CN111009288A - 一种cebpa基因的探针设计方法及其应用 - Google Patents

一种cebpa基因的探针设计方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CEBPA基因的探针设计方法及其应用，针对CEBPA基因的编码序列，按照序列反向互补的原则，以rs762459325位点为中心向两侧每隔20bp平铺设计长度为120bp的探针序列；并结合cosmic数据库，对以上得到的探针序列进行优化得到优选的探针序列。同时公开了由该探针序列构建的DNA探针文库以及用于CEBPA基因突变的检测试剂，并公开了CEBPA基因突变的检测方法。本申请对CEBPA基因突变的检测具有较高的灵敏度和检出率，能够达到国际报道水平，其对血液肿瘤患者疾病诊断提供了一种可靠的途径，具有一定的市场推广经济价值。

Description

一种CEBPA基因的探针设计方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种CEBPA基因的探针设计方法及其应用。
背景技术
CEBPA基因突变在急性髓系白血病（AML）中发生率约为10-15%（PMID:21177436）。2017年欧洲血液病网络（ELN）、2019年美国国立综合癌症网络（NCCN）、成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病）中国诊疗指南（2017年版，中华血液学杂志, 2017,38(3) :177-182)AML预后分层指南提示：CEBPA双突变AML患者采用化疗治疗预后较好属于低危组。此外，2016世界卫生组织（WHO）新增髓系肿瘤伴胚系易感基因变异亚型，CEBPA胚系易感基因变异属于其中之一。因此，CEBPA双突变检测在血液肿瘤精准医疗中具有重要的临床应用意义。
CEBPA基因位于染色体19q13.11，该基因仅有1个外显子，开放阅读框全长1077bp，GC含量高达74.7%。CEBPA基因主要分为三个区域，分别是TAD1区、TAD2区和bZIP区，其突变主要发生在靠近N端的TAD1区和C端的bZIP区。当前国内外CEBPA基因突变主要检测方法仍然以一代sanger测序为主，即以脱氧核糖核酸（DNA）为检测对象，采用PCR结合一代测序的方法检测（《二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识（2018）版》解读，临床血液学杂志，2019年32卷5期，341-347），用于检测CEBPA基因突变的引物及检测方法（授权公布号：CN107841538A），一种检测人类基因CEBPA的PCR引物及检测方法（授权公布号：CN108220411A）。一代测序检测CEBPA的局限性在于检测灵敏度不高，仅10-20%左右。随着高通量测序技术的发展，2018年Ng CWS等人公开了高通量测序检测CEBPA突变的方法，该方法首先利用PCR扩增的方法把CEBPA基因进行扩增，扩增后产物使用Miseq测序仪进行检测，该技术能够很好的检测CEBPA基因rs762459325单核苷酸多态性（c.584_589dupACCCGC/p.His195_Pro196dup）（PMID: 29180507）。但是该文献没有公布CEBPA扩增引物序列。并且由于CEBPA基因GC含量较高，同时该技术方法也仅能够检测CEBPA一个基因。随着血液肿瘤精准医疗的不断发展，血液肿瘤患者需要进行突变检测的基因也越来越多（中华血液学杂志, 2017,38(3) : 177-182)）。二代测序根据测序原理分为扩增子建库和探针捕获建库。由于CEBPA基因GC含量较高，当该基因同其它基因同时扩增和检测，往往由于GC含量较高扩增效率低导致最终测序结果中CEBPA基因的测序深度不是很好，需要单的扩增。探针捕获法的优势在于对高GC含量区域有比较好的捕获效率，可以同其它基因探针放在一个反应体系中进行捕获和后续测序。但是，目前没有其它文献公开CEBPA基因探针设计方法和探针序列，并且也没有利用探针捕获方法对CEBPA基因rs762459325单核苷酸多态性检测进行性能确认。
发明内容
本发明的目的是建立一种CEBPA基因探针设计方法，该方法以DNA为样本来源，通过本发明设计的探针序列，能够有效捕获CEPBA基因正常和突变序列，通过高通量测序的方法进行检测。本发明设计的探针同时能够很好的捕获CEBPA基因单核苷酸多态性rs762459325，并且当患者在rs762459325附近发生突变时候也能够检测。同时，本发明设计的探针能够和其它基因探针放在一起使用，即通过一个反应就能同时检测CEBPA基因突变和其它基因突变的情况，具有很高的应用价值。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种CEBPA基因的探针设计方法，包括以下步骤：
（1）针对CEBPA基因的编码序列，按照序列反向互补的原则，以rs762459325位点为中心向两侧每隔20bp平铺设计长度为120bp的探针序列；
（2）结合cosmic数据库，对步骤（1）得到的探针序列进行优化，优化原则为：当探针序列前6个碱基内cosmic数据库报道具有6个碱基以上移码突变，探针序列优化位移至报道突变位点两侧。保证该处位置发生移码突变时具有更好的捕获效率。
采用以上所述的探针设计方法得到的探针序列，所述的探针序列如SEQ ID NO.1- SEQ ID NO .55所示。
使用以上所述的探针序列制备的DNA探针文库。
以上所述的DNA探针文库在制备CEBPA基因突变检测试剂中的应用。
