JP2016202098A - マンネンタケ抽出物を用いた幹細胞の未分化状態維持剤及び増殖促進剤 - Google Patents

Abstract

【課題】 幹細胞を、未分化状態を維持させたまま増殖させることができる技術を提供することを目的とする。【解決手段】 マンネンタケ亜臨界水処理物又はその抽出物を有効成分として含有する幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤を発明した。すなわち、本発明は、再生医療や再生美容における、幹細胞の調製方法及び／又は幹細胞の未分化状態維持剤若しくは増殖促進剤としての利用が可能である。【選択図】 なし

Description

本発明は、幹細胞の未分化状態維持剤及び増殖促進剤並びに幹細胞の未分化状態維持方法及び増殖促進方法に関する。

脊椎動物（特に哺乳動物）の組織は、傷害若しくは疾患、又は加齢等に伴い細胞・臓器の損傷が起こった場合、再生系が働き、細胞・臓器の損傷を回復しようとする。この作用に、当該組織に備わる幹細胞（組織幹細胞、体性幹細胞）が大きな役割を果たしている。幹細胞は、あらゆる細胞・臓器に分化する多能性を有しており、この性質により細胞・臓器の損傷部を補うことで回復に導くと考えられている。このような幹細胞を応用した、次世代の医療である再生医療に期待が集まっている。

哺乳動物における幹細胞研究で最も進んでいる組織は骨髄である。骨髄には生体の造血幹細胞が存在しており、全ての血液細胞再生の源であることが明らかにされた。さらに骨髄には、造血幹細胞とは別に、その他の臓器・組織（例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪等）へ分化可能な幹細胞が包含されていることが報告されている（非特許文献１参照）。

さらに、近年、骨髄以外にも、皮膚、肝臓、膵臓、脂肪等、あらゆる臓器・組織に幹細胞が存在することが明らかにされ、各臓器・組織の再生及び恒常性維持を司っていることがわかってきた（非特許文献２〜５参照）。また、各組織に存在する幹細胞は可塑性に優れており、今まで自己複製が不可能であった臓器や組織の再生にも利用できる可能性がある。

一方で、これらの幹細胞のうちのいくつかは、加齢とともに減少することが知られており、各組織の恒常性維持のために幹細胞の減少を防ぐ技術の研究が積極的になされている（非特許文献６）。また、近年、幹細胞の能力（多能性）を、臓器や組織の再生へ応用するため、細胞移植治療や組織工学（再生医療や再生美容）の分野において幹細胞を生体組織から分離した後に培養し増殖させる技術の開発が進められている（非特許文献７、８）。

特に、幹細胞を生体外で培養する場合、幹細胞の能力である多能性を維持した状態、すなわち、未分化な状態を維持させたまま増殖させることが極めて重要である。もし、この培養時に幹細胞の未分化状態が維持できず分化誘導が進んでしまった場合、最終的に調製された幹細胞の能力（多能性）は失われていることになり、目的の効果（臓器や組織の再生等）を発揮できない。

以上より、幹細胞を細胞移植治療や組織工学（再生医療や再生美容）に利用し、臓器や組織の再生を望む場合、幹細胞を、未分化状態を維持させたまま培養できなければならない。

現在までに、幹細胞を、未分化状態を維持させたまま増殖させる技術について、幾つか報告があるが、未だ発展途上である。例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や造血幹細胞は、支持細胞（ストローマ細胞、又はフィーダー細胞）と共培養することで未分化を維持することができる（特許文献１及び非特許文献９〜１１参照）。しかしながら、最近になってフィーダー細胞由来の内在性ウイルスによる異種動物間の感染例が報告されており（非特許文献１２参照）、支持細胞を使用した幹細胞の培養は、医療用途を目的とした幹細胞の培養には適していない。

その他の方法に、サイトカインを複雑に組合せることによって幹細胞の未分化状態を維持させる方法がある。例えば、マウスＥＳ細胞は、ＬＩＦ（白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ））を培地に添加することによって、未分化性が維持される（特許文献２及び非特許文献１３参照）。その他、初期作用性サイトカイントロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ＦＬＴ−３リガンド、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下で、未分化性を維持させることが胚性幹細胞、体性幹細胞等で報告されている（特許文献３及び非特許文献１４参照）。

しかしながら、サイトカインは、高価であり、採取原料や保存性等の問題があり、容易な使用は難しい。加えて、ＬＩＦの効果は極めて特定の細胞系統に限定的であり、特に霊長類のＥＳ細胞や体性幹細胞においては、ＬＩＦの添加のみでは未分化状態を維持することができないことが明らかにされている（非特許文献１０参照）。

現在報告されている幹細胞の未分化状態の維持方法はいずれも、煩雑な操作を必要とし、また未分化状態の維持効果が低い。従って、幹細胞を再生医療に利用するために、幹細胞を、未分化状態を維持したまま増殖させる技術が求められていた。つまり、安全且つ簡便で効率的に、幹細胞を、未分化状態を維持させたまま増殖させることができる技術が求められていた。

