번에 모든 마커를 도입한다. UV 광으로 여기되는 DAPi는 핵산을 염색하며, 세포의 핵 형태를 결정하는 데 사용된다. CY2로 표지된 CAM 5.2는 대조군 세포를 염색하는 데 사용된다. CY3 표지된 α-시토케라틴을 사용하여 시토케라틴 7, 8, 18 및 19를 표지한다. CY3.5로 접합된 항체를 사용하여 HER-2/neu를 표지한다. CY5에 접합된 항체를 사용하여 Muc-1을 표지한다. CY5.5에 접합된 항체를 사용하여 에스트로겐 수용체를 표지한다. 적절한 여기 및 방출 필터를 사용하여 암세포를 동정한다. 또한, 셀 트랙 또는 셀 스폿터(등록상표) 카트리지를 사용하는 것도 개시된 본 발명에 포함된다.
본 발명의 조성물, 방법 및 키트를 사용하여 검출할 수 있는 암의 다른 종류의 예로는 아푸도마, 이소종, 인두종(branchioma), 악성 유암종 증후군, 유암종 심질환, 암종, 예컨대 워커(Walker), 기저 세포, 기저 편평, 브라운-피어스(Brown-Pearce), 관, 에르리히 종양, 정위치, 크렙 2, 촉각(Merkel) 세포, 점액, 비소세포 폐, 귀리 세포, 유두, 굳은암종, 세기관지, 기관지원, 편평 세포 및 이행세포 세망내피증, 흑색종, 연골모세포종, 연골종, 연골육종, 섬유종, 섬유육종, 거대 세포 종양, 조직구종, 지방종, 지방육종, 중피종, 점액종, 점액육종, 골종, 골육종, 에윙(Ewing) 육종, 윤활막종, 선섬유종, 선림프종, 암육종, 척삭종, 중간엽종, 중간콩팥종, 근육종, 사기질모세포종, 시멘트종, 치아종, 기형종, 영양막 종양, 선암종, 선종, 담관암, 진주종, 원주종, 낭선암종, 낭선종, 과립세포 종양, 음양모세포종, 간암, 땀샘종, 도 세포 종양, 라이디히(leydig) 세포 종양, 유두종, 버팀 세포 종양, 막 세포 종양, 평활근종, 평활근육종, 근육모세포종, 근종, 근육종, 횡문근종, 횡문근육종, 뇌실막세포종, 신경절신경종, 신경아교종, 속질모세포종, 수막종, 신경집종, 신경모세포종, 신경상피종, 신경섬유종, 신경종, 부신경절종, 부신경절정 논크로마핀(nonchromaffin), 안티오케라토마(antiokeratoma), 맥관종, 경화, 혈관종증, 사구맥관종, 혈관내피종, 혈관종, 혈관주위세포종, 혈관육종, 림프관종, 림프관근종, 림프관육종, 솔방울선종, 암육종, 연골육종 엽상, 섬유육종, 혈관육종, 평활근육종, 백혈구육종, 지방육종, 림프관육종, 근육종, 점액육종, 난소암, 횡문근육종, 육종(카포시 육종 및 비만 세포), 신생물(예, 뼈, 소화계, 직장결장, 간, 췌장, 뇌하수체, 고환, 안와, 두부 및 경부, 중추신경계, 청각, 골반, 기도 및 비뇨생식), 신경섬유종증 및 자궁경부 형성이상 등이 있다.
본 발명을 오직 순환 상피 세포의 검출에 한정되는 것은 아니다. 심근 경색 환자의 혈액에서 내피 세포가 관찰된 바 있다. 내피 세포, 심근 세포 및 바이러스 감염된 세포, 예컨대 상피 세포는 이용가능한 모노클론 항체가 인식하는 세포 유형 특이적 결정인자를 갖는다. 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 이러한 순환 내피 세포를 검출하는 데 적용할 수 있다. 또한, 본 발명으로 감염성 질병을 보유한 환자의 말초혈에서 박테리아 세포 적재량을 검출할 수 있으며, 상기 환자는 본 발명의 조성물, 방법 및 키트를 사용하여 평가할 수 있다.