一种CEBPA基因突变的检测试剂，所述的检测试剂包含以上所述的DNA探针文库。
一种检测受试者CEBPA基因突变的方法，包括以下步骤：
（1）提取所述受试者的基因组DNA，将其打断至200-220bp的范围；
（2）对上述打碎的基因组DNA进行DNA小片段文库的制备；
（3）将DNA小片段文库和权利要求3的DNA探针文库或包含权利要求3的DNA探针文库杂交，进行基因的捕获；
（4）对步骤（3）捕获的目的基因进行测序，得到所述基因的测序数据；
（5）将步骤（4）的测序数据与参考基因组进行比对，从而得出目的基因的突变情况。
有益效果：本发明公开了一种CEBPA基因的探针设计方法及其应用，其有益效果主要体现在以下几个方面：
（1）社会效果：利用本发明设计的CEBPA基因探针序列能够有效检测CEBPA基因突变，对血液肿瘤患者疾病诊断和危险度分层提供有力证据，为国内血液肿瘤患者精准医疗发展提供有效技术支持，具有一定的社会效果。
（2）经济效果：利用本发明设计的CEBPA基因探针序列，CEBPA基因突变能够和其它基因同时检测，降低血液肿瘤患者多个基因突变同时检测成本，具有一定的市场推广经济价值。
（3）技术效果：利用本发明设计的CEBPA基因探针序列，能够保证CEBPA突变检出率，达到国际报道水平。
附图说明
图1 为CEBPA基因探针序列的分布图。
图2 为CEBPA基因探针序列的设计思路图。
图3 为实施例1的检测结果分析图。
图4 为实施例2的检测结果分析图。
图5 为实施例3中p.Ala44fs突变的检测结果分析图。
图6为实施例3中p.Glu316delinsAspGln突变的检测结果分析图。
图7 为实施例4的检测结果分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明的探针设计思路如下：与传统提高探针特异性、捕获效率的探针设计思路不同，本发明主要目的是保证CEBPA基因探针对CEBPA基因突变型DNA序列的捕获效率，保证CEBPA基因突变的检出率和检测灵敏度。当前国际上公认探针长度为120bp探针的特异性和捕获效率相对达到最佳。因此本发明以120bp的DNA探针为准。
申请人前期通过检索CEBPA基因突变文献发现，CEBPA基因在rs762459325附近发生基因突变较少，突变主要发生在rs762459325两侧（PMID: 11242107，14726504，15575056），因此本发明以CEBPA基因rs762459325单核苷酸为中心，平均每隔20bp向两侧平铺设计探针。
目前国际上公认120bp探针进行捕获，当目标序列与探针序列发生6个碱基以上错配，探针捕获效率会下降。为了保证设计探针对CEBPA突变类型的最大捕获效率，结合cosmic数据库，对得到的探针序列进行优化。优化原则为：当探针前6个碱基内cosmic数据库报道具有6个碱基以上移码突变，探针序列优化位移至报道突变位点两侧，保证该处位置发生移码突变时候有更好的捕获效率。CEBPA基因探针组合分布图以及基因探针设计思路图分别如图1和图2所示。
采用本发明公开的CEBPA基因探针设计思路，经过一次探针设计就能得到CEBPA基因探针序列，并且通过实例验证对rs762459325突变和CEBPA基因突变有很好的检出率。
替代组成：不排除在探针加密的情况下和其它情况下具有相同的检出率。但是根据现有技术公开的情况，目前还没有针对CEBPA基因rs762459325突变检出率探针设计方法的公开，并且本申请所述的CEBPA探针序列能够和其它基因探针组合在一起同时检测CEBPA基因和其它基因突变。
通过本发明所述方法设计的探针序列对CEBPA基因突变的检测效果如以下实施例所示。
实施例1
检测目的DNA：CEBPA基因含有rs762459325杂合阳性DNA标本和rs762459325阴性细胞株K562。
探针：本发明设计的如SEQ ID NO .1- SEQ ID NO .55所示的探针序列组合。
DNA超声打断：Covaris M220，打断至200-220bp范围。
建库试剂盒：kapa hyper Prep kit。
建库实验步骤：参考kapa建库试剂盒说明书。
CEBPA基因测序结果覆盖度：100%（rs762459325阳性标本），100%（rs762459325阴性标本）。
CEBPA基因测序结果平均测序深度：1928层（rs762459325阳性标本），1867层（rs762459325阴性标本）。
位点检测结果：数据分析结果bam文件采用IGV软件进行分析如图3所示，图3A为rs762459325阳性标本检测结果，图3B为rs762459325阴性标本检测结果。
实施例2
检测目的DNA：含有1%比例rs762459325变异DNA（rs762459325杂合变异标本测定浓度后与rs762459325阴性K562细胞株DNA按比例混匀，得到1%比例阳性对照标本）。
探针：本发明设计探针序列同其它85个基因基因探针序列组合。
DNA超声打断：Covaris M220，打断至200-220bp范围。
建库试剂盒：kapa hyper Prep kit。
建库实验步骤：参考kapa建库试剂盒说明书。
CEBPA测序结果覆盖度：100%。
CEBPA测序结果平均测序深度：2319层。
位点检测结果：数据分析结果bam文件采用IGV软件进行分析如图4所示。
实施例3
检测目的DNA：经一代测序检测CEBPA基因p.Ala44fs和p.Glu316delinsAspGln双突变阳性标本。
探针：本发明设计探针序列同其它85个基因基因探针序列组合。
DNA超声打断：Covaris M220，打断至200-220bp范围。
