CN111019890B

CN111019890B - 反式-肉桂醛的应用

Info

Publication number: CN111019890B
Application number: CN201911401947.2A
Authority: CN
Inventors: 邱紫文; 韩鸿志; 林欣荣; 瑞家马尼·卡尔斯亚亚尼; 林怡均
Original assignee: Gwo Xi Stem Cell Applied Technology Co Ltd
Current assignee: Gwo Xi Stem Cell Applied Technology Co Ltd
Priority date: 2014-10-20
Filing date: 2014-12-23
Publication date: 2023-02-17
Anticipated expiration: 2034-12-23
Also published as: CN111004779A; CN111004779B; CN111019890A; CN105779380A; TW201615830A; WO2016061888A1; JP2017521406A; JP6466484B2; TWI525193B; CN105779380B

Abstract

反式‑肉桂醛（trans‑cinnamaldehyde，TC）的应用，包括使用反式‑肉桂醛以抗干细胞老化及／或使干细胞年轻化的应用，以及于干细胞治疗上使用反式‑肉桂醛的应用。通过以反式‑肉桂醛处理干细胞，可提升干细胞的增生速率、降低干细胞中老化相关的β‑半乳糖苷酶（senescence associated‑β‑galactosidase，SA‑β‑gal）的活性、增加干细胞中SIRT1基因的表达、及／或提升干细胞中端粒酶的活性。

Description

反式-肉桂醛的应用

本申请是分案申请，原申请的申请号为：201410808936.7，申请日为：2014年12月 23日，发明名称为：反式-肉桂醛的应用。

技术领域

本发明是关于反式-肉桂醛的应用，尤其是关于反式-肉桂醛于干细胞的应用，包括抗干细胞老化及/或使干细胞年轻化，以及干细胞治疗。

背景技术

干细胞依其自我更新(self-renew)及分化的能力，可分成全能(totipotent)干细胞、多能(pluripotent)干细胞、多潜能(multipotent)干细胞、及单效性(unipotent)干细胞。依干细胞发育过程中出现的先后顺序以及分布的情形，可将其大致分成胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES cells)及成体干细胞(adult stem cell)两类。经研究证实，细胞的分化是可逆的，通过将特定基因送入已完全分化的成熟体细胞(somatic cells)，诱导成熟体细胞重新编程(reprogram)为多能细胞，表达出胚胎干细胞的特性及功能，即为诱导型多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)，这些诱导型多能干细胞可分化成为身体的组织而可用于疾病的研究与治疗。

在现今的医学研究领域中，干细胞疗法为许多缺乏有效的治疗方法的疾病带来希望。此等疾病包括，例如：糖尿病、自体免疫排斥、中风、心肌梗塞、肾衰竭、白血病、肌肉萎缩症、重度贫血、阿兹海默症、帕金森氏症、癌症等，干细胞所具有的多能性(pluripotency)于再生医学上的应用，可能解决这些疾病在治疗上长期面临的困境。

将干细胞移植至体内以进行干细胞治疗的成功与否，取决于干细胞的品质。其中，干细胞品质的降低包括例如受到各种压力信息影响而引起的细胞老化(cellularsenescence)，导致干细胞的细胞周期停滞以及增生速率下降，造成组织修复、组织再生、及一般更新(turnover)所必须的干细胞或祖细胞的缺乏，此乃造成干细胞治疗成效不明显的主要原因之一。因此，若能有效抗干细胞老化，则可提升干细胞治疗的成功率。

本发明即是针对前述需求所做的研发成果，本发明人研究发现，反式-肉桂醛(trans-cinnamaldehyde，TC)可有效抗干细胞老化，甚至可使干细胞年轻化，故可用于干细胞治疗，提升细胞治疗效益。

发明内容

本发明的一个目的，在于提供一种抗干细胞老化及/或使干细胞年轻化的方法，包含以反式-肉桂醛(trans-cinnamaldehyde，TC)处理该干细胞。

较佳地，是于干细胞培养液中以约0.1至约50微克╱毫升之反式-肉桂醛处理干细胞。

本发明的另一目的，在于提供一种用于抗干细胞老化及/或使干细胞年轻化的组合物，其包含反式-肉桂醛。

本发明的另一目的，在于提供一种使用反式-肉桂醛于制造一制剂的用途，该制剂是用于抗干细胞老化及/或使干细胞年轻化。较佳地，该制剂是一保健食品或药剂。

本发明的又一目的，在于提供一种套组，其用于干细胞治疗且包含：

(1)一第一部分，包含一干细胞；

(2)一第二部分，包含反式-肉桂醛；以及

(3)干细胞培养液，存在于一第三部分及/或该第一部分及/或第二部分中。

其中，于使用该套组时，是先在该干细胞培养液中以反式-肉桂醛处理该干细胞，再将该经处理的干细胞用于干细胞治疗中。

本发明的再一目的，在于提供一种干细胞治疗方法，其中是对一有需要的个体投予一有效量的干细胞，该干细胞是经反式-肉桂醛预处理。

本发明的详细技术内容及部分具体实施态样，将描述于以下内容中，以供本发明所属领域具通常知识者据以明了本发明的特征。

附图说明

图1A及图1B是显示经不同处理后的脂肪干细胞的表面抗原表达情形的流式细胞仪分析结果图；

图2A至图2C所示为利用成骨(osteogenic)分化试验，分析经不同处理后，脂肪干细胞的成骨分化能力；

图2D至图2F所示为利用脂向(adipogenic)分化试验，分析经不同处理后，脂肪干细胞的脂向分化能力；

图2G所示为经不同处理后成骨分化的脂肪干细胞的相对细胞数，其中纵轴代表于450奈米波长的吸光值，横轴代表经不同处理的各组脂肪干细胞(***表示：P value小于0.01，具显着差异)；

图2H所示为经不同处理后脂向分化的脂肪干细胞的相对细胞数，其中纵轴代表于510奈米波长的吸光值，横轴代表经不同处理的各组脂肪干细胞(***表示：P value小于0.01，具显着差异)；

图3A至图3C是显示经不同处理后，脂肪干细胞的增生速率的Ki67染色照片图；

图4A所示为利用SA-β-gal活性试验，分析经不同浓度的反式-肉桂醛处理后，脂肪干细胞中SA-β-gal的活性，其中纵轴代表SA-β-gal活性百分比，横轴代表经不同处理的各组脂肪干细胞(***表示：P value小于0.01，具显着差异)；

图4B所示为利用SA-β-gal活性试验，分析先以H₂O₂诱导老化再经不同处理后，脂肪干细胞中SA-β-gal的活性，其中纵轴代表SA-β-gal活性百分比，横轴代表经不同处理的各组脂肪干细胞(***表示：P value小于0.01，具显着差异)；

图4C至图4E是显示经不同处理后，脂肪干细胞中SA-β-gal的活性的照片图；

图5A所示为利用定量反转录聚合酶连锁反应(quantative RT-PCR)，分析经不同浓度的反式-肉桂醛处理后，脂肪干细胞中SIRT1基因的表达程度，其中纵轴代表SIRT1基因的表达倍数，横轴代表经不同处理的各组脂肪干细胞(***表示：P value小于0.01，具显着差异)；

图5B所示为利用定量反转录聚合酶连锁反应，分析先以H₂O₂诱导老化再经不同浓度的反式-肉桂醛处理，脂肪干细胞中SIRT1基因的表达程度，其中纵轴代表SIRT1基因的表达倍数，横轴代表经不同处理的各组脂肪干细胞(***表示：P value小于0.01，具显着差异)；

图5C所示为利用定量反转录聚合酶连锁反应，分析经不同处理后，脂肪干细胞中SIRT1基因的表达程度，其中纵轴代表SIRT1基因的表达倍数，横轴代表经不同处理的各组脂肪干细胞(ns表示：P value为0.417，不具显着差异)；

图6A及图6B分别是显示分析经不同处理后，脂肪干细胞中老化相关基因、细胞周期调控相关基因、及多能性相关基因的表达程度的半定量反转录聚合酶连锁反应(semiquantative RT-PCR)照片图及统计直条图；