일부 기관지 논문, 미국 특허 및 미국 특허 출원이 상기에 인용되어 있다.전술한 각 인용물의 내용은 본 명세서에 개시된 것과 같이 본 명세서에서 참고로 인용한다.
본 발명의 바람직한 일부 구체예들이 상기에 개시되고 구체적으로 예시되었지만, 본 발명을 이들 구체예들에 한정하려는 것은 아니다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 각종 변형을 가할 수 있으며, 본 발명의 전체 범위는 하기 청구 범위에 개시되어 있다.

Claims (83)

  1. a) 조혈 및 비조혈 악성 세포를 함유할 것으로 의심되는 혼합 세포군을 포함하는 생물학적 표본을 환자로부터 얻는 단계;
    b) 다른 샘플 성분이 실질적으로 배제되도록, 악성 세포와 특이적으로 반응하는 검출가능하게 표지된 리간드와 상기 생물학적 표본이 혼합된 샘플을 제조하는 단계;
    c) 상기 악성 세포를 특이적으로 표지하는 하나 이상의 시약과 샘플을 접촉시키는 단계;
    d) 샘플을 분석하여 표지된 세포의 존재 및 수를 측정하는 단계[상기 세포의 검출은 악성의 존재를 나타내고, 존재하는 세포의 수가 많을 수록 악성의 심각도가 큼]를 포함하는 악성의 존재에 대해 환자를 평가하는 방법으로서, 상기 표지된 세포를 하나 이상의 종양 소인 관련 분자의 변화에 대해 평가하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 c)와 단계 d) 사이의 중간 단계로서, 조혈 세포를 검출가능하게 표지하는 시약과 샘플을 접촉시키는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 종양 소인 관련 분자의 평가는 상기 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 검출가능하게 표지된 제제와 상기 분자를 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 리간드는 제1 검출가능한 표지에 커플링되고, 상기 시약은 제2 검출가능한 표지에 커플링되며, 상기 조혈 세포는 제3 검출가능한 표지로 표지되고, 상기 종양 소인 관련 분자는 제4 검출가능한 표지에 커플링된 시약과 접촉되며, 상기 제1, 제2, 제3 및 제4의 검출가능한 표지는 상이한 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 표지된 악성 세포는 다중변수 유세포분석, 면역형광 현미경 검사, 레이저 주사 세포측정, 명시야 베이스 화상 분석, 모세량 측정법, 스펙트럼 화상 분석 매뉴얼 세포 분석, 셀 스폿터(Cell Spotter(등록상표)), 셀트랙(Cell Tracks) 분석 및 자동화된 세포 분석으로 구성된 군에서 선택된 공정으로 분석되는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 방법을 적용하여 상기 생물학적 표본 내의 잔여 암 세포를 검출 및 계수하고, 하나 이상의 종양 제거 절차 후에 하나 이상의 소정의 종양 소인 관련 분자 변화에 대해 상기 세포를 추가로 분석하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 표본을 상기 환자로부터 주기적으로 얻고 순환 암세포의 존재 및 수에 대해 평가하며, 악성으로의 진행의 지시자로서 하나 이상의 소정의 종양 소인 관련 분자의 변화에 대해 상기 세포를 추가로 분석하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 표지된 악성 세포를 화학요법제와 접촉시켜 이에 대한 민감성을 평가하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 샘플은 상기 리간드에 커플링된 자기 입자와 혼합된 생물학적 표본을 포함하는 면역자기 샘플이며, 상기 면역자기 샘플을 제조하는 단계와 하나 이상의 시약과 면역자기 샘플을 접촉시키는 단계 사이의 중간 단계로서, 상기 면역자기 샘플에 자기장을 가하여 면역자기 샘플로서 농축된 악성 세포 현탁액을 생성하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 농축된 악성 세포를 함유하는 면역자기 샘플의 부피는 본래의 생물학적 표본 부피에 비하여 감소되는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 자기 입자는 콜로이드인 것인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 리간드는 하나 이상의 암 세포 결정인자에 대해 특이적인 모노클론 항체이고, 상기 하나 이상의 시약은 제2의 암세포 결정인자에 대해 특이적인 하나 이상의 추가의 모노클론 항체와 비종양 세포 상에 존재하는 항원에 특이적인 제3 모노클론 항체를 포함하며, 상기 방법은 잔여의 비핵화된 세포 및 세포 파편을 분석으로부터 배제하도록 상기 표지된 암세포 함유 분획에 세포 특이적 염료를 첨가하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 리간드는 악성 세포 상의 상피 세포 유착 분자에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 하나 이상의 시약은 세포내 시토케라틴에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 종양 소인 관련 분자는 표 XIIa 및 XIIb에 개시된 분자 중 하나 이상인 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 변화된 종양 소인 관련 분자는 개개의 세포 상에 존재하는 단백질이고, 셀 스폿터(등록상표) 세포분석, 셀 트랙 세포분석, 면역형광, 질량 분광분석 및 유세포분석으로 구성된 군에서 선택된 방법으로 평가되는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 분리 단계 및 상기 생물학적 표본으로부터 분리된 악성 세포의 배양 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 배양된 악성 세포는 단세포 콜로니로부터 확대되어 상기 악성 세포의 클론군을 형성하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 세포의 클론군을 종양 소인 관련 분자의 변화에 대해 평가하는 것인 방법.