建库试剂盒：kapa hyper Prep kit。
建库实验步骤：参考kapa建库试剂盒说明书。
CEBPA测序结果覆盖度：100%。
CEBPA测序结果平均测序深度：1754层。
位点检测结果：数据分析结果bam文件采用IGV软件进行分析p.Ala44fs突变结果如图5所示，p.Glu316delinsAspGln突变结果如图6所示。
实施例4
检测目的DNA：化疗后随访DNA标本（初诊CEBPA基因p.Ala240fs突变阳性，同时伴随rs762459325突变患者，该化疗后随访DNA标本经一代测序检测p.Ala240fs突变为阴性）。
探针：本发明设计探针序列同其它85个基因基因探针序列组合。
DNA超声打断：Covaris M220，打断至200-220bp范围。
建库试剂盒：kapa hyper Prep kit。
建库实验步骤：参考kapa建库试剂盒说明书。
CEBPA测序结果覆盖度：100%。
CEBPA测序结果平均测序深度：1995层。
位点检测结果：数据分析结果bam文件采用IGV软件进行分析p.Ala240fs突变结果约2.9%，检测CEBPA突变结果同初诊突变类型一致，如图7所示。
将以上实施例所得到的实验结果总结如下：
实施例1：说明本申请设计的探针序列能够检测rs762459325突变；
实施例2：说明本申请设计的探针序列能够检测1%比例rs762459325突变，且能够同其它基因探针组合在一起应用。
实施例3：说明本申请设计的探针序列能够有效检测CEBPA基因TAD1区p.Ala44fs突变和bZIP区p.Glu316delinsAspGln突变，说明本探针序列能够有效检测CEBPA其它区域突变。
实施例4：说明本申请设计的探针序列能够有效检测CEBPA基因突变，突变检测灵敏度高于一代测序。同时，当患者在rs762459325区域附近同时发生突变，本申请设计的探针序列也能够有一定的检出率。
序列表
<110> 苏州元德基因生物科技有限公司
<120> 一种CEBPA基因的探针设计方法及其应用
<141> 2019-11-28
<160> 55
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
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agttcctggc cgacctgttc cagcacagcc ggcagcagga gaaggccaag gcggccgtgg 60
gccccacggg cggcggcggc ggcggcgact ttgactaccc gggcgcgccc gcgggccccg 120
<210> 19
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
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cagcacagcc ggcagcagga gaaggccaag gcggccgtgg gccccacggg cggcggcggc 60
ggcggcgact ttgactaccc gggcgcgccc gcgggccccg gcggcgccgt catgcccggg 120
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
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gaaggccaag gcggccgtgg gccccacggg cggcggcggc ggcggcgact ttgactaccc 60
gggcgcgccc gcgggccccg gcggcgccgt catgcccggg ggagcgcacg ggcccccgcc 120
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<213> 人工序列(化学合成)
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gccccacggg cggcggcggc ggcggcgact ttgactaccc gggcgcgccc gcgggccccg 60
gcggcgccgt catgcccggg ggagcgcacg ggcccccgcc cggctacggc tgcgcggccg 120
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<213> 人工序列(化学合成)
<400> 22
ggcggcgact ttgactaccc gggcgcgccc gcgggccccg gcggcgccgt catgcccggg 60
ggagcgcacg ggcccccgcc cggctacggc tgcgcggccg ccggctacct ggacggcagg 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 23
gggcgcgccc gcgggccccg gcggcgccgt catgcccggg ggagcgcacg ggcccccgcc 60
cggctacggc tgcgcggccg ccggctacct ggacggcagg ctggagcccc tgtacgagcg 120
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<213> 人工序列(化学合成)