图7是显示经不同处理后，脂肪干细胞中端粒酶活性的统计直条图，其中纵轴代表端粒酶活性，横轴代表经不同处理的各组细胞(***表示：P value小于0.01，具显着差异)；

图8A至图8C是显示经不同处理后，人类骨髓间质干细胞中SA-β-gal的活性的照片图；

图8D所示为利用SA-β-gal活性试验，分析经不同处理后，人类骨髓间质干细胞中SA-β-gal的活性，其中纵轴代表SA-β-gal活性百分比，横轴代表经不同处理的各组人类骨髓间质干细胞(***表示：P value小于0.05，具显着差异)；

图9A至图9C是显示经不同处理后，华顿氏凝胶干细胞中SA-β-gal的活性的照片图；

图9D所示为利用SA-β-gal活性试验，分析经不同处理后，华顿氏凝胶干细胞中SA-β-gal的活性，其中纵轴代表SA-β-gal活性百分比，横轴代表经不同处理的各组华顿氏凝胶干细胞(***表示：P value小于0.05，具显着差异)；

图10A及图10B所示分别为利用定量反转录聚合酶连锁反应，分析经不同处理后，人类骨髓间质干细胞及华顿氏凝胶干细胞中SIRT1基因的表达程度，其中纵轴代表SIRT1基因的表达倍数，横轴代表经不同处理的各组干细胞(***表示：P value小于0.05，具显着差异)；

图11A是显示“TAA”大鼠(即，肝脏纤维化大鼠)的肝脏纤维化情形的梅生三色染色(Masson’s trichrome staining)照片图；

图11B是显示“TAA”大鼠(即，肝脏纤维化大鼠)的肝脏发炎情形的苏木精-伊红染色(Hematoxylin and Eosin Staining，H&E Staining)照片图；

图12A至图12E所示为利用α-胎儿蛋白(α-feto protein，AFP)免疫组织染色法，分析经不同处理后第7天的大鼠的肝脏组织切片的照片图；

图12F至图12J所示为利用α-胎儿蛋白(α-feto protein，AFP)免疫组织染色，分析经不同处理后第14天的大鼠的肝脏组织切片的照片图；

图13A及图13B是显示经不同处理后不同时间的大鼠的肝脏纤维化情形的梅生三色染色照片图；

图13C及图13D是显示经不同处理后不同时间的大鼠的肝脏发炎情形的苏木精-伊红染色照片图；

图14A及图14B分别是显示经不同处理后不同时间的大鼠的肝脏纤维化分数及活性分数的统计直条图(***表示：P value小于0.01，具显着差异)；以及

图15A至图15E分别是显示经不同处理后不同时间的大鼠肝脏的GPT表达量、GOT表达量、白蛋白表达量、凝血酶原时间、及总胆红素表达量的统计直条图(***表示：P value小于0.01，具显着差异；**表示：P value小于0.05，具显着差异)。

具体实施方式

以下将描述根据本发明的部分具体实施态样；但，在不背离本发明精神下，本发明尚可以多种不同形式的态样来实践，不应将本发明保护范围解释为限于说明书所陈述的内容。此外，除非文中有另外说明，于本说明书中(尤其是在专利申请范围中)所使用的“一”、“该”及类似用语应理解为包含单数及复数形式；所谓“有效量”或“治疗有效量”，是指投予至个体时，可有效至少部分改善怀疑个体的病情的化合物数量；所谓“个体”是指哺乳动物，哺乳动物可为人类或非人动物。

现代医学已广泛使用干细胞，此等应用包括：治疗自体免疫疾病(例如糖尿病、自体免疫排斥)、治疗消化道疾病(例如***/消化道瘘管)、治疗肝脏疾病(例如肝硬化、肝纤维化)、治疗肾脏疾病(例如肾衰竭)、治疗心血管疾病(例如中风、心肌梗塞)、治疗神经***疾病(例如阿兹海默氏症、帕金森氏症)、治疗血液性疾病(例如白血病)、治疗骨骼退化(例如退化性关节炎、膝软骨退化)、治疗牙周病、治疗肌腱发炎、治疗脊椎损伤、治疗头部创伤、整形手术(例如偏侧萎缩、下陷型疤痕)、秃头、皮肤美白、及/或去除皱纹。此可参见例如：Stem cells:innovations in clinical applications.Stem Cells int.Volume 2014,Article ID 516278,9pages，该文献全文并于此处以供参考。

然而，干细胞经过数个世代的继代培养及/或移植至体内后，因各种压力信息所导致的细胞老化会影响干细胞治疗的效益。此可参见例如：Replicative senescence-associated gene expression changes in mesenchymal stromal cells are similarunder different culture conditions.Haematologica.95(6):867-74(2010)，该文献全文并于此处以供参考。经研究证实，干细胞的老化会伴随着以下几种作用：干细胞增生速率下降、干细胞中老化相关β-半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase，SA-β-gal)的活性增加、干细胞中SIRT1基因的表达减少、以及干细胞中端粒酶的活性降低。亦经证实，若能逆转及/或回复上述作用，即可有效抗干细胞老化，有利于干细胞于疾病治疗的应用。前述可参见例如：Four faces of cellular senescence.J Cell Biol.192(4):547-556(2011)、A biomarker that identifies senescent human cells in culture and inaging skin in vivo.Proc Natl Acad Sci U S A.92(20):9363-9367(1995)、SIRT1overexpression antagonizes cellular senescence with activated ERK/S6k1signaling in human diploid fibroblasts.PLoS One.5；3(3):e1710(2008)、Aging,tumor suppression and cancer:high wire-act！Mech Ageing Dev.126(1):51-8(2005)、以及Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.Nature.345(6274):458-460(1990)，该等文献的全文并于此处以供参考。

本发明人研究发现，对于已呈现增生速率下降、SA-β-gal的活性增加、SIRT1基因的表达减少、以及端粒酶的活性降低等现象的老化干细胞，若以反式-肉桂醛处理该干细胞，可有效逆转及/或恢复干细胞中的前述作用。进一步研究发现，反式-肉桂醛甚至可以有效降低一般干细胞(即，未老化的干细胞)中的SA-β-gal活性、增加一般干细胞中SIRT1基因的表达。

因此，本发明是关于抗干细胞老化以及使干细胞年轻化的发现及应用，包括提供抗干细胞老化及/或使干细胞年轻化的组合物、制剂、及方法。其中，该制剂的制造是使用反式-肉桂醛，该组合物包含反式-肉桂醛，该方法包含以反式-肉桂醛处理该干细胞。

本发明组合物、制剂、及方法可适用于任何合宜的干细胞，包括例如：胚胎干细胞、成体干细胞、及诱导型多能干细胞。其中，成体干细胞包括例如：造血干细胞、间质干细胞(例如：脂肪干细胞、骨髓间质干细胞、及华顿氏凝胶(Wharton’s jelly)干细胞)，依其来源分类则包括例如：脐带血干细胞、周边血干细胞、神经干细胞、表皮干细胞、肌肉干细胞、脂肪干细胞、胰干细胞、眼角膜干细胞、肝脏干细胞、及肠上皮干细胞等。

根据本发明方法，在进行干细胞治疗之前，先以反式-肉桂醛对干细胞进行预处理，可提供以下至少一种效果：提升干细胞的增生速率、降低干细胞中SA-β-gal的活性、增加干细胞中SIRT1基因的表达、及提升干细胞中端粒酶的活性，可有效抗干细胞老化及/或使干细胞年轻化，从而提升该干细胞治疗的效益。该反式-肉桂醛也可以组合物或制剂的形式施用。

于根据本发明的抗干细胞老化及/或使干细胞年轻化的方法中，可在任何合宜的条件下进行该反式-肉桂醛对干细胞的处理，只要该条件无害于干细胞存活。于本发明一实施态样中，是于干细胞培养液中进行该处理。其中，可将反式-肉桂醛及/或含有反式-肉桂醛的组合物及/或制剂添加至含有待处理的干细胞的干细胞培养液中，以进行处理；或者，例如将休眠冻存的待处理干细胞解冻并添加至含有反式-肉桂醛的干细胞培养液中，以进行该处理。