  20. 제17항의 방법으로 얻은 배양된 세포로부터 분리된 악성 세포.
  21. 제20항의 세포 또는 이의 성분을 포함하는 종양 백신.
  22. 제19항의 세포로부터 분리된, 변화된 종양 소인 관련 분자.
  23. 제19항의 변화된 종양 소인 관련 분자 또는 이의 단편을 포함하는 종양 백신.
  24. 제17항에 있어서, 세포를 치료제와 접촉시켜 이에 대한 민감성을 평가하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 배양된 세포 내에 존재하는 단백질 종양 소인 관련 분자는 단백질 겔 전기영동, 컬럼 크로마토그래피, HPLC, FPLC, 면역조직화학, 조직화학 및 웨스턴 블롯팅으로 구성된 군에서 선택된 방법으로 분석되는 것인 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 변화된 종양 소인 관련 분자는 핵산이고, 핵산의 라이브러리 증폭, 폴리머라제 연쇄 반응, 아가로스 겔 전기영동, 서던 블롯팅 및 노던 블롯팅으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 방법으로 평가되는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 라이브러리 증폭은 개개의 세포로부터 분리된 유전 물질에서 실시되고, 상기 증폭된 유전 물질에 대해 유전자 특이적 프로빙을 실시하는 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 라이브러리 증폭은 복수의 악성 세포로부터 분리된 유전 물질에서 실시되고 상기 증폭된 유전 물질에 대해 유전자 특이적 프로빙을 실시하는 것인 방법.
  29. a) 조혈 및 비조혈 악성 세포를 포함하는 혼합 세포군을 포함하는 생물학적 표본을 환자로부터 얻는 단계;
    b) 다른 샘플 성분이 실질적으로 배제되도록, 악성 세포와 특이적으로 반응하는 리간드에 커플링된 자기 입자와 상기 생물학적 표본이 혼합된 면역자기 샘플을 제조하는 단계;
    c) 상기 자기 입자를 포함하는 악성 세포를 비자기 입자 조혈 세포로부터 분리하는 단계; 및
    d) 자기 입자 함유 세포를 분석하여 상기 샘플 중의 임의의 악성 세포의 존재 및 수를 측정하는 단계[상기 세포의 검출은 악성의 존재를 나타내고, 존재하는 세포의 수가 많을 수록 악성의 심각도가 큼]를 포함하는 비조혈 악성의 존재에 대해 환자를 평가하는 방법으로서, 상기 자기 입자를 함유하는 악성 세포를 종양 소인 관련 분자의 변화에 대해 평가하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 변화된 종양 소인 관련 분자는 핵산이고, 핵산의 라이브러리 증폭, 폴리머라제 연쇄 반응, 아가로스 겔 전기영동, 서던 블롯팅 및 노던 블롯팅으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 방법으로 평가되는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 라이브러리 증폭은 개개의 세포로부터 분리된 유전 물질에서 실시되고, 상기 증폭된 유전 물질에 대해 유전자 특이적 프로빙을 실시하는 것인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 라이브러리 증폭은 분리된 모든 악성 세포로부터 분리된 유전 물질에서 실시되고, 상기 증폭된 유전 물질에 대해 유전자 특이적 프로빙을 실시하는 것인 방법.