特開２００４−２４０８９号公報 特表２００２−５２５０４２号公報 特許第３５７３３５４号公報

Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ Ｍ．Ｆ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９年， Ｖｏｌ． ２８４， ｐｐ． １４３−１４７ Ｇｏｏｄｅｌｌ Ｍ．Ａ．ら， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， １９９７年， Ｖｏｌ． ３， ｐｐ． １３３７−１３４５ Ｚｕｌｅｗｓｋｉ Ｈ．ら， Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ２００１年， Ｖｏｌ． ５０， ｐｐ． ５２１−５３３ Ｓｕｚｕｋｉ Ａ．ら， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ２０００年， Ｖｏｌ． ３２， ｐｐ． １２３０−１２３９ Ｚｕｋ Ｐ．Ａ．ら， Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２００１年， Ｖｏｌ． ７， ｐｐ． ２１１−２２８ 長谷川靖司，Ａｅｓｔｈｅｔｉｃ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ， ２０１３年， Ｖｏｌ． ２３， ｐｐ． １−１１ 馬渕 洋 他， 日本再生医療学会誌， ２００７年， Ｖｏｌ． ６， ｐｐ． ２６３−２６８ 北川 全 他， 日本再生医療学会誌， ２００８年，Ｖｏｌ． ７， ｐｐ． １４−１８ Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｊ．Ａ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９５年， Ｖｏｌ． ９２， ｐｐ． ７８４４−７８４８ Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｊ．Ａ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９８年， Ｖｏｌ． ２８２， ｐｐ． １１４５−１１４７ Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ Ｂ．Ｅ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ２０００年， Ｖｏｌ． １８， ｐｐ． ３９９−４０４ ｖａｎ ｄｅｒ Ｌａａｎ Ｌ．Ｊ．ら， Ｎａｔｕｒｅ， ２０００年， Ｖｏｌ． ４０７， ｐｐ． ９０−９４ Ｓｍｉｔｈ Ａ．Ｇ．ら， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， １９８７年， Ｖｏｌ． １２１， ｐｐ． １−９ Ｍａｄｌａｍｂａｙａｎ Ｇ．Ｊ．ら， Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．， ２００１年， Ｖｏｌ． １０， ｐｐ． ４８１−４９２

本発明は、上述した実情に鑑み、幹細胞を、未分化状態を維持させたまま、効率良く増殖させる方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、マンネンタケの亜臨界水処理物又はその抽出物が、幹細胞に対する優れた未分化状態維持効果と増殖促進効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）温度が１００〜３７４℃、且つ圧力が飽和蒸気圧以上の亜臨界状態にある水で処理したマンネンタケの亜臨界水処理物又はその抽出物を有効成分として含有する幹細胞の未分化状態維持剤。
（２）１００〜３７４℃、且つ圧力が飽和蒸気圧以上の亜臨界状態にある水で処理したマンネンタケの亜臨界水処理物又はその抽出物を有効成分として含有する幹細胞の増殖促進剤。
（３）幹細胞を、１００〜３７４℃、且つ圧力が飽和蒸気圧以上の亜臨界状態にある水で処理したマンネンタケの亜臨界水処理物又はその抽出物を含有する培地で培養する工程を含む、幹細胞の製造方法。
（４）幹細胞を、１００〜３７４℃、且つ圧力が飽和蒸気圧以上の亜臨界状態にある水で処理したマンネンタケの亜臨界水処理物又はその抽出物を含有する培地で培養する工程を含む、幹細胞の未分化状態維持方法。
（５）幹細胞を、１００〜３７４℃、且つ圧力が飽和蒸気圧以上の亜臨界状態にある水で処理したマンネンタケの亜臨界水処理物又はその抽出物を含有する培地で培養する工程を含む、幹細胞の増殖促進方法。
（６）請求項１又は２に記載の剤を含む、化粧品、医薬品、又は医薬部外品。
（７）請求項１又は２に記載の剤を含む、飲食品。

本発明によれば、幹細胞を、未分化状態を維持したまま、効率的に増殖させることができる。従って、本発明は、再生医療や再生美容の分野において大きく貢献できるものである。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤は、マンネンタケの亜臨界水処理物又はその抽出物を有効成分として含有する。

本発明に用いられるマンネンタケは、生薬「霊芝」に用いられる担子菌であり、マンネンタケ科（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｔａｃｅａｅ）、マンネンタケ属（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）に属する。また、マンネンタケ属のキノコについては、中国の薬学古書である「本草綱目」や「神農本草経」に赤霊芝（霊芝）、黒霊芝（黒芝）、紫霊芝（紫芝）、青霊芝（青芝）、黄霊芝（黄芝）及び白霊芝（白芝）が存在すると記載されている。赤霊芝の一種として、鹿角霊芝もあげられる。赤霊芝及び鹿角霊芝の学名は（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）であり、黒霊芝の学名は（Ｇ．ａｔｒｕｍ、Ｇ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｇ．ｓｉｎｅｎｓｅ）である。一般的には赤霊芝、鹿角霊芝、黒霊芝等が多く流通している。これらは広く中国や日本市場等で流通しているものを用いることができるし、自生品や栽培品を用いても良い。また、胞子や菌糸体の培養物も用いることができる。これらは乾燥や粉砕したものを用いることができる。

本発明に用いられる亜臨界水処理とは、所定温度及び圧力の条件下で亜臨界状態にした水と処理対象（本発明ではマンネンタケ）とを接触させることである。例えば、水は、圧力２２．１２ＭＰａ、温度３７４．１５℃まで上げると液体でも気体でもない状態を示す。この点を水の臨界点といい、臨界点より低い温度及び圧力の熱水を亜臨界水という。この亜臨界水は、誘電率低下とイオン積の向上により、優れた成分抽出作用と加水分解作用を有する。なお、亜臨界水処理に供給する水は、液体状態でも気体状態でも利用することができる。即ち、亜臨界水処理の処理槽へは、水蒸気を供給してもよく、水を供給してもよく、あるいはその両者を供給してもよい。亜臨界水処理時において、望まれる反応場としては気体よりも液体状態の方が反応は進みやすいので、密閉容器で強制的に液体の状態にした状態の水の使用が好ましい。より具体的には、金属やセラミックス等の耐圧容器にマンネンタケと処理剤である水を入れて、密閉状態にし、水の亜臨界状態（温度：１００℃以上、圧力：飽和蒸気圧以上）で、両者の接触を一定時間以上行うことで得られる処理物を亜臨界水処理物とすることができる。

本発明に用いられるマンネンタケ亜臨界水処理物とは、マンネンタケを亜臨界状態にある水によって処理したものであり、マンネンタケと水溶物（水溶液等）との混合物又はその乾燥物を含む。また、前記の混合物をろ過したろ液、又はその乾燥物を含む。

マンネンタケの亜臨界水処理温度は、マンネンタケの亜臨界水処理物又はその抽出物中に含まれる有効成分が効率的に得られやすくなるという理由から１００〜３００℃の間が好ましく、１２０〜２３０℃の間がより好ましく、１４０〜１８０℃の間がさらに好ましい。１００℃未満の場合は、有効成分の量が少なくなる傾向にある。また、亜臨界水処理の温度が３００℃を超える場合は、有効成分の過分解を引き起こしやすくなる。