可使用任何合宜干细胞培养液于本发明中，只要该培养液与所欲处理的干细胞对应即可。该干细胞培养液通常包含可提供干细胞生长、分化所需养分与条件(如酸碱值)等必要成分。一般而言，干细胞培养液包含基础培养液、动物血清(如胎牛血清)、生长因子(如人类重组表皮生长因子、纤维母细胞生长因子)、营养物质(如牛脑下垂体萃取物)、非必需氨基酸(如L-麸酰胺酸、N-乙酰基-L-半胱氨酸)、氧化还原剂(如L-抗坏血酸)、抗生素(如青霉素、链霉素)等。其中，可用于本发明方法的基础培养液的例子包括，但不限于，K-SFM培养液(keratinocyte-serum free medium)、DMEM培养液(Dulbecco's Modifled Eagle'sMedium)、IMDM培养液(Iscove’s modified Dulbecco’s medium，IMDM，Invitrogen)、MEM培养液(Minimum Essential Medium)、α-MEM培养液、BME培养液(Basal Media Eagle)、MEM/F12培养液、Ham's F10培养液、Ham's F12培养液以及RPMI培养液(Rosewell ParkMemorial Institute)。举例言之，当使用本发明方法以抗脂肪干细胞老化及/或使脂肪干细胞年轻化时，可使用K-SFM培养液作为基础培养液以进行反式-肉桂醛处理。

较佳地，是于干细胞培养液中以约0.1至约50微克/毫升的反式-肉桂醛处理干细胞；更佳地，是于干细胞培养液中以约2微克至约20微克/毫升的反式-肉桂醛处理干细胞以提供抗干细胞老化的效益，或者于干细胞培养液中以约4微克至约20微克/毫升的反式-肉桂醛处理干细胞以提供使干细胞年轻化的效益。

因此，本发明也提供一种抗干细胞老化及/或使干细胞年轻化的组合物，以及一种使用反式-肉桂醛于制造一制剂的用途，该组合物及该制剂即前述用于本发明方法的含反式-肉桂醛的组合物及制剂。该组合物及制剂可供活体外的干细胞处理，以提升干细胞的使用效益，也可供例如人体的个体使用，以提供体内干细胞的年轻化或抗老化效益。

当本发明的抗干细胞老化及/或使干细胞年轻化的组合物或制剂供活体外使用时，该组合物或制剂可包含一载剂，该载剂只要不会对所欲处理的干细胞造成不利影响，且不会影响该反式-肉桂醛的处理效益即可。举例言之，该载剂可以为二甲基亚枫、乙醇、或含0.5％甲基化纤维素的磷酸盐缓冲溶液等。

当本发明的抗干细胞老化及/或使干细胞年轻化的组合物或制剂供施用于例如人体的个体时，该组合物或制剂可以呈任何合宜的形式，并无特殊的限制。举例言之，但不以此为限，该组合物或制剂可呈供吞食或饮用的食品形式，例如食品添加剂、饮品添加剂、膳食补充剂、食品组成分、饮品组成分、保健食品、营养产品、医药食品、营养品，也可以药剂的形式提供。较佳地，是以保健食品或药剂的形式提供该组合物或制剂。

当以药剂提供本发明组合物及/或制剂时，该药剂可根据所欲的投药形式而呈对应的合宜剂型。举例言之，但不以此为限，该药剂可以口服或非经口服(例如皮下、静脉内、肌肉、腹腔、或鼻腔)等投药方式施用至有需要的个体上。视使用形式及用途而定，可选用合宜的载剂以提供该药剂。

以适于口服投药的剂型为例，本发明所提供的药剂可含有任何不会不利影响反式-肉桂醛的所需效益的医药上可接受的载剂，例如：溶剂(水、食盐水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其类似物、及前述的组合)、油性溶剂、稀释剂、安定剂、吸收延迟剂、崩散剂、乳化剂、抗氧化剂、黏合剂、润滑剂、吸湿剂、固体载剂(例如淀粉、皂土(bentonite))等。可利用任何合宜的方法，以适于口服投药的剂型提供该药剂，例如：锭剂(包括糖衣锭)、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、流浸膏剂、溶液剂、糖浆剂、悬液剂、乳剂、及酊剂等等。

至于适于皮下、静脉内、肌肉、或腹腔注射的注射剂型或点滴剂型，则可于本发明所提供的药剂中含有一或多种，例如等张溶液、盐类缓冲液(如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液)、增溶剂、乳化剂、5％糖溶液、以及其他载剂等成分，以静脉输注液、乳剂静脉输注液、干粉注射剂、悬液注射剂、或干粉悬液注射剂等剂型提供该药剂。或者，将该药剂制备成一注射前固体，以可溶于其他溶液或悬浮液中的剂型、或可乳化的剂型提供该注射前固体，并于投予至该有需要的个体前将该注射前固体溶于其他溶液或悬浮液中、或将其乳化，提供所欲的注射剂。另外，适于经鼻腔或经皮肤投予的外用剂型，则例如乳液、乳霜、凝胶(例如水凝胶)、膏状物(例如分散膏、软膏)、喷雾剂、或溶液(例如洗液、悬浮液)。

视需要地，可于本发明所提供的药剂另含有合宜用量的添加剂，例如可提高该药剂于服用时的口适感及视觉感受的调味剂、调色剂、着色剂等，以及可改善该药剂的稳定性及储存性的载体、结合剂、缓冲剂、增黏剂、润滑剂、崩散剂、安定剂、乳化剂、分散剂、悬浮化剂、保存剂、防腐剂、抗菌剂、或抗真菌剂等。此外，该药剂可视需要另含一或多种其他活性成分或与含该一或多种其他活性成分的药物并用，以进一步加强该药剂的功效或增加制剂配方的运用灵活性与调配度，只要该其他活性成分对反式-肉桂醛的所欲效益没有不利的影响即可。

可以一日一次、一日多次、或数日一次等不同频率施用本发明所提供的药剂，可根据投予个体的年龄、体重、及健康况状而异。举例言之，当以口服方式施用至一个体以抗干细胞老化及/或使干细胞年轻化时，以反式-肉桂醛计，其用量为每天约10毫克/公斤体重至约500毫克/公斤体重，较佳为每天约60毫克/公斤体重至约240毫克/公斤体重，更佳为每天约100毫克/公斤体重至约160毫克/公斤体重，其中，该单位“毫克/公斤体重”是指每公斤体重个体所须的投药量。但是，对干细胞老化情形较严重的个体而言，其用量可视实际需要而酌增，例如增加至数倍或数十倍。

当本发明的组合物及/或制剂以保健食品的形式提供时，可包括例如乳制品类、肉类、面包类、蔬菜类、饲料、果汁类、茶类、运动饮料、营养饮料等形态，但不以此为限。其中，有关反式-肉桂醛的添加步骤可根据保健食品的类型而异，只要该添加步骤的环境不会影响该反式-肉桂醛的处理效益即可，举例言之，可于制造过程中的原料阶段即添加反式-肉桂醛(即，作为保健食品的一部分)，或者可于完成制造后的成品阶段再添加反式-肉桂醛(即，作为保健食品的添加物)。其中，有关该添加步骤中反式-肉桂醛的形式，可为反式-肉桂醛本身，或者可先将反式-肉桂醛与其他各种成分(例如蛋白质、糖类、脂肪、微量元素、或维生素等，但不以此为限)混合，制成锭状、胶囊状、颗粒状、粉末状、悬浮液状、或乳化液状的制剂后，再行添加与混合。

视需要地，可于本发明所提供的保健食品另含有合宜用量的赋形剂(例如乳糖、白糖、淀粉、或甘露醇)、崩散剂(例如碳酸钙或羧甲基纤维素钙)、结合剂(例如α化淀粉、***胶、羧甲基纤维素、聚乙烯基呲咯啶酮、或羟丙基纤维素)、增黏剂(天然橡胶)、润滑剂(例如滑石粉、硬脂酸镁、或聚乙二醇6000)、及/或其他添加剂(例如可提高该保健食品于服用时的口适感及视觉感受的调味剂、调色剂、着色剂等，以及可改善该保健食品的稳定性及储存性的载体、缓冲剂、安定剂、乳化剂、分散剂、悬浮化剂、保存剂、防腐剂、抗菌剂、或抗真菌剂等)。此外，该保健食品可根据需要另含一或多种其他活性成分或与含该一或多种其他活性成分的保健食品并用，以进一步加强该保健食品的功效或增加制剂配方的运用灵活性与调配度，只要该其他活性成分对反式-肉桂醛的所需效益没有不利的影响即可。