  33. 제1항에 있어서, 상기 변화된 종양 소인 관련 분자는 탄수화물이고, 질량 분광분석, 렉틴 크로마토그래피, 및 보로네이트 친화도로 구성된 군에서 선택된 방법으로 평가되는 것인 방법.
  34. 제1항에 있어서, 상기 환자는 전립선암, 유방암, 결장암, 방광암, 난소암, 신장암, 두부 및 경부암(head and neck cancer), 췌장암 및 폐암으로 구성된 군에서 선택된 상피 세포 암종으로 진단받은 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 표지된 세포는 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, Her2/neu 및 MUC1으로 구성된 군에서 선택된 종양 소인 관련 분자의 변화에 대해 평가되는 것인 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 표지된 세포는 안드로겐 수용체, PSA, uPA 및 PSMA로 구성된 군에서 선택된 종양 소인 관련 분자의 변화에 대해 평가되는 것인 방법.
  37. 제34항에 있어서, 상기 표지된 세포는 티미딜화 신타제, EGFR, MUC2 및 CEA-15로 구성된 군에서 선택된 종양 소인 관련 분자의 변화에 대해 평가되는 것인 방법.
  38. 제34항에 있어서, 상기 표지된 세포는 CEA-19-3, HCG, MDR 및 MUC1으로 구성된 군에서 선택된 종양 소인 관련 분자의 변화에 대해 평가되는 것인 방법.
  39. 제34항에 있어서, 상기 표지된 세포는 티미딜화 신타제, MDR, Her-2/neu 및 EGFR로 구성된 군에서 선택된 종양 소인 관련 분자의 변화에 대해 평가되는 것인 방법.
  40. 제1항에 있어서, 상기 환자는 I기 암 환자인 것인 방법.
  41. 내용 없음
  42. 제1항에 있어서, 상기 환자는 II기 암 환자인 것인 방법.
  43. 제1항에 있어서, 상기 환자는 III기 암 환자인 것인 방법.
  44. 제1항에 있어서, 상기 환자는 IV기 암 환자인 것인 방법.
  45. 제29항에 있어서, 상기 환자는 전립선암, 유방암, 결장암, 방광암, 난소암, 신장암, 두부 및 경부암, 췌장암 및 폐암으로 구성된 군에서 선택된 상피 유래의 세포 암종으로 진단받은 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 표지된 세포는 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체,Her2/neu 및 MUC1으로 구성된 군에서 선택된 종양 소인 관련 분자의 변화에 대해 평가되는 것인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 표지된 세포는 안드로겐 수용체, PSA, uPA 및 PSMA로 구성된 군에서 선택된 종양 소인 관련 분자의 변화에 대해 평가되는 것인 방법.
  48. 제45항에 있어서, 상기 표지된 세포는 티미딜화 신타제, EGFR, MUC2 및 CEA-15로 구성된 군에서 선택된 종양 소인 관련 분자의 변화에 대해 평가되는 것인 방법.
  49. 제45항에 있어서, 상기 표지된 세포는 CEA-19-3, HCG, MDR 및 MUC1으로 구성된 군에서 선택된 종양 소인 관련 분자의 변화에 대해 평가되는 것인 방법.
  50. 제45항에 있어서, 상기 표지된 세포는 티미딜화 신타제, MDR, Her-2/neu 및 EGFR로 구성된 군에서 선택된 종양 소인 관련 분자의 변화에 대해 평가되는 것인 방법.
  51. 제29항에 있어서, 상기 환자는 I기 암 환자인 것인 방법.
  52. 제29항에 있어서, 상기 환자는 II기 암 환자인 것인 방법.
  53. 제29항에 있어서, 상기 환자는 III기 암 환자인 것인 방법.
  54. 제29항에 있어서, 상기 환자는 IV기 암 환자인 것인 방법.
  55. a) 환자로부터 샘플을 얻는 단계;
    b) 순환 악성 세포가 존재하는 경우, 이를 상기 샘플로부터 분리 및 계수하는 단계를 포함하고,
    c) 치료 효능을 예측할 수단으로서 상기 샘플 중에 존재하는 개개의 세포 상의 하나 이상의 소정의 종양 소인 관련 분자의 수를 측정하는 단계를 더 포함하는, 치료 효능의 예측 수단으로서 종양 소인 관련 분자의 변화를 측정하는 방법.