マンネンタケの亜臨界水処理圧力は、各温度での飽和蒸気圧以上であれば良く、圧力０．１〜３．０ＭＰａの間がより好ましく、０．２６〜２．０ＭＰａの間がさらに好ましい。圧力０．１ＭＰａ未満の場合は、有効成分の量が少なくなる傾向にある。また、亜臨界水処理の圧力が、飽和蒸気圧を大きく上回るような過度の加圧には、別途加圧装置の追加及び設備の耐圧向上が必要となり、抽出の経済性が悪化する。

マンネンタケの亜臨界水処理時間は、５〜９０分の間で行うことが好ましく、１０〜３０分の間で行うことがより好ましい。５分未満の場合は、有効成分の量が少なくなる傾向にある。また、亜臨界水処理の時間が９０分を超える場合は、有効成分の過分解を引き起こしやすくなる。

すなわち、マンネンタケの亜臨界水処理条件としては、温度は１００〜３００℃、圧力は０．１〜３．０ＭＰａ、時間は５〜９０分で行うことが好ましい。この条件で行うことにより、マンネンタケの亜臨界水処理物の有効成分を向上させることができるのである。

本発明に用いられるマンネンタケ亜臨界水処理物の抽出物とは、前記の亜臨界水処理物に溶媒を加えて、抽出した抽出液又はその乾燥物を含む。

抽出に使用する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）等が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール及び液状多価アルコールが良く、特に好ましくは、水、エタノールが良い。これらの溶媒は１種でも２種以上を混合して用いても良く、例えば３０〜７０ｖ／ｖ％のエタノール水溶液を使用することもできる。また、上記抽出溶媒に酸やアルカリを添加して、ｐＨ調整した溶媒を使用することもできる。また、抽出方法としては、連続抽出、浸漬抽出、超臨界抽出、亜臨界水抽出等が挙げられる。亜臨界抽出条件としては、上記の亜臨界水処理と同一又は別条件にて更に亜臨界水抽出を行うことができる。

上述の溶媒を用いて、マンネンタケ亜臨界水処理物を溶媒抽出に供する。溶媒に対するマンネンタケの亜臨界水処理物の割合は、固形分に換算して、例えば１〜５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは５〜２５％（ｗ／ｗ）が挙げられる。例えば、マンネンタケ亜臨界水処理物の乾燥物に水を加え、９５〜１００℃における熱水抽出を行うことで、マンネンタケ亜臨界水処理物の抽出物を得ることができる。あるいは、マンネンタケ亜臨界水処理物の乾燥物に低級アルコール（例えば、エタノール等）又は液状多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等）を添加し、常温（例えば５〜３５℃）で抽出を行うことで、マンネンタケ亜臨界水処理物の抽出物を得ることができる。

マンネンタケ亜臨界水処理物又はその溶媒抽出物は、得られた溶液自体又は溶媒相自体をマンネンタケ亜臨界水処理物の抽出物とすることができる。あるいは、必要に応じて、得られた溶液自体又は溶媒相を、濃縮（減圧濃縮、膜濃縮等による濃縮）、希釈、濾過、乾燥等の処理及び活性炭等による脱色、脱臭処理等に供して、得られた生成物をマンネンタケ亜臨界水処理物の抽出物とすることができる。特に、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理に供し、得られた乾燥物をマンネンタケ亜臨界水処理物の抽出物として用いることが好ましい。

このようにして得られたマンネンタケ亜臨界水処理物又はその抽出物は、幹細胞の増殖時に分化が進行せず、生体レベルで又は培養レベルで未分化状態を維持させつつ幹細胞を効率的に増殖させる作用を有するので、幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤として使用できる。さらに、本発明の幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤は、幹細胞の未分化状態を維持しつつ効率的に増殖させるための細胞培養用添加剤、研究用試薬としても使用することができる。

本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤におけるマンネンタケ亜臨界水処理物又はその抽出物の配合量は、特に限定されないが、例えば、当該薬剤全量に対し、乾燥物に換算して０．００００１〜１０重量％であることが好ましく、０．０００１〜１重量％とすることがより好ましい。０．００００１重量％未満であると効果が十分に発揮されにくい場合がある。

本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤を、ヒトを含めた哺乳動物の幹細胞に適用することで、幹細胞の未分化状態を維持し、また幹細胞の増殖を促進することができる。本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤を適用する幹細胞としては、本発明の目的に沿うものであれば特に限定されず、例えば胚性の幹細胞（ＥＳ細胞）；骨髄、血液、皮膚（表皮、真皮、皮下組織）、脂肪、毛包、脳、神経、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉やその他の組織に存在する体性の幹細胞；遺伝子導入等により人工的に作製された幹細胞（人工多能性幹細胞：ｉＰＳ細胞）が挙げられる。好ましくは、本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤は、骨髄、血液、皮膚又は脂肪組織由来の幹細胞に対してより効果を発揮する。ＥＳ細胞としては、例えば、着床以前の初期胚を培養することによって樹立されたＥＳ細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立されたＥＳ細胞、及びそれらのＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したＥＳ細胞が挙げられる。このようなＥＳ細胞は、例えば、自体公知の方法によって作製することができるが、所定の機関より入手でき、さらには市販品を購入することもできる。また、これらの幹細胞は、初代培養細胞、継代培養細胞又は凍結細胞のいずれであってもよい。

さらに、本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤は、幹細胞の分化の方向性及び分化の過程等について同等の特性を持っていれば、全ての哺乳動物由来の幹細胞に応用が可能である。例えば、本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤は、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物の幹細胞に対して効果を発揮することができる。

本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤の幹細胞への適用は、生体外であっても生体内であってもよく、いずれの場合もその作用を発揮できる。従って、本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤は、その有効量を添加した幹細胞培養用培地にて幹細胞を培養することによって、又は、ヒトを含む哺乳動物に投与することによって、幹細胞の未分化状態を維持し、増殖を促進することができる。

本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤を生体内に投与する場合は、そのまま投与することも可能であるが、本発明の効果を損なわない範囲で適当な添加物とともに化粧品、医薬部外品、医薬品、飲食品等の各種組成物に配合して提供することができる。なお、本発明の医薬品には、動物に用いる薬剤、即ち獣医薬も包含されるものとする。