可以一日一次、一日多次、或数日一次等不同频率食用本发明所提供的保健食品，可根据投予个体的年龄、体重、及健康况状而异。也可针对设定的族群调整本发明所提供的保健食品中反式-肉桂醛的含量，较佳为调整至每日应服用的量。举例言之，若一个体的每日建议使用量为约500毫克，又该保健食品每份含250毫克的反式-肉桂醛，则该个体每日可食用大约二份该保健食品。可于本发明保健食品的外包装标示建议使用量、特定族群(例如孕妇、病患)的使用标准及条件、或与其他食品或医药共同服用的建议事项，以利使用者在无医师、药师或相关执事人员指导下可在家自行服用而无安全疑虑。

根据本发明，在将干细胞使用于干细胞治疗之前，先使用反式-肉桂醛对干细胞进行预处理，可有效抗干细胞老化，甚至可使干细胞年轻化，故可提升细胞治疗效益。因此，本发明也关于反式-肉桂醛用于干细胞治疗的发现及应用，包括提供用于干细胞治疗的套组及方法。

关于本发明的用于干细胞治疗的套组，其包含(1)一包含一干细胞的第一部分、(2)一包含反式-肉桂醛的第二部分、以及(3)存在于一第三部分及/或该第一部分及/或第二部分中的干细胞培养液。其中，于使用时，是先在该干细胞培养液中以反式-肉桂醛处理该干细胞，然后再使用该经处理的干细胞用干细胞治疗中。有关干细胞的选用、培养液的选用、以及反式-肉桂醛的使用条件与方法，均如上述。较佳地，反式-肉桂醛是以每毫升该培养液约0.1微克至约50微克的浓度使用。

根据本发明的套组，各成分通常是分开包装且可各自储存，且各成分可各自分开运送或销售，也可组合成套一起配送与销售。该套组可另包含一使用说明书，以利使用者在使用时，可根据其中所拟定的程序与流程，于现场混合各成分以进行干细胞培养、处理及施用。

举例言之，当本发明套组的各成分分开包装且各自储存，且各成分各自分开运送或销售时，将该干细胞于-80℃的环境下保存于一冻存液中；将该反式-肉桂醛较佳于4℃以下的环境下避光保存于例如二甲基亚枫、乙醇、及含0.5％甲基化纤维素的磷酸盐缓冲溶液等溶剂中；且将该干细胞培养液于-20℃的环境下保存。又例如，当本发明套组的各成分组合成套以配送与销售时，可分别以一内部呈-80℃的容器(例如液态氮桶)、一内部低于4℃的容器、以及一内部呈-20℃的容器(例如冰盒)来分别盛装前述该干细胞、反式-肉桂醛、以及干细胞培养液。各该容器的形状、大小并无特殊限制，只要各该容器具有与外部的温度隔绝的功能，使各该成分于一起配送与销售时不会互相影响保存温度即可。其中，可使用任何合宜冻存液于干细胞的保存，只要冻存液的组成可有效维持干细胞存活率、不影响其染色体组成、增殖、及分化能力即可。通常可根据所对应的干细胞而调整冻存液的组成，一般而言，冻存液中的组成包括二甲基亚枫、葡萄糖等细胞营养成分、及pH调节剂等，但不包括含血清与动物蛋白。

根据本发明的干细胞治疗方法，是对一有需要的个体投予一有效量的干细胞，其中该干细胞是经反式-肉桂醛预处理。举例言之，于本发明方法一具体实施态样中，在将干细胞使用于肝脏纤维化的干细胞治疗之前，先使用反式-肉桂醛对干细胞进行预处理，可有效抗干细胞老化，提升干细胞于治疗肝脏纤维化的效益。其中，有关干细胞的处理与相关物料的选用、反式-肉桂醛的用量范围、以及相关治疗的应用，均如上述。

兹以下列实施例进一步例示说明本发明。其中该等实施例仅提供作为说明，而非用以限制本发明的保护范围。实施例

A.细胞实验

实施例1：干细胞的准备

(1)脂肪干细胞(adipose stem cell，ADSC)

于37℃、5％二氧化碳下，将脂肪干细胞置于无血清角质细胞培养液(keratinocyte-serum free medium，K-SFM，购自Invitrogen-Gibco)中，进行继代培养5至7次。该K-SFM培养液添加有人类重组表皮生长因子(human recombinant epidermalgrowth factor，购自Gibco)、牛脑下垂体萃取物(bovine pituitary extract，购自Invitrogen-Gibco)、10％胎牛血清(FBS，购自Hyclone)、1％青霉素/链霉素(P/S，购自Biowest)、0.2毫莫耳浓度的L-抗坏血酸(L-ascorbic acid，购自Sigma)、以及2毫莫耳浓度的N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，购自Sigma)。

取四份等量体积的上述含有继代培养的脂肪干细胞的培养液，分别添加最终浓度为100微莫耳浓度的H₂O₂(购自Sigma-Aldrich)进行处理历时2小时，以诱导干细胞老化。其后，移除旧的培养液并加入新鲜的培养液，再分别添加最终浓度为0、2、4、及6微莫耳浓度的反式-肉桂醛(trans-cinnamaldehyde，TC，购自Sigma-Aldrich)进行处理历时6小时，所得称为“H₂O₂组(经H₂O₂处理2小时，但未以TC处理)”、“H₂O₂+TC2组(经H₂O₂处理2小时，再以2微莫耳浓度的TC处理6小时)”、“H₂O₂+TC4组(经H₂O₂处理2小时，再以4微莫耳浓度的TC处理6小时)”、及“H₂O₂+TC6组(经H₂O₂处理2小时，再以6微莫耳浓度的TC处理6小时)”脂肪干细胞。

取五份等量体积的上述含有继代培养的脂肪干细胞的培养液，分别添加最终浓度为100微莫耳浓度的H₂O₂进行处理历时2小时，以诱导干细胞老化。其后，移除旧的培养液并加入新鲜的培养液，再于第1份添加最终浓度为6微莫耳浓度的TC进行处理历时6小时，所得称为“TC6H组”；于第2至5份各添加最终浓度为6微莫耳浓度的TC进行处理历时6小时，其后将细胞移至于DMEM(Dulbecco’s modified essential medium)培养液中继续培养，分别历时12、24、48、及72小时，所得称为“TC12H组”、“TC24H组”、“TC48H组”、及“TC72H组”脂肪干细胞。

取四份等量体积的上述含有继代培养的脂肪干细胞的培养液，分别添加最终浓度为0、2、4、及6微莫耳浓度的TC进行处理历时6小时，所得称为“未处理组(未经任何处理)”、“TC2组(仅以2微莫耳浓度的TC处理6小时)”、“TC4组(仅以4微莫耳浓度的TC处理6小时)”、及“TC6组(仅以6微莫耳浓度的TC处理6小时)”的脂肪干细胞。

(2)华顿氏凝胶干细胞(Wharton’s jelly stem cell，WJSC)

于37℃、5％二氧化碳下，将华顿氏凝胶干细胞置于IMDM培养液(Iscove’smodified Dulbecco’s medium，IMDM，购自Invitrogen)中，进行继代培养5至7次。该IMDM培养液系添加有10％胎牛血清(购自Hyclone)、10微克/毫升的碱性纤维母细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，购自R&D system)、2毫莫耳浓度的L-麸酰胺酸(购自Invitrogen-Gibco)、及100单位/毫升的青霉素/链霉素(购自Invitrogen)。