  56. a) 환자로부터 샘플을 얻는 단계;
    b) 순환 악성 세포가 존재하는 경우, 이를 상기 샘플로부터 분리 및 계수하는 단계를 포함하고,
    c) 치료에 적절한 용량을 평가하는 수단으로서 상기 샘플 중에 존재하는 개개의 세포 상의 하나 이상의 소정의 종양 소인 관련 분자의 수를 측정하는 단계를 더 포함하는, 치료에 적절한 용량의 평가 수단으로서 종양 소인 관련 분자의 변화를 측정하는 방법.
  57. a) 환자로부터 샘플을 얻는 단계;
    b) 순환 악성 세포가 존재하는 경우, 이를 상기 샘플로부터 분리 및 계수하는 단계를 포함하고,
    c) 치료 효능을 모니터링할 수단으로서 상기 샘플 중에 존재하는 개개의 세포 상의 하나 이상의 소정의 종양 소인 관련 분자의 수를 측정하는 단계를 더 포함하는, 치료 효능의 모니터링 수단으로서 종양 소인 관련 분자의 변화를 측정하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 샘플을 치료제 투여 전, 과정 또는 후에 상기 환자로부터 얻는 것인 방법.
  59. 제57항에 있어서, 상기 세포를 분리하고 치료제와 접촉시켜 이에 대한 민감성을 평가하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  60. 제55항에 있어서, 상기 환자는 유방암 환자이고 상기 종양 소인 관련 분자는 Her-2/neu이며 상기 치료는 항-Her-2/neu 항체 또는 이의 단편의 투여인 것인 방법.
  61. 제56항에 있어서, 상기 환자는 유방암 환자이고 상기 종양 소인 관련 분자는 Her-2/neu이며 상기 치료는 항-Her-2/neu 항체 또는 이의 단편의 투여인 것인 방법.
  62. 제57항에 있어서, 상기 환자는 유방암 환자이고 상기 종양 소인 관련 분자는 Her-2/neu이며 상기 치료는 항-Her-2/neu 항체 또는 이의 단편의 투여인 것인 방법.
  63. 제55항에 있어서, 상기 환자는 유방암 환자이고 상기 하나 이상의 종양 소인 관련 분자는 Her-2/neu 및 에스트로겐 수용체를 포함하며 상기 치료는 항-Her-2/neu 항체 또는 이의 단편과 타목시펜의 투여인 것인 방법.
  64. 제56항에 있어서, 상기 환자는 유방암 환자이고 상기 하나 이상의 종양 소인 관련 분자는 Her-2/neu 및 에스트로겐 수용체를 포함하며 상기 치료는 항-Her-2/neu 항체 또는 이의 단편과 타목시펜의 투여인 것인 방법.
  65. 제57항에 있어서, 상기 환자는 유방암 환자이고 상기 하나 이상의 종양 소인 관련 분자는 Her-2/neu 및 에스트로겐 수용체를 포함하며 상기 치료는 항-Her-2/neu 항체 또는 이의 단편과 타목시펜의 투여인 것인 방법.