本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤は、有効成分であるマンネンタケ亜臨界水処理物又はその抽出物が優れた幹細胞の未分化状態維持作用及び増殖促進作用を有するので、皮膚、骨芽、軟骨、筋肉、神経、脂肪、肝臓等の生体内の組織又は臓器の幹細胞に作用して当該組織又は臓器の障害又は損傷を治療、改善、及び予防するのにも有効である。また、幹細胞は、加齢等に伴い減少又は機能低下することから、本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤は、上記生体内の組織又は臓器の幹細胞の減少や機能低下に関連する疾患を治療、改善、及び予防するのに有効である。ここで、組織又は臓器の障害又は損傷、幹細胞の減少や機能低下に関連する疾患としては、例えば、皮膚関連では、シワ、タルミ、シミ、くすみ、肌荒れ、皮膚の肥厚、毛穴のひらき、ニキビ痕、創傷、褥瘡、熱傷、瘢痕、ケロイド等が挙げられ、薄毛や脱毛等の頭皮や毛髪の損傷も含まれる。また、骨関連では、骨粗しょう症、骨折（脊椎圧迫骨折、大腿骨頚部骨折等）等、軟骨疾患では、変形性関節症、関節リウマチ、椎間板ヘルニア等、神経関連では、脊髄損傷、顔面神経麻痺、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、加齢に伴う記憶低下等、血液関連では、再生不良性貧血、白血病等、心血管関連では心筋梗塞、閉塞性動脈硬化症等、歯科関連では歯周病、歯槽膿漏による歯槽骨損傷等、眼科関連では、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、緑内障等、肝臓・膵臓関連では肝炎、肝硬変、糖尿病等が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤を化粧品や医薬部外品に配合する場合は、その剤形は、水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、粉末分散系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水−油二層系、又は水−油−粉末三層系等のいずれでもよい。また、当該化粧品や医薬部外品は、幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤とともに、皮膚外用組成物において通常使用されている各種成分、添加剤、基剤等をその種類に応じて選択し、適宜配合し、当分野で公知の手法に従って製造することができる。その形態は、液状、乳液状、クリーム状、ゲル状、ペースト状、スプレー状等のいずれであってもよい。配合成分としては、例えば、油脂類（オリーブ油、ヤシ油、月見草油、ホホバ油、ヒマシ油、硬化ヒマシ油等）、ロウ類（ラノリン、ミツロウ、カルナウバロウ等）、炭化水素類（流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、ワセリン等）、脂肪酸類（ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸等）、高級アルコール類（ミリスチルアルコール、セタノール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等）、エステル類（ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、トリオクタン酸グリセリン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ステアリン酸オクチル、ステアリン酸ステアリル等）、有機酸類（クエン酸、乳酸、α-ヒドロキシ酢酸、ピロリドンカルボン酸等）、糖類（マルチトール、ソルビトール、キシロビオース、N-アセチル-D-グルコサミン等）、蛋白質及び蛋白質の加水分解物、アミノ酸類及びその塩、ビタミン類、植物・動物抽出成分、種々の界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤、安定化剤、防腐剤、殺菌剤、香料等が挙げられる。

化粧品や医薬部外品の種類としては、例えば、化粧水、乳液、ジェル、美容液、一般クリーム、日焼け止めクリーム、パック、マスク、洗顔料、化粧石鹸、ファンデーション、おしろい、浴用剤、ボディローション、ボディシャンプー、ヘアシャンプー、ヘアコンディショナー、育毛剤等が挙げられる。

本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤を医薬品に配合する場合は、薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物と混合し、患部に適用するのに適した製剤形態の各種製剤に製剤化することができる。薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、その剤形、用途に応じて、適宜選択した製剤用基材や担体、賦形剤、希釈剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、安定化剤、保存剤、防腐剤、増量剤、分散剤、湿潤化剤、緩衝剤、溶解剤又は溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、噴射剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、香料等を適宜添加し、公知の種々の方法にて経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる各種製剤形態に調製すればよい。本発明の医薬品を上記の各形態で提供する場合、通常当業者に用いられる製法、たとえば日本薬局方の製剤総則［２］製剤各条に示された製法等により製造することができる。

本発明の医薬品の形態としては、特に制限されるものではないが、例えば錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、トローチ剤、顆粒剤、散剤、液剤、丸剤、乳剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤等の経口剤、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、座剤、軟膏剤、ローション剤、点眼剤、噴霧剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、貼付剤等の非経口剤等が挙げられる。また、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよく、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。

本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤を、前記皮膚関連の損傷や疾患を治療、改善、及び予防するための医薬品として用いる場合に適した形態は外用製剤であり、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、液剤、貼付剤等が挙げられる。軟膏剤は、均質な半固形状の外用製剤をいい、油脂性軟膏、乳剤性軟膏、水溶性軟膏を含む。ゲル剤は、水不溶性成分の抱水化合物を水性液に懸濁した外用製剤をいう。液剤は、液状の外用製剤をいい、ローション剤、懸濁剤、乳剤、リニメント剤等を含む。

本発明の医薬品は、上記疾患の発症を抑制する予防薬として、及び／又は、正常な状態に改善する治療薬として機能する。本発明の医薬品の有効成分は、天然物由来であるため、非常に安全性が高く副作用がないため、前述の疾患の治療、改善、及び予防用医薬として用いる場合、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ等の哺乳動物に対して広い範囲の投与量で経口的に又は非経口的に投与することができる。

本発明の化粧品、医薬品、医薬部外品における幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤の含有量は特に限定されないが、製剤（組成物）全重量に対して、マンネンタケ亜臨界水処理物又はその抽出物の乾燥固形分に換算して、０．００１〜３０重量％が好ましく、０．０１〜１０重量％がより好ましい。０．００１重量％以下では効果が低く、また３０重量％を超えても効果に大きな増強はみられにくい。上記の量があくまで例示であって、組成物の種類や形態、一般的な使用量、効能・効果等を考慮して適宜設定・調整すればよい。また、製剤化における有効成分の添加法については、予め加えておいても、製造途中で添加してもよく、作業性を考えて適宜選択すればよい。