取三份等量体积的上述含有继代培养的华顿氏凝胶干细胞的培养液，于第1、2份分别添加最终浓度为100微莫耳浓度的H₂O₂进行处理历时2小时，以诱导干细胞老化。其后，移除旧的培养液并加入新鲜的培养液，再分别添加最终浓度为0或6微莫耳浓度的TC进行处理历时6小时，所得称为“H₂O₂组(经H₂O₂处理2小时，但未以TC处理)”及“H₂O₂+TC6组(经H2O2处理2小时，再以6微莫耳浓度的TC处理6小时)”的华顿氏凝胶干细胞；第3份则为未经任何处理，称为“未处理组”的华顿氏凝胶干细胞。

(3)人类骨髓间质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cell，hBMMSC)

于37℃、5％二氧化碳下，将人类骨髓间质干细胞(hBMMSC)置于IMDM培养液(购自Invitrogen-Gibco)中，进行继代培养5至7次。该IMDM培养液系添加有10％胎牛血清(购自Hyclone)、10微克/毫升的碱性纤维母细胞生长因子(购自R&D system)、2毫莫耳浓度的L-麸酰胺酸(购自Invitrogen-Gibco)、及100单位/毫升的青霉素/链霉素(购自Invitrogen-Gibco)。

取三份等量体积的上述含有继代培养的人类骨髓间质干细胞的培养液，于第1、2份分别添加最终浓度为100微莫耳浓度的H₂O₂进行处理历时2小时，以诱导干细胞老化。其后，移除旧的培养液并加入新鲜的培养液，再分别添加最终浓度为0或6微莫耳浓度的TC进行处理历时6小时，所得称为“H₂O₂组(经H₂O₂处理2小时，但未以TC处理)”及“H₂O₂+TC6组(经H₂O₂处理2小时，再以6微莫耳浓度的TC处理6小时)”的人类骨髓间质干细胞；第3份则未经任何处理，称为“未处理组”的人类骨髓间质干细胞。

实施例2：H₂O₂及反式-肉桂醛对干细胞的表面抗原表达的影响

分别使用不同抗体对实施例1(1)的“未处理组”、“H₂O₂组”、及“H₂O₂+TC6组”的脂肪干细胞进行标定，该抗体包括购自Dako公司的抗人类白血球分化抗原14(human clusterof differentiation 14，CD14)的抗体、抗人类白血球分化抗原29(CD29)的抗体、抗人类白血球分化抗原44(CD44)的抗体、抗人类白血球分化抗原45(CD45)的抗体、以及抗人类白血球抗原-ABC(human leukocyte antigen-ABC，HLA-ABC)的抗体，与购自Becton Dickinson公司的抗人类白血球分化抗原34(CD34)的抗体、抗人类白血球分化抗原49b(CD49b)的抗体、抗人类白血球分化抗原73(CD73)的抗体、抗人类白血球分化抗原90(CD90)的抗体、以及抗人类白血球抗原-DR(HLA-DR)的抗体。其后以流式细胞仪(Beckman Coulter公司，型号：FC500)分析各组细胞的表面抗原的表达，结果示于图1A、1B。

由图1A、1B可知，相较于“未处理组”，“H₂O₂组”及“H₂O₂+TC6组”的表面抗原的表达类型并没有明显改变，此三组脂肪干细胞皆会表达间质干细胞的标识物(例如：CD29、CD44、CD73、CD90、及HLA-ABC)，但不会表达造血干细胞的标识物(例如：CD34、CD45、及HLA-DR)。前述结果显示，不论H₂O₂处理或是TC处理皆不会影响干细胞的表面抗原的表达。

实施例3：反式-肉桂醛对干细胞的分化能力的影响

(1)成骨分化试验

于DMEM培养液中培养实施例1(1)的“未处理组”、“H₂O₂组”、及“H₂O₂+TC6组”脂肪干细胞，以诱导脂肪干细胞走向成骨分化，该培养液添加有10％胎牛血清、20毫微莫耳浓度的甲基脱氢皮质固醇(dexamethasone)、100单位/毫升的青霉素、100微克/毫升的链霉素、2.5微克/毫升的两性霉素(amphotericin)、10毫莫耳浓度的b-甘油磷酸盐(b-glycerophosphate)、及0.05毫莫耳浓度的L-抗坏血酸-2-磷酸盐(L-ascorbicacid 2-phosphate)。培养至第7天，以碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)检测套组(购自EMDMillipore，型号：CSCR004)进行染色，其后以显微镜拍照，结果示于图2A至图2C，其中，成骨分化后的细胞于显微镜下系呈紫色。拍照后，检测各组于450奈米波长的吸光值(OD450nm)(此吸光值对应于紫色细胞的数目)，以了解H₂O₂及/或TC对于脂肪干细胞的成骨分化能力的影响，结果示于图2G。

由图2A至2C、及图2G可知，相较于“未处理组”，“H₂O₂组”的成骨分化后的细胞数目明显减少，而“H₂O₂+TC6组”的成骨分化后的细胞数目则与“未处理组”相当。前述结果显示，H₂O₂处理会降低干细胞的成骨分化的能力，而TC处理则可抵销H₂O₂的不利影响，使干细胞的成骨分化的能力恢复至正常。

(2)脂向分化试验

于DMEM培养液中培养实施例1(1)的“未处理组”、“H₂O₂组”、及“H₂O₂+TC6组”脂肪干细胞，以诱导脂肪干细胞走向脂向分化，该培养液添加有10％胎牛血清、10微克/毫升的胰岛素、1微莫耳浓度之甲基脱氢皮质固醇、0.5毫莫耳浓度的3-异丁基-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、100微莫耳浓度的吲哚美辛(indomethacin)。培养至第7天，进行红油O染色(Oil Red O staining)，并以显微镜拍照，结果示于图2D至图2F。其中，干细胞进行脂向分化时，细胞中会有油滴的产生，进行红油O染色后，细胞中的油滴于显微镜下会呈橘红色。红油O染色的步骤可参见Coptis chinensis alkaloids exert anti-adipogenic activity on 3T3-L1 adipocytes by downregulating C/EBP-αand PPAR-γ.Fitoterapia.98:199-208(2014)，该文献全文并于此处以供参考。

拍照后，以异丙醇(含有4％Nonidet P-40清洁剂)将各组细胞的油滴萃取出，检测并计算各组于510奈米波长的吸光值(OD510nm)(此吸光值是对应于橘红色细胞，即，脂向分化后的细胞的数目)，结果示于图2H。

由图2D至2F、及图2H可知，相较于“未处理组”，“H₂O₂组”的成骨分化后的细胞数目明显减少，而“H₂O₂+TC6组”的脂向分化后的细胞数目则与“未处理组”相当。前述结果显示，H₂O₂处理会降低干细胞的脂向分化的能力，而TC处理则可抵销H₂O₂的不利影响，使干细胞的脂向分化的能力恢复至正常。

实施例4：反式-肉桂醛使干细胞年轻化及抗干细胞老化的效益

(1)增生速率分析

分别以磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered saline，PBS)清洗实施例1(1)的“未处理组”、“H₂O₂组”、及“H₂O₂+TC6组”脂肪干细胞，重复二次。其后，先以3.7％的甲醛进行固定，再以10％的胎牛血清(稀释于PBS中)进行阻断(blocking)反应。其后，以PBS清洗细胞1次，于4℃下以Ki67抗体(购自Novus biological)与细胞进行反应至隔日，再以PBS清洗细胞1次，于室温下以二级抗体(goat anti rabbit IgG，购自Merk Millpore)与细胞进行反应，历时2小时。最后，以DAPI染剂(购自Invitrogen)避光染色，然后以荧光显微镜观察，结果示于图3A至3C。由于Ki67抗体可以标示增生中的细胞于G1、S、G2及M期的核蛋白，但不能标示静止G0期的细胞，因此，当Ki67标示的细胞越多，表示增生中的细胞越多(即，增生速率越高)。

由图3A至3C可知，相较于“未处理组”，“H₂O₂组”的Ki67标示的细胞明显减少，而“H₂O₂+TC6组”的Ki67标示的细胞则明显增加至与“未处理组”相当(箭头所指处即为增生中的细胞)。前述结果显示，H₂O₂处理会使干细胞老化，而TC处理则可抵销H₂O₂的不利影响，使老化的干细胞的增生速率恢复至正常(即，可抗干细胞老化)。