  66. a) 환자로부터 샘플을 얻는 단계;
    b) 순환 악성 세포가 존재하는 경우, 이를 상기 샘플로부터 분리 및 계수하는 단계를 포함하고,
    c) 암 진행을 평가할 수단으로서 상기 세포가 예후가 좋지 않은 것과 관련된 소정의 종양 소인 관련 분자를 포함하는 지를 결정하는 단계를 더 포함하는, 암 진행의 평가 수단으로서 종양 소인 관련 분자의 변화를 측정하는 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 종양 소인 관련 분자가 변화되고, 안드로겐 수용체, 카텝신 D, 에스트로겐 수용체, 에스트라디올, 프로게스테론 수용체, 소마스타틴, 스테로이드 수용체 보조활성화제-1(SRC1), Her-2(cERB-b), EGFR, ras, c-fos, c-jun, c-myc, p53, p63, nm23 / NDP 키나제, PTEN / MMAC1, SMAD4 / DPC4, Notch-1, JAK3, 사이클린 A, 사이클린 B, 사이클린 C, 사이클린 D, 사이클린 E, Ki67, MDR/MRP 단백질, PSA, 전립선 산성 포스포타제, CA 125, CA 15-3, CA 27-29, HGC, 낭종 섬유증 경막 조절인자, 라미닌 수용체, 뉴런 특이적 엔올라제(NSE), 알파 페토단백질, CD99 / MIC2, DHEA, 프로락틴, CD66e / CEA, 필라그린, gp200 TAG72 / CA72-4, UPA-수용체(CD87), 헤레굴린, IPO-38, 티미딜화 신타제, 토포이소머라제 Iia, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 폐 내성 관련 단백질/주요 결함 단백질(LRP/MFP), 및 O6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT)로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  68. 제66항에 있어서, 상기 종양 소인 관련 분자는 야생형 발현에 비하여 비정상적으로 발현되고, 안드로겐 수용체, 카텝신 D, 에스트로겐 수용체, 에스트라디올,프로게스테론 수용체, 소마스타틴, 스테로이드 수용체 보조활성화제-1(SRC1), Her-2(cERB-b), EGFR, ras, c-fos, c-jun, c-myc, p53, p63, nm23 / NDP 키나제, PTEN / MMAC1, SMAD4 / DPC4, Notch-1, JAK3, 사이클린 A, 사이클린 B, 사이클린 C, 사이클린 D, 사이클린 E, Ki67, MDR/MRP 단백질, PSA, 전립선 산성 포스포타제, CA 125, CA 15-3, CA 27-29, HGC, 낭종 섬유증 경막 조절인자, 라미닌 수용체, 뉴런 특이적 엔올라제(NSE), 알파 페토단백질, CD99 / MIC2, DHEA, 프로락틴, CD66e / CEA, 필라그린, gp200 TAG72 / CA72-4, UPA-수용체(CD87), 헤레굴린, IPO-38, 티미딜화 신타제, 토포이소머라제 Iia, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 폐 내성 관련 단백질/주요 결함 단백질(LRP/MFP), 및 O6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT)로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  69. 제67항에 있어서, 상기 종양 소인 관련 분자는 핵산인 것인 방법.
  70. 제68항에 있어서, 상기 종양 소인 관련 분자는 핵산인 것인 방법.
  71. 제67항에 있어서, 상기 종양 소인 관련 분자는 단백질인 것인 방법.
  72. 제68항에 있어서, 상기 종양 소인 관련 분자는 단백질인 것인 방법.
  73. a) 환자로부터 혈액 샘플을 얻는 단계;
    b) 순환 비조혈 악성 세포가 존재하는 경우, 이를 샘플로부터 분리 및 계수하는 단계를 포함하고,
    c) 소정의 종양 소인 관련 분자의 패널의 존재 및 수에 대해 상기 세포를 분석하는 단계를 더 포함하는, 환자에서 전혈 생검을 실시하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 종양 소인 관련 분자는 안드로겐 수용체, 카텝신 D, 에스트로겐 수용체, 에스트라디올, 프로게스테론 수용체, 소마스타틴, 스테로이드 수용체 보조활성화제-1(SRC1), Her-2(cERB-b), EGFR, ras, c-fos, c-jun, c-myc, p53, p63, nm23 / NDP 키나제, PTEN / MMAC1, SMAD4 / DPC4, Notch-1, JAK3, 사이클린 A, 사이클린 B, 사이클린 C, 사이클린 D, 사이클린 E, Ki67, MDR/MRP 단백질, PSA, 전립선 산성 포스포타제, CA 125, CA 15-3, CA 27-29, HGC, 낭종 섬유증 경막 조절인자, 라미닌 수용체, 뉴런 특이적 엔올라제(NSE), 알파 페토단백질, CD99 / MIC2, DHEA, 프로락틴, CD66e / CEA, 필라그린, gp200 TAG72 / CA72-4, UPA-수용체(CD87), 헤레굴린, IPO-38, 티미딜화 신타제, 토포이소머라제 Iia, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 폐 내성 관련 단백질/주요 결함 단백질(LRP/MFP), 및 O6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT)로 구성된 군에서 선택된 2 이상의 분자를 포함하는 것인 방법.