また、本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤は、飲食品にも配合できる。また、本発明において、飲食品とは、一般的な飲食品のほか、医薬品以外で健康の維持や増進を目的として摂取できる食品、例えば、健康食品、機能性食品、保健機能食品、又は特別用途食品を含む意味で用いられる。健康食品には、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント等の名称で提供される食品を含む。保健機能食品は食品衛生法又は健康増進法により定義され、特定の保健の効果や栄養成分の機能、疾病リスクの低減等を表示できる、特定保健用食品及び栄養機能食品が含まれる。

飲食品の形態は、食用に適した形態、例えば、固形状、液状、顆粒状、粒状、粉末状、カプセル状、クリーム状、ペースト状のいずれであってもよい。特に、上記の健康食品等の場合の形状としては、例えば、タブレット状、丸状、カプセル状、粉末状、顆粒状、細粒状、トローチ状、液状（シロップ状、乳状、懸濁状を含む）等が好ましい。

飲食品の種類としては、茶飲料（緑茶、ウーロン茶、紅茶等）、清涼飲料（スポーツドリンク、ミネラルウォーター、ニア・ウォーター等）、炭酸飲料、乳飲料、コーヒー飲料、果汁・野菜汁入り飲料、栄養ドリンク、ゼリー飲料等の各種飲料、粉末スープ、菓子類（キャンディー、グミ、ガム、錠菓等）、麺類、パン類、乳製品、水産・畜産加工食品、油脂及び油脂加工食品等が挙げられるが、これらに限定はされない。

本発明の飲食品は、その種類に応じて通常使用される添加物を適宜配合してもよい。添加物としては、食品衛生法上許容されうる添加物であればいずれも使用できるが、例えば、ブドウ糖、ショ糖、果糖、異性化液糖、アスパルテーム、ステビア等の甘味料；クエン酸、リンゴ酸、酒石酸等の酸味料；デキストリン、デンプン等の賦形剤；結合剤、希釈剤、香料、着色料、緩衝剤、増粘剤、ゲル化剤、安定剤、保存剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。

本発明の飲食品が一般的な飲食品の場合は、その飲食品の通常の製造工程においてマンネンタケ亜臨界水処理物又はその抽出物を添加する工程を含めることによって製造することができる。また、健康食品の場合は、前記の医薬品の製造方法に準じればよく、例えば、タブレット状のサプリメントでは、マンネンタケ亜臨界水処理物又はその抽出物に、賦形剤等の添加物を添加、混合し、打錠機等で圧力をかけて成形することにより製造することができる。また、必要に応じてその他の材料（例えば、ビタミンＣ、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６等のビタミン類、カルシウム等のミネラル類、食物繊維等）を添加することもできる。

本発明の飲食品におけるマンネンタケ亜臨界水処理物又はその抽出物の配合量は、幹細胞の未分化状態維持効果と増殖促進効果を発揮できる量であればよいが、対象飲食品の一般的な摂取量、飲食品の形態、効能・効果、呈味性、嗜好性及びコスト等を考慮して適宜設定すればよい。

本発明はまた、幹細胞を、マンネンタケ亜臨界水処理物又はその抽出物を含有する培地で培養することで、幹細胞の未分化状態を維持させたまま、幹細胞増殖を促進する方法に関する。換言すれば、本発明に係る方法は、幹細胞を、マンネンタケ亜臨界水処理物又はその抽出物を含有する培地で培養する工程を含む、幹細胞の製造方法、幹細胞の未分化状態維持方法又は幹細胞の増殖促進方法ということができる。

本発明に係る方法において、幹細胞の培養には、幹細胞の未分化状態維持及び増殖のために一般的に使用されている培地を用いればよい。例えば、幹細胞の生存及び増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、脂肪酸）を含む基本培地、具体的には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）、ハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）等が挙げられる。また、培地に、増殖因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及び／又は白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）を添加してもよい。さらに、必要に応じて、培地は、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ビタミン類、インターロイキン類、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ２７−サプリメント、Ｎ２−サプリメント、ＩＴＳ−サプリメント、抗生物質等を含有してもよい。

また、上記以外には、１〜２０％の含有率で血清が培地に含まれることが好ましい。しかしながら、血清はロットの違いにより成分が異なり、その効果にバラツキがあるため、ロットチェックを行った後に使用することが好ましい。

市販品の培地としては、インビトロジェン製の間葉系幹細胞基礎培地や、三光純薬製の間葉系幹細胞基礎培地、ＴＯＹＯＢＯ社製のＭＦ培地、Ｓｉｇｍａ社製のハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）等を用いることができる。

幹細胞の培養に用いる培養器は、幹細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、シャーレ、ディッシュ、プレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バッグ、ローラーボトル等が挙げられる。

培養器は、細胞非接着性であっても接着性であってもよく、目的に応じて適宜選択される。細胞接着性の培養器は、細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス等による細胞支持用基質等で処理したものを用いてもよい。細胞外基質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン等が挙げられる。

幹細胞培養に使用される培地に対するマンネンタケ亜臨界水処理物又はその抽出物の添加濃度は、上述の本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤におけるマンネンタケ亜臨界水処理物又はその抽出物の含有量に準じて適宜決定することができるが、固形分に換算して、例えば１０〜１０００００μｇ／ｍＬ、好ましくは１００〜１００００μｇ／ｍＬの濃度が挙げられる。また、幹細胞の培養期間中、マンネンタケ亜臨界水処理物又はその抽出物を、定期的に培地に添加してもよい。

幹細胞の培養条件は、幹細胞の培養に用いられる通常の条件に従えばよく、特別な制御は必要ではない。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約３０〜４０℃、好ましくは３６〜３７℃である。ＣＯ_２ガス濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約２〜５％である。なお、培地の交換は２〜３日に１回行うことが好ましく、毎日行うことがより好ましい。前記培養条件は、幹細胞が生存及び増殖可能な範囲で適宜変動させて設定することもできる。