(2)老化相关β-半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase，SA-β-gal)的活性测试

已知老化细胞于酸性条件下(例如pH6.0)会表达出SA-β-gal的活性，因此，提高检测细胞内此种活性物质的表达量，可反映出细胞的老化程度。

分别以PBS清洗实施例1(1)的各组脂肪干细胞，重复二次。其后，先以3％的甲醛固定，再以PBS清洗一次。接着，于37℃且无CO2的环境下，在新鲜配制的染色溶液中将各组细胞染色历时12小时。该染色溶液含有1毫克/毫升的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactosidase，X-gal)、40毫莫耳浓度的柠檬酸/磷酸钠(pH6.0)、5毫莫耳浓度的亚铁***、5毫莫耳浓度的铁***、150毫莫耳浓度的氯化钠、以及2毫莫耳浓度的氯化镁。

移除染色溶液，以PBS清洗各组细胞。最后，于显微镜下以10倍放大倍率进行观察、拍照，并计算有表达SA-β-gal活性的细胞的百分比，结果示于图4A至4E。

图4A显示，相较于“未处理组”，“TC2组”、“TC4组”、及“TC6组”中有表达SA-β-gal活性的细胞数量皆明显减少，且随TC浓度增加而降低，此说明TC具有使干细胞年轻化的能力。

由图4B至4E可知，相较于“未处理组”，“H₂O₂组”中有表达SA-β-gal活性的细胞数量明显增加，显示H₂O₂会使干细胞老化；此外，相较于“H₂O₂组”，“H₂O₂+TC2组”、“H₂O₂+TC4组”、及“H₂O₂+TC6组”中有表达SA-β-gal活性的细胞数量皆明显减少，此说明TC可以抵销H₂O₂造成干细胞老化的不利影响。

(3)基因表达分析

(3-1)cDNA的制备

以RNA纯化套组(RNasy Mini kit，购自Qiagen)萃取实施例1(1)的各组脂肪干细胞、骨髓间质干细胞、及华顿氏凝胶干细胞的全细胞RNA，其后以反转录套组(RT Pre Mix，购自iNtRON Biotechnology)，将所得的全细胞RNA反转录成cDNA。

表1

(3-2)定量RT-PCR

取1微升上述(3-1)所得的各组脂肪干细胞的cDNA，各加入0.6微升如表1所示SIRT1基因的对应引子(5微微莫耳/微升)、3.4微升的去离子水、以及10微升的SYBR GreenPCR master mix(购自Thermo Scientific)，其后置于同步定量聚合酶连锁反应器(ABIprism 7700sequence detection system)中反应，以定量基因表达量的强弱，反应条件如下：i﹚50℃，2分钟，1个循环；ii﹚95℃，10分钟，1个循环；iii﹚95℃，15秒、60℃，30秒、72℃，30秒，以上步骤进行40个循环；iv﹚72℃，10分钟，1个循环；v﹚最后降至4℃以结束反应。结果示于图5A至图5C。

由图5A可知，相较于“H₂O₂组”，“TC2组”、“TC4组”、及“TC6组”的SIRT1(沉默交配型信息调节2同源物，silent mating type information regulation 2homolog)基因的表达皆明显增加，且随TC浓度的增加而上升，此再次说明，TC具有使干细胞年轻化的能力。

由图5B可知，相较于“H₂O₂组”，“H₂O₂+TC2组”、“H₂O₂+TC4组”、及“H₂O₂+TC6组”的SIRT1基因的表达皆明显增加，且随TC浓度的增加而上升，此再次说明，TC具有抗干细胞老化的能力。

由图5C可知，相较于“TC6H组”，“TC12H组”、“TC24H组”、“TC48H组”、“TC72H组”的SIRT1基因的表达皆没有明显差异。此显示，TC于增加干细胞中SIRT1基因表达的效益可维持至少72小时。

(3-3)半定量RT-PCR

取2.5微升上述(3-1)所得的“未处理组”、“H₂O₂组”、及“H₂O₂+TC6组”脂肪干细胞的cDNA，并加入2.5微升如表1所示各基因的对应引子(10微莫耳浓度)、7.5微升的去离子水、以及12.5微升的

PLUS GREEN 2X Master Mix(Lucigen，Middleton，Wisconsin，USA)，再将前述样品置于聚合酶连锁反应器中，并设定反应条件如下：i)94℃，30秒、55℃，30秒、94℃，60秒，以上步骤进行30个循环的反转录聚合酶连锁反应(Reverstranscription polymerase chain reaction，RT-PCR)；ii)72℃，10分钟；iii)最后降温至4℃以结束反应。将所得的聚合酶连锁反应(PCR)产物，以2％琼脂胶体进行30分钟电泳(电压：100伏特)，接着将该胶体置于溴化乙锭(ethidium bromide，EtBr)中染色10分钟，再利用照胶***(DOC PRINT DP-001FDC，VilberLourmat France)拍摄影像，结果示于图6A，最后以软件(Image J)定量各基因表达量的强弱，结果示于表6B。

由图6A、6B可知，相较于“未处理组”，“H₂O₂组”的SIRT1基因的表达明显减少，而相较于“H₂O₂组”，“H₂O₂组+TC6组”的SIRT1基因的表达则明显增加。相较于“未处理组”，“H₂O₂组”的p21、及p53基因的表达明显增加，而相较于“H₂O₂组”，“H₂O₂组+TC6组”的p21、p53基因的表达则明显减少。相较于“H₂O₂组”，“H₂O₂组+TC6组”的OCT4(octamer-bindingtranscription factor 4)、及NANOG基因的表达没有明显差异。

已知SIRT1基因的表达与老化相关，p21、及p53基因的表达与细胞周期的调控相关，而OCT4、及NANOG基因的表达则与干细胞的多能性(pluripotency)相关。因此，上述结果说明，TC具有抗干细胞老化及调节细胞周期的能力，且不会对干细胞多能性造成影响。

(3-4)微阵列分析(Microarray Analysis)

以反转录套组(RT Pre Mix，购自iNtRON Biotechnology)及表2所示各基因的对应引子以及表1所示SIRT1基因、p53基因的对应引子，对上述(3-1)所提供的“H₂O₂组”、“H₂O₂组+TC6组”的脂肪干细胞的全细胞RNA进行约20或30个扩增循环的反转录聚合酶连锁反应，所得产物即为各该基因的单股cDNA。

将上述cDNA与基因晶片(affymetrixGeneChip Human Genome U133plus2.0Array，Affymetrix)进行杂交，其后以微阵列扫描器***(Gene

Scanner 3000)进行微阵列的扫描并分析数据。表3显示，相较于“H₂O₂组”的基因表达(即，将“H₂O₂组”中的基因表达设定为1倍)，“H₂O₂组+TC6组”的基因表达倍数。

表2

表3

由表3可知，相较于“H₂O₂组”，“H₂O₂组+TC6组”脂肪干细胞中与增生作用相关的基因(即，NYFA、CCND1、EIF5、SIRT1、E2F6、POLR3H、hTERT、及PCNA)的表达皆明显增加，与细胞凋亡(apoptosis)相关的基因(即，GADD45B、PIM1、p53、及p16)的表达则皆明显减少。前述结果显示，TC可通过增加细胞中转录、转译相关之基因的表达以及SIRT1基因的表达，而提升细胞的增生速率。

(4)端粒酶活性测试

端粒酶活性为细胞老化的关键控制因子，故以端粒酶重复序列扩增法(TelomericRepeat Amplification Protocal，TRAP)分析实施例1(1)的“未处理组”、“H₂O₂组”、及“TC6H组”脂肪干细胞中端粒酶的活性。其中，先以聚合酶链锁反应(PCR)使端粒3′端的引子(即，Telo TAGGG)在端粒酶的催化下延伸，并扩增TTAGGG重复序列，其后以酶免疫测定法(ELISA)检测各组的产物信号，结果示于图7，且以HEK293细胞(未经任何处理)中端粒酶的活性作为正向控制组。

由图7可知，相较于“未处理组”，“H₂O₂组”的端粒酶活性明显降低，而相较于“H₂O₂组”，“TC6H组”的端粒酶活性则明显提升。此结果显示，H₂O₂处理会使干细胞老化，而TC处理则可提升老化的干细胞端粒酶的活性，此再次说明，TC具有抗干细胞老化的能力。