  75. 제73항에 있어서, 상기 환자는 전립선암, 유방암, 결장암, 방광암, 난소암, 신장암, 자궁암, 두부 및 경부암, 췌장암 및 위암으로 구성된 군에서 선택된 상피세포 암을 갖는 것인 방법.
  76. a) 환자로부터 종양 덩어리의 생검 표본을 얻는 단계;
    b) 순환 종양 세포가 존재하는 경우, 이를 상기 환자로부터 분리하는 단계;
    c) 상기 표본 및 분리된 순환 종양 세포를, 복수의 종양 소인 관련 분자를 검출하는 제제의 이중 패널과 접촉시키는 단계;
    d) 상기 순환 종양 세포 및 표본 내에 존재하는 임의의 종양 소인 관련 분자를 검출하는 단계; 및
    e) 상기 종양 소인 관련 분자가 생검 표본에 비하여 순환 종양 세포에서 변화되는 지를 결정하는 단계를 포함하여, 정위치 종양 덩어리에 존재하는 세포에 대한 순환 종양 세포에서의 변화를 확인하는 방법.
  77. a) 자기 코어 물질, 단백질 베이스 코팅 물질, 및 악성 세포의 제1 특성 결정인자에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 코팅된 자기 나노입자[상기 항체는 베이스 코팅 물질에 직접 또는 간접적으로 커플링되어 있음],
    b) 악성 세포의 제2 특성 결정인자에 대한 결합 특이성을 갖는 하나 이상의 항체,
    c) 상기 악성 세포 이외의 샘플 성분을 분석으로부터 배제하기 위한 세포 특이적 염료;
    d) 셀 스폿터(등록상표) 카트리지 또는 셀 트랙 카트리지로 구성된 군에서선택된 장치; 및
    e) 종양 소인 관련 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 하나 이상의 검출가능하게 표지된 제제
    를 포함하는, 비조혈 악성 세포의 존재에 대해 환자 샘플을 스크리닝하기 위한 테스트 키트.
  78. 제48항에 있어서, 상기 키트는 비표적 세포에 대한 결합 친화도를 갖는 항체, 생물학적 완충액, 투과성 완충액, 프로토콜 및 경우에 따라서 정보지를 더 포함하는 것인 테스트 키트.
  79. 제77항에 있어서, 상기 종양 소인 관련 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 하나 이상의 검출가능하게 표지된 제제는 MUC-1, 에스트로겐, 프로게스테론 수용체, 카텝신 D, p53, 유로키나제형 플라스미노겐 활성인자, 표피 성장 인자, 표피 증식 인자 수용체, BRCA1, BRCA2, CA27.29, CA15.5, 전립선 특이적 항원, 플라스미노겐 활성화제 억제제 및 Her2-neu로 구성된 군에서 선택되며, 유방암 환자를 스크리닝하기 위한 것인 테스트 키트.
  80. 제77항에 있어서, 상기 종양 소인 관련 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 하나 이상의 검출가능하게 표지된 제제는 전립선 특이적 항원, 전립선 산성 포스파타제, 티모신 b-15, p53, HPC1 기본 전립선 유전자, 크레아틴 키나제 및 전립선 특이적 막 항원으로 구성된 군에서 선택되고, 전립선암 환자를 스크리닝하기 위한 것인 테스트 키트.
  81. 제77항에 있어서, 상기 종양 소인 관련 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 하나 이상의 검출가능하게 표지된 제제는 암성배아 항원, C 단백질, APC 유전자, p53, 티미딜화 신타제 및 기질 메탈로프로테인아제(MMP-9)로 구성된 군에서 선택되고, 결장암 환자를 스크리닝하기 위한 것인 테스트 키트.
  82. 제77항에 있어서, 상기 종양 소인 관련 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 하나 이상의 검출가능하게 표지된 제제는 핵 기질 단백질(NMP22), 바르드(Bard) 방광 종양 항원(BTA) 또는 피브린 분해 산물(FDP)로 구성된 군에서 선택되고, 방광암 환자를 스크리닝하기 위한 것인 테스트 키트.
  83. 제77항에 있어서, 상기 하나 이상의 항체는 각각 상이한 암 세포 특성 결정인자에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 패널을 포함하는 것인 테스트 키트.
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