幹細胞の未分化状態維持は、例えば、本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤の非存在下で培養した幹細胞と比較して、本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤の存在下で培養した該幹細胞において幹細胞未分化マーカー遺伝子の発現レベルがｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで培養開始時の発現レベルと同程度のレベルに有意に維持されているか否かで評価することができる。幹細胞未分化マーカー遺伝子としては、例えばＣＤ４４遺伝子（Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ． ２００２ Ｄｅｃ；１３（１２）：４２７９−９５． Ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｉｓ ａ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．）等が挙げられる。

幹細胞未分化マーカー遺伝子発現レベルの測定方法としては、ｍＲＮＡレベルでは、例えば幹細胞未分化マーカー遺伝子に特異的なプライマーやプローブを用いたＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲやノーザンブロッティング等の方法が挙げられ、また、タンパク質レベルでは、例えば幹細胞未分化マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的な抗体を用いた免疫染色、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング等の免疫学的方法が挙げられる。

発現レベルの測定の結果、培養開始時（１００％未分化状態）の幹細胞における幹細胞未分化マーカー遺伝子の発現レベルと本発明の幹細胞の未分化状態維持剤の存在下で所定時間培養後の幹細胞における幹細胞未分化マーカー遺伝子の発現レベルとの相対比が、本発明の幹細胞の未分化状態維持剤の非存在下で培養した場合の同相対比（コントロール）よりも大きい場合に幹細胞の未分化状態を維持できたと判定することができる。

また、幹細胞の増殖促進は、例えば、本発明に係る幹細胞の増殖促進剤の非存在下で培養した幹細胞と比較して、本発明に係る幹細胞の増殖促進剤の存在下で培養した該幹細胞の細胞数が有意に増加されているか否かで評価することができる。細胞数の測定は、例えば、ＭＴＴ法やＷＳＴ法等により、市販の細胞数測定キットを用いて行うことができる。測定の結果、培養開始時の幹細胞の細胞数と本発明の幹細胞の増殖促進剤の存在下で所定時間培養後の幹細胞の細胞数との相対比が、本発明の幹細胞の増殖促進剤の非存在下で培養した場合の同相対比（コントロール）よりも大きい場合に幹細胞の増殖を促進できたと判定することができる。

上記の本発明に係る方法により調製された幹細胞は移植材料（細胞移植剤）として用いることができ、従来の骨髄移植又は臍帯血移植と同一の方法で実施できる。

上記の本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤あるいは本発明に係る方法に準じて、マンネンタケ亜臨界水処理物又はその抽出物を、単独で、あるいは培地と別々に又は培地と混合し、幹細胞の未分化状態維持又は増殖促進のための試薬キットとして提供することもできる。当該キットは、必要に応じて取扱い説明書等を含むことができる。あるいは、マンネンタケ亜臨界水処理物又はその抽出物を、培地と混合し、幹細胞の未分化状態維持又は増殖促進用培地として提供することもできる。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

[実施例１]マンネンタケ亜臨界水処理物及びその抽出物
（１）マンネンタケ亜臨界水処理物
製造例１
亜臨界水処理缶に、マンネンタケ原料として赤霊芝 ４５ｇを入れ、処理温度：１４０℃、処理圧力：０．３７ＭＰａ、処理時間：１０分間で亜臨界水処理を行った（亜臨界水処理条件＃１）。亜臨界水処理の終了後、処理缶内の処理物を凍結乾燥させることでマンネンタケ亜臨界水処理物１を４３．２ｇ得た。

製造例２〜製造例１５（マンネンタケ亜臨界水処理物２〜１５）については、表１に示した製造例の条件一覧に示したマンネンタケ原料、処理温度、処理圧力、処理時間とした以外は、製造例1と同様に行った。また、製造例２〜製造例１５の回収量については表１に示した。

（２）マンネンタケ亜臨界水処理物の抽出物
製造例１６Ａ 熱水抽出物
マンネンタケ亜臨界水処理物１（製造例１）１０ｇに、精製水２００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した。濾過した後、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して熱水抽出物を得た。

製造例１６Ｂ ５０％エタノール抽出物
マンネンタケ亜臨界水処理物１（製造例１）１０ｇに、５０％エタノール水溶液を２００ｍＬ加え、一昼夜抽出した。濾過した後、その濾液を減圧濃縮し、凍結乾燥することにより、５０％エタノール抽出物を得た。

製造例１６Ｃ エタノール抽出物
マンネンタケ亜臨界水処理物１（製造例１）１０ｇに、エタノールを２００ｍＬ加え、一昼夜抽出した。濾過した後、その濾液を減圧濃縮し、凍結乾燥することにより、エタノール抽出物を得た。

製造例２〜１５を用いて、上記の製造例１６Ａ〜１６Ｃと同様にマンネンタケ亜臨界水処理物の抽出物（製造例１７Ａ〜３０Ｃ）を製造した（表２）。

製造例３１ マンネンタケ亜臨界水処理物１６
亜臨界水処理缶に、マンネンタケ原料として赤霊芝 ４５ｇを入れ、処理温度：１４０℃、処理圧力：０．２６ＭＰａ、処理時間１０分間で亜臨界水処理を行った。亜臨界水処理の終了後、処理缶内の処理物をろ過した後、そのろ液を濃縮し、凍結乾燥してマンネンタケ亜臨界水処理物１６を２．４ｇ得た。

製造例３２ マンネンタケ亜臨界水処理物１７
亜臨界水処理缶に、マンネンタケ原料として黒霊芝 ４５ｇを入れ、処理温度：１４０℃、処理圧力：０．２６ＭＰａ、処理時間１０分間で亜臨界水処理を行った。亜臨界水処理の終了後、処理缶内の処理物をろ過した後、そのろ液を濃縮し、凍結乾燥してマンネンタケ亜臨界水処理物１７を２．２ｇ得た。

製造例３３ マンネンタケ亜臨界水処理物１８
亜臨界水処理缶に、マンネンタケ原料として赤霊芝胞子 ４５ｇを入れ、処理温度：１４０℃、処理圧力：０．２６ＭＰａ、処理時間１０分間で亜臨界水処理を行った。亜臨界水処理の終了後、処理缶内の処理物をろ過した後、そのろ液を濃縮し、凍結乾燥してマンネンタケ亜臨界水処理物１８を４．１ｇ得た。