(5)骨髓间质干细胞及华顿氏凝胶干细胞的试验

(5-1)SA-β-gal的活性测试

重覆上述(2)的步骤，但使用实施例1的各组骨髓间质干细胞以及华顿氏凝胶干细胞，结果分别示于图8A至8D、以及图9A至9D。

由图8A至8D可知，相较于“未处理组”人类骨髓间质干细胞，“H₂O₂组”人类骨髓间质干细胞中有表达SA-β-gal活性的细胞数量明显增加，而相较于“H₂O₂组”人类骨髓间质干细胞，“H₂O₂+TC6组”人类骨髓间质干细胞中有表达SA-β-gal活性的细胞数量则明显减少。前述结果，与脂肪干细胞的结果一致。

由图9A至9D可知，相较于“未处理组”华顿氏凝胶干细胞，“H₂O₂组”华顿氏凝胶干细胞中有表达SA-β-gal活性的华顿氏凝胶干细胞数量明显增加，而相较于“H₂O₂组”华顿氏凝胶干细胞，“H₂O₂+TC6组”华顿氏凝胶干细胞中有表达SA-β-gal活性的细胞则明显减少。前述结果，也与脂肪干细胞的结果一致。

(5-2)SIRT1基因表达分析

重覆上述(3-2)步骤，但使用(3-1)所得的各组人类骨髓间质干细胞以及华顿氏凝胶干细胞的cDNA进行定量RT-PCR。结果示于图10A、10B。

由图10A可知，相较于“未处理组”人类骨髓间质干细胞，“H₂O₂组”人类骨髓间质干细胞的SIRT1基因的表达明显减少，此说明H₂O₂处理会使细胞老化；而相较于“H₂O₂组”人类骨髓间质干细胞，“H₂O₂+TC6组”人类骨髓间质干细胞中SIRT1基因的表达则明显增加，此说明，TC具有抗干细胞老化的能力。前述结果，与脂肪干细胞的结果一致。

由图10B可知，相较于“未处理组”华顿氏凝胶干细胞，“H₂O₂组”华顿氏凝胶干细胞中SIRT1基因的表达明显减少，此说明H₂O₂处理使细胞老化；而相较于“H₂O₂组”华顿氏凝胶干细胞，“H₂O₂+TC6组”华顿氏凝胶干细胞中SIRT1基因的表达则明显增加，此说明，TC具有抗干细胞老化的能力。前述结果，也与脂肪干细胞的结果一致。

B.动物实验

实施例5：肝脏纤维化大鼠模型的建立

以腹膜内注射的方式，将200毫克/公斤体重的硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)施用至8周的雄性Wister大鼠(共35只)，每三天注射一次，共60天(即，总共注射20次)，以获得肝脏纤维化的大鼠模型，称为“TAA组”大鼠。另有未注射硫乙酰胺，但注射相同体积的普通食盐水的正常“控制组”大鼠(共12只)。于最后一次注射完成后第4天，以***将4只“控制组”大鼠及3只“TAA组”大鼠牺牲，并进行以下分析：

(1)组织病理学分数评估

取“控制组”及“TAA组”大鼠的肝脏组织样本，其后进行组织样本的处理、切片、及染色，结果示于图11A、11B，以评估组织病理学的分数。其中，该染色方法包括苏木精-伊红染色(Hematoxylin and Eosin Staining，H&E Staining)以及梅生三色染色(Masson’strichrome staining)，此可参见Adipose-derived stem cells can abrogate chemical-induced liver fibrosis and facilitate recovery of liver function.CellTransplant.21(12):2753-2764(2012)，该文献全文并于此处以供参考。其后，以Metavir分级***分析苏木精-伊红染色及梅生三色染色结果，分别以如下表5所示进行分级，得到活性分数(activity score)以及纤维化分数(fibrosis score)，其中，活性分数越高代表肝脏发炎的程度越严重，而纤维化分数越高代表纤维化程度越严重。

表5

由图11A(即，梅生三色染色结果)可知，胶原蛋白聚积在“TAA”大鼠的肝脏组织中，且将两条血管连接起来，此为肝脏纤维化的特征。另以Metavir分级***分析第图11A的结果得知，相较于“控制组”大鼠的纤维化分数为0，“TAA”大鼠的纤维化分数为4。前述结果说明，长期注射TAA会使大鼠肝脏产生严重的纤维化(甚至肝硬化)。

由图11B(即，苏木精-伊红染色结果)可知，“TAA”大鼠的肝脏组织明显受到巨噬细胞浸润。另以Metavir分级***分析图11B的结果得知，相较于“控制组”大鼠的活性分数为0，“TAA”大鼠的活性分数为3。前述结果说明，长期的TAA注射确实会使大鼠肝脏产生重度的发炎反应。

(2)生化功能指数分析

收集“控制组”及“TAA组”大鼠的心脏血液，其后以生化分析仪(购自Roche，型号：Integra 800)进行测量，以分析肝脏的生化功能指数，借此评估肝脏的伤害程度，其中该生化功能指数包括麸胺酸草醋酸转胺酶(glutamate oxaloacetate transaminase，GOT)表达量、麸胺酸丙酮酸转胺基酶(glutamate pyruvate transaminase，GPT)表达量、白蛋白(albimin)表达量、总胆红素(total bilirubin)表达量、及凝血酶原时间(prothrombintime)，结果示于表4。

表4

由表4可知，相较于“控制组”，“TAA”大鼠的GOT、GPT、及总胆红素在血液中的表达量以及凝血酶原时间皆明显增加，而白蛋白在血液中的表达量则明显降低。此结果再次确认，长期注射TAA会使大鼠肝脏受到伤害。

实施例6：反式-肉桂醛于提升干细胞的治疗效果的效益

将实施例5剩余的32只“TAA组”大鼠分成“假性注射组”、“干细胞组”、“H₂O₂组”、及“TC组”(每组8只)，并进行不同处理(处理当日称为处理后“第0天”)。其中，于“假性注射组”，仅注射300微升的普通食盐水至肝脏纤维化大鼠的肝脏；于“干细胞组”，注射300微升(含1×10⁶个细胞)的实施例1所提供的“未处理组”脂肪干细胞至肝脏纤维化大鼠的肝脏(即，正向控制组)；于“H₂O₂组”，注射300微升(含1×10⁶个细胞)的实施例1所提供的“H₂O₂组”脂肪干细胞至肝脏纤维化大鼠的肝脏(即，负向控制组)；于“TC组”，注射300微升(含1×10⁶个细胞)的实施例1所提供的“H₂O₂+TC6组”脂肪干细胞至肝脏纤维化大鼠的肝脏。

于各组大鼠经不同处理后的“第7天”，以***将各组中4只大鼠牺牲，于处理后“第14天”，再将各组剩余的4只大鼠牺牲。收集各组大鼠的心脏血液及取肝脏组织样本后，进行以下分析：

(6-1)α-胎儿蛋白(α-feto protein，AFP)免疫组织染色

以抗人类α-胎儿蛋白抗体(Calbiochem公司，ST1673)对“控制组”、“假性注射组”、“干细胞组”、“H₂O₂组”、及“TC组”大鼠的肝脏组织切片进行α-胎儿蛋白免疫组织染色分析。其中，干细胞移植后“第7天”的结果示于图12A至12E，干细胞移植后“第14天”的结果则示于图12F至图12J。由于α-胎儿蛋白抗体为针对人类的α-胎儿蛋白，因此，带有α-胎儿蛋白讯号的细胞(即，箭头所指的褐色细胞)表示源自移植后的脂肪干细胞，分化后成为似肝细胞(hepatocyte-like cell)。

由图12A至12J可知，于干细胞移植后“第7天”及“第14天”，“干细胞组”、“H₂O₂组”、及“TC组”的肝脏组织中皆有许多带有α-胎儿蛋白信号的细胞(即，箭头所指处)。此结果显示，各组干细胞于移植至大鼠肝脏后皆能存活并且分化。以下进一步观察各组干细胞对肝脏纤维大鼠所提供的治疗效益。