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gcggcgccgt catgcccggg ggagcgcacg ggcccccgcc cggctacggc tgcgcggccg 60
ccggctacct ggacggcagg ctggagcccc tgtacgagcg cgtcggggcg ccggcgctgc 120
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<213> 人工序列(化学合成)
<400> 25
ggagcgcacg ggcccccgcc cggctacggc tgcgcggccg ccggctacct ggacggcagg 60
ctggagcccc tgtacgagcg cgtcggggcg ccggcgctgc ggccgctggt gatcaagcag 120
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<213> 人工序列(化学合成)
<400> 26
cggctacggc tgcgcggccg ccggctacct ggacggcagg ctggagcccc tgtacgagcg 60
cgtcggggcg ccggcgctgc ggccgctggt gatcaagcag gagccccgcg aggaggatga 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 27
ccggctacct ggacggcagg ctggagcccc tgtacgagcg cgtcggggcg ccggcgctgc 60
ggccgctggt gatcaagcag gagccccgcg aggaggatga agccaagcag ctggcgctgg 120
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<213> 人工序列(化学合成)
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ctggagcccc tgtacgagcg cgtcggggcg ccggcgctgc ggccgctggt gatcaagcag 60
gagccccgcg aggaggatga agccaagcag ctggcgctgg ccggcctctt cccttaccag 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
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cgtcggggcg ccggcgctgc ggccgctggt gatcaagcag gagccccgcg aggaggatga 60
agccaagcag ctggcgctgg ccggcctctt cccttaccag ccgccgccgc cgccgccgcc 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
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ctcgcacccg cacccgcacc cgccgcccgc gcacctggcc gccccgcacc tgcagttcca 60
gatcgcgcac tgcggccaga ccaccatgca cctgcagccc ggtcacccca cgccgccgcc 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 31
cgccgcccgc gcacctggcc gccccgcacc tgcagttcca gatcgcgcac tgcggccaga 60
ccaccatgca cctgcagccc ggtcacccca cgccgccgcc cacgcccgtg cccagcccgc 120
<210> 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
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gccccgcacc tgcagttcca gatcgcgcac tgcggccaga ccaccatgca cctgcagccc 60
ggtcacccca cgccgccgcc cacgcccgtg cccagcccgc accccgcgcc cgcgctcggt 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
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gatcgcgcac tgcggccaga ccaccatgca cctgcagccc ggtcacccca cgccgccgcc 60
cacgcccgtg cccagcccgc accccgcgcc cgcgctcggt gccgccggcc tgccgggccc 120
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<213> 人工序列(化学合成)
<400> 34
ccaccatgca cctgcagccc ggtcacccca cgccgccgcc cacgcccgtg cccagcccgc 60