比較製造例１ 赤霊芝の熱水抽出物
赤霊芝１００ｇに、精製水２Ｌを加え、９５〜１００℃で５分抽出した。濾過した後、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して赤霊芝の熱水抽出物４．４ｇを得た。

比較製造例２ 黒霊芝の熱水抽出物
黒霊芝１００ｇに、精製水２Ｌを加え、９５〜１００℃で５分抽出した。濾過した後、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して黒霊芝の熱水抽出物４．２ｇを得た。

比較製造例３ 赤霊芝胞子の５０％エタノール抽出物
赤霊芝胞子１００ｇに、５０％エタノール水溶液を２Ｌ加え、一昼夜抽出した。濾過した後、その濾液を減圧濃縮し、凍結乾燥することにより、赤霊芝胞子の５０％エタノール抽出物３．４ｇを得た。

[実施例２]マンネンタケ亜臨界水処理物の抽出物の幹細胞に対する未分化状態維持効果及び増殖促進効果の評価
以下に、実施例１において製造したマンネンタケ亜臨界水処理物の抽出物を用いた、幹細胞に対する未分化状態維持効果及び増殖促進効果の実験例とその結果を示す。

（実験例１）幹細胞に対する未分化状態維持効果の評価
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ培養液（Ｓｉｇｍａ社製）にウシ胎児血清（ＦＢＳ、１％、Ｓｉｇｍａ社製）、ＩＴＳ−Ｘ（１００倍希釈、ＧＩＢＣＯ社製）、Ｈｙｄｏｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎ（０．４μｇ／ｍＬ、ＳＩＧＭＡ社製）を加えて調製した培地を用いて、ヒト成体幹細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を２４ｗｅｌｌディッシュに５ｘ１０^４個播種し、各抽出物（比較製造例１、製造例１６Ａ、製造例１７Ａ）を最終濃度が６２５μｇ／ｍＬになるように培地に添加し、３日間培養を続けた。なお、陽性対照としてＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｋ社製）を用いた。

培養３日後に、細胞をＰＢＳ（−）にて２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを加え、室温で１０分間インキュベーションして細胞を固定した。固定後、細胞をＰＢＳ（−）にて２回洗浄し、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、和光純薬工業社製）含有ＰＢＳ（−）に抗ＣＤ４４抗体（２００倍希釈、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加した一次抗体溶液を加え、３７℃で１時間インキュベーションした。次に、２次抗体Ａｌｅｘａ４８８（５００倍希釈、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）で３７℃６０分間反応させた。細胞をＰＢＳ（−）にて２回洗浄し、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）を用いて観察し、ＣＤ４４の発現を緑色の蛍光として画像を撮影した。取得した画像について、市販の解析ソフトを用いてＣＤ４４の相対発現量（１００μｍ^２あたりの蛍光強度）を算出した。試料を添加せずに培養した細胞におけるＣＤ４４の相対発現量を１とし、これに対し、試料を添加して培養した細胞におけるＣＤ４４の相対発現量の値を算出し、評価した。結果を表３に示す。

表３に示すように、赤霊芝亜臨界水処理物の抽出物（製造例１６Ａ及び１７Ａ）に、顕著な幹細胞の未分化状態維持効果が認められた。また、黒霊芝亜臨界水処理物及び赤霊芝胞子亜臨界水処理物の抽出物についても同様の効果が確認された。以上より、マンネンタケ亜臨界水処理物の抽出物の極めて優れた幹細胞の未分化状態維持効果を明らかにした。なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性の幹細胞（ＥＳ細胞）についても同様な試験を行ったところ、顕著な幹細胞の未分化状態維持効果が認められた。また、マンネンタケの亜臨界水処理物（製造例３１〜３３）についても同様に優れた幹細胞の未分化状態維持効果を示した。

（実験例２）幹細胞に対する増殖促進効果の評価
ヒト幹細胞培養液（東洋紡社製）を用いて培養したヒト成体幹細胞（東洋紡社製）を、６ｃｍディッシュに３×１０^５個播種し、各抽出物の最終濃度が、製造例１６Ａ〜２０Ａ及び比較製造例１は６２５μｇ／ｍＬ、製造例２１Ａ、製造例２２Ａ及び比較製造例２は１２５０μｇ／ｍＬ、製造例２６Ｂ、製造例２８Ｂ及び比較製造例３は１５６．２５μｇ／ｍＬになるように添加し、３日間培養を続けた。

３日間の培養後、細胞をＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、ラバーポリスマンにて集め、それぞれの細胞数をカウントした。

抽出物未添加時の総細胞数をコントロールとし、コントロールを１００（％）とした場合の、各抽出物（製造例１６Ａ〜２２Ａ、２６Ｂ、２８Ｂ及び比較製造例１〜３）添加時の細胞数の増減（％）を算出し、幹細胞増殖促進効果の評価を行った。これらの試験結果を以下の表４に示す。

表４に示すように、マンネンタケ亜臨界水処理物の抽出物（製造例１６Ａ〜２２Ａ、２６Ｂ及び２８Ｂ）全てに、顕著な幹細胞増殖促進効果が認められた。特に亜臨界水処理条件＃２〜＃５による処理物の抽出物（製造例１７Ａ〜２０Ａ）において、強い幹細胞増殖促進効果が認められた。なお、上述のコントロールの値を１００％とした場合、培養開始時のヒト成体幹細胞数は、２７％であった。以上より、マンネンタケ亜臨界水処理物の抽出物の極めて優れた幹細胞増殖促進効果を明らかにした。なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性の幹細胞（ＥＳ細胞）についても同様な試験を行ったところ、顕著な幹細胞増殖促進効果が認められた。また、マンネンタケの亜臨界水処理物（製造例３１〜３３）についても同様に優れた幹細胞の増殖促進効果を示した。

以上に示すように、マンネンタケ亜臨界水処理物又はその抽出物を幹細胞に適用することで、従来の技術に比べて、簡便且つ効率的に、未分化状態を維持させたまま幹細胞の増殖を促進させることが可能になった。