(6-2)组织病理学分数评估

对“控制组”、“假性注射组”、“干细胞组”、“H₂O₂组”、及“TC组”大鼠的心脏血液进行实施例5(1)的组织病理学分数评估，结果示于图13A至图13D及图14A、14B，其中，梅生三色染色的结果示于图13A、13B，苏木精-伊红染色的结果则示于图13C、13D；另外，将图14A、14B的结果数据化，如下表6所示。

表6

	纤维化分数	活性分数
			控制组	0	0
假性注射组	4	3
			H2O2组	3-4	2-3
干细胞组	2-3	1-2
			TC组	1-2	1-2

由图13A至图13D、图14A、14B、及表6可知，长期的TAA注射会使大鼠肝脏产生重度的发炎反应，肝脏组织受到巨噬细胞浸润而产生严重的纤维化(甚至肝硬化)，而以“H₂O₂+TC6组”脂肪干细胞进行治疗可降低肝脏纤维化大鼠肝脏的发炎反应，并且改善纤维化的状况。

(6-3)生化功能指数分析

对“控制组”、“假性注射组”、“干细胞组”、“H₂O₂组”、及“TC组”大鼠的心脏血液进行实施例5(2)的生化功能指数分析，结果示于图15A至15E。

由图15A可知，于治疗后“第14天”，相较于“H₂O₂组”的GPT的表达量(93±13单位/升)，“干细胞组”的GPT的表达量明显降低(72±14单位/升)。相较于“干细胞组”，“TC组”的GPT的表达量亦明显降低(66±14单位/升)。此结果显示，以“H₂O₂+TC6组”脂肪干细胞进行治疗，可有效降低肝脏纤维化大鼠血液中GPT的表达量。

由图15B可知，于治疗后“第14天”，相较于“假性注射组”的GOT的表达量(208±12单位/升)，“干细胞组”的GOT的表达量明显降低(162±60单位/升)。相较于“干细胞组”，“TC组”的GOT的表达量也明显降低少(137±18单位/升)。此结果显示，以“H₂O₂+TC6组”的脂肪干细胞进行治疗，可有效降低肝脏纤维化大鼠血液中GOT的表达量。

由图15C可知，于治疗后“第14天”，相较于“干细胞组”的白蛋白的表达量(3.52±0.28克/分升)，“假性注射组”的白蛋白的表达量(3.23±0.01克/分升)明显降低。相较于“假性注射组”，“TC组”的白蛋白的表达量则明显增加(3.48±0.03克/分升)。此结果显示，以“H₂O₂+TC6组”脂肪干细胞进行治疗，可有效增加肝脏纤维化大鼠血液中白蛋白表达量。

由图15D可知，于治疗后“第14天”，“假性注射组”的凝血酶原时间(23.10±2.5秒)，“TC组”的凝血酶原时间(10.88±0.67秒)明显减少。此结果显示，以“H₂O₂+TC6组”脂肪干细胞进行治疗，可有效减少肝脏纤维化大鼠的凝血酶原时间。

由图15E可知，于治疗后“第14天”，相较于“干细胞组”的总胆红素的表达量(0.05±0.02毫克/分升)，“TC组”的总胆红素的表达量(0.034±0.03毫克/分升)明显降低，且趋近于“控制组”的总胆红素的表达量(0.02±0.02毫克/分升)。此结果显示，以“H₂O₂+TC6组”脂肪干细胞进行治疗，可有效降低肝脏纤维化大鼠血液中总胆红素的表达量。

上述结果显示，以反式-肉桂醛(TC)处理干细胞可有效抗干细胞老化，从而提升干细胞的治疗效益。

【序列表】

<110> 国玺干细胞应用技术股份有限公司

<120> 反式-肉桂醛的应用

<130> 无

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SIRT1 引子 - 顺向序列

<400> 1

ggtgttaaat accaaactgc 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SIRT1 引子 - 反向序列

<400> 2

aggagtgatg ttcaaaatg 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> p53 引子 - 顺向序列

<400> 3

taacagttcc tgcatgggcg gc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> p53 引子 – 反向序列

<400> 4

aggacaggca caaacacgca cc 22

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> p21 引子 - 顺向序列

<400> 5

cactccaaac gccggctgat cttc 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> p21 引子 – 反向序列

<400> 6

tgtagagcgg gcctttgagg ccctc 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OCT4 引子 - 顺向序列

<400> 7

cttgctgcag aagtgggtgg aggaa 25

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OCT4 引子 – 反向序列

<400> 8

ctgcagtgtg ggtttcgggc a 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NANOG 引子 - 顺向序列

<400> 9

tgctattctt cggccagttg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NANOG 引子 – 反向序列

<400> 10

tgcctcacac ggagactgtc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TWIST1 引子 - 顺向序列

<400> 11

gggagtccgcagtctacga 19

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TWIST1 引子 – 反向序列

<400> 12

agaccgagaa gggcgtagct g 21

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β-Actin 引子 - 顺向序列

<400> 13

cgccaaccgc gagaagata 19

<210> 14

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β-Actin 引子 – 反向序列

<400> 14

cgtcccggag tccatc 16

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NYFA 引子 - 顺向序列

<400> 15

atcccagcag ccagtttggc ag 22

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NYFA 引子 – 反向序列

<400> 16

gaaaaatcgt ccttcaccac g 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CCND1 引子 - 顺向序列

<400> 17

ctggccatga actacctgga 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CCND1 引子 – 反向序列

<400> 18

gtcacacttg atcactctgg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EIF5 引子 - 顺向序列

<400> 19

tgcccactag gagaaaggtg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EIF5 引子 – 反向序列

<400> 20

cggactcacc tctggaatgt 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E2F6 引子 - 顺向序列

<400> 21

actgggtgtt cggaagaggc ga 22

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E2F6 引子 – 反向序列

<400> 22

ggggtgcggc cccaaagtt 19

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> POLR3H 引子 - 顺向序列

<400> 23

cattttcgct gcgtggtgtt tcatcc 26

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> POLR3H 引子 – 反向序列

<400> 24

aacttggctg gctgctgcag tg 22

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hTERT 引子 - 顺向序列

<400> 25

ggagcaagtt gcaaagcatt g 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hTERT 引子 – 反向序列

<400> 26

tcccacgacg tagtccatgt t 21

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCNA 引子 - 顺向序列

<400> 27

gccgagatct cagccatatt 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCNA 引子 – 反向序列

<400> 28

atgtacttag aggtacaaat 20

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GADD45B 引子 - 顺向序列

<400> 29

tgacaacgac atcaacatc 19

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GADD45B 引子 – 反向序列

<400> 30

gtgaccagag acaatgcag 19

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PIM1 引子 - 顺向序列

<400> 31

ggcgccgggc aaagagaagg ag 22

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PIM1 引子 – 反向序列

<400> 32

acccgaagtc gatgagtttg attt 24

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P16 引子 - 顺向序列

<400> 33

caacgcaccg aatagttacg 20

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P16 引子 – 反向序列

<400> 34

cagctcctca gccaggtc 18

1

Claims

1.一种用于非治疗目的的降低华顿氏凝胶干细胞中SA-β-gal的活性、增加华顿氏凝胶干细胞中SIRT1基因的表达以抗华顿氏凝胶干细胞老化的培养方法，包含以反式-肉桂醛（trans-cinnamaldehyde，TC）处理该华顿氏凝胶干细胞，其特征在于，是于干细胞培养液中以0.1至0.792微克／毫升的反式-肉桂醛处理华顿氏凝胶干细胞。

2.一种使用反式-肉桂醛于制造一制剂的用途，该制剂用于降低华顿氏凝胶干细胞中SA-β-gal的活性、增加华顿氏凝胶干细胞中SIRT1基因的表达以抗华顿氏凝胶干细胞老化，其特征在于，是于干细胞培养液中以0.1至0.792微克／毫升的反式-肉桂醛处理华顿氏凝胶干细胞。

3.根据权利要求2所述的用途，其中，该制剂是一药剂。

4.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于，该制剂是用于提升华顿氏凝胶干细胞的治疗效果。