accccgcgcc cgcgctcggt gccgccggcc tgccgggccc tggcagcgcg ctcaaggggc 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
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ggtcacccca cgccgccgcc cacgcccgtg cccagcccgc accccgcgcc cgcgctcggt 60
gccgccggcc tgccgggccc tggcagcgcg ctcaaggggc tgggcgccgc gcaccccgac 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 36
cacgcccgtg cccagcccgc accccgcgcc cgcgctcggt gccgccggcc tgccgggccc 60
tggcagcgcg ctcaaggggc tgggcgccgc gcaccccgac ctccgcgcga gtggcggcag 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 37
accccgcgcc cgcgctcggt gccgccggcc tgccgggccc tggcagcgcg ctcaaggggc 60
tgggcgccgc gcaccccgac ctccgcgcga gtggcggcag cggcgcgggc aaggccaaga 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
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gccgccggcc tgccgggccc tggcagcgcg ctcaaggggc tgggcgccgc gcaccccgac 60
ctccgcgcga gtggcggcag cggcgcgggc aaggccaaga agtcggtgga caagaacagc 120
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<213> 人工序列(化学合成)
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tggcagcgcg ctcaaggggc tgggcgccgc gcaccccgac ctccgcgcga gtggcggcag 60
cggcgcgggc aaggccaaga agtcggtgga caagaacagc aacgagtacc gggtgcggcg 120
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<213> 人工序列(化学合成)
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tgggcgccgc gcaccccgac ctccgcgcga gtggcggcag cggcgcgggc aaggccaaga 60
agtcggtgga caagaacagc aacgagtacc gggtgcggcg cgagcgcaac aacatcgcgg 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
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ctccgcgcga gtggcggcag cggcgcgggc aaggccaaga agtcggtgga caagaacagc 60
aacgagtacc gggtgcggcg cgagcgcaac aacatcgcgg tgcgcaagag ccgcgacaag 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
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cggcgcgggc aaggccaaga agtcggtgga caagaacagc aacgagtacc gggtgcggcg 60
cgagcgcaac aacatcgcgg tgcgcaagag ccgcgacaag gccaagcagc gcaacgtgga 120
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<213> 人工序列(化学合成)
<400> 43
agtcggtgga caagaacagc aacgagtacc gggtgcggcg cgagcgcaac aacatcgcgg 60
tgcgcaagag ccgcgacaag gccaagcagc gcaacgtgga gacgcagcag aaggtgctgg 120
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<213> 人工序列(化学合成)
<400> 44
aacgagtacc gggtgcggcg cgagcgcaac aacatcgcgg tgcgcaagag ccgcgacaag 60
gccaagcagc gcaacgtgga gacgcagcag aaggtgctgg agctgaccag tgacaatgac 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