[実施例３]製品の処方例
マンネンタケ亜臨界水処理物の抽出物を配合した製品の処方例を以下に示す。
（処方例１）ローション
処方 配合量（重量％）
１．赤霊芝亜臨界水処理物の熱水抽出物（製造例１６Ａ） ０．１
２．１，３−ブチレングリコール ８．０
３．グリセリン ２．０
４．キサンタンガム ０．０２
５．クエン酸 ０．０１
６．クエン酸ナトリウム ０．１
７．エタノール ５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１０．香料 ０．１
１１．精製水 残量

成分１〜６及び１１と、成分７〜１０をそれぞれ均一に溶解した後、両者を混合し濾過しローションを調製する。

（処方例２） クリーム
処方 配合量（重量％）
１．黒霊芝亜臨界水処理物の熱水抽出物（製造例２１Ａ） ０．１
２．スクワラン ５．５
３．オリーブ油 ３．０
４．ステアリン酸 ２．０
５．ミツロウ ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ベヘニルアルコール １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１０．香料 ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１２．パラオキシ安息香酸エチル ０．０５
１３．１，３−ブチレングリコール ８．５
１４．精製水 残量

成分２〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。次いで、油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、さらに３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例３）乳液
処方 配合量（重量％）
１．赤霊芝胞子亜臨界水処理物の熱水抽出物（製造例２６Ａ） ０．１
２．スクワラン ５．０
３．オリーブ油 ５．０
４．ホホバ油 ５．０
５．セタノール １．５
６．モノステアリン酸グリセリン ２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
９．香料 ０．１
１０．プロピレングリコール １．０
１１．グリセリン ２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１３．精製水 残量

成分２〜８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１０〜１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、さらに３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例４）ゲル剤
処方 配合量（重量％）
１．赤霊芝亜臨界水処理物の５０％エタノール抽出物（製造例１６Ｂ） ０．１
２．エタノール ５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
５．香料 適量
６．１，３−ブチレングリコール ５．０
７．グリセリン ５．０
８．キサンタンガム ０．１
９．カルボキシビニルポリマー ０．２
１０．水酸化カリウム ０．２
１１．精製水 残量

成分２〜５と、成分１及び６〜１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。

（処方例５）軟膏
処方 配合量（重量％）
１．黒霊芝亜臨界水処理物の５０％エタノール抽出物（製造例２１Ｂ） ２．０
２．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．） ２．０
３．モノステアリン酸グリセリン １０．０
４．流動パラフィン ５．０
５．セタノール ６．０
６．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
７．プロピレングリコール １０．０
８．精製水 残量

成分２〜５を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び６〜８を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化し、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例６）パック
処方 配合量（重量％）
１．赤霊芝胞子亜臨界水処理物の５０％エタノール抽出物（製造例２６Ｂ）０．１
２．ポリビニルアルコール １２．０
３．エタノール ５．０
４．１，３−ブチレングリコール ８．０
５．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
６．パラオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．） ０．５
７．クエン酸 ０．１
８．クエン酸ナトリウム ０．３
９．香料 適量
１０．精製水 残量

成分１〜１０を均一に溶解し製品とする。

（処方例７）錠剤
処方 配合量（重量％）
１．赤霊芝亜臨界水処理物のエタノール抽出物（製造例１６Ｃ） １．０
２．乾燥コーンスターチ ２５．０
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム ２０．０
４．微結晶セルロース ４０．０
５．ポリビニルピロリドン ７．０
６．タルク ３．０

成分１〜５を混合し、次いで１０％の水を結合剤として加えて、押出し造粒後乾燥する。成形した顆粒に成分６を加えて混合し打錠する。１錠０．５２ｇとする。

（処方例８）飲料
処方 配合量（重量％）
１．黒霊芝亜臨界水処理物のエタノール抽出物（製造例２１Ｃ） ０．１
２．ステビア ０．０５
３．リンゴ酸 ５．０
４．香料 ０．１
５．精製水 残量

成分１〜４を成分５の一部の精製水に撹拌溶解する。次いで、成分５の残りの精製水を加えて混合し、９０℃に加熱して５０ｍＬのガラス瓶に充填する。

本発明の活用例として、再生医療や再生美容への応用が期待される。例えば、本発明を利用することで、再生医療や再生美容に用いる未分化状態の幹細胞を簡便に効率良く調製することが可能となる。さらに、幹細胞の移植後又は組織に存在する幹細胞に対して、本発明に係るマンネンタケ亜臨界水処理物又はその抽出物を、直接的に注入するか又は経口投与、塗布、貼付等により適用することで、該幹細胞を、未分化状態を維持させたまま増殖させることが可能である。

すなわち、本発明は、再生医療や再生美容における、幹細胞の調製方法及び／又は幹細胞の未分化状態維持剤若しくは増殖促進剤としての利用が可能である。

Claims (7)

1. 温度が１００〜３７４℃、且つ圧力が飽和蒸気圧以上の亜臨界状態にある水で処理したマンネンタケの亜臨界水処理物又はその抽出物を有効成分として含有する幹細胞の未分化状態維持剤。
2. 温度が１００〜３７４℃、且つ圧力が飽和蒸気圧以上の亜臨界状態にある水で処理したマンネンタケの亜臨界水処理物又はその抽出物を有効成分として含有する幹細胞の増殖促進剤。
3. 幹細胞を、温度が１００〜３７４℃、且つ圧力が飽和蒸気圧以上の亜臨界状態にある水で処理したマンネンタケの亜臨界水処理物又はその抽出物を含有する培地で培養する工程を含む、幹細胞の製造方法。
4. 幹細胞を、温度が１００〜３７４℃、且つ圧力が飽和蒸気圧以上の亜臨界状態にある水で処理したマンネンタケの亜臨界水処理物又はその抽出物を含有する培地で培養する工程を含む、幹細胞の未分化状態維持方法。
5. 幹細胞を、温度が１００〜３７４℃、且つ圧力が飽和蒸気圧以上の亜臨界状態にある水で処理したマンネンタケの亜臨界水処理物又はその抽出物を含有する培地で培養する工程を含む、幹細胞の増殖促進方法。
6. 請求項１又は２に記載の剤を含む、化粧品、医薬品、又は医薬部外品。
7. 請求項１又は２に記載の剤を含む、飲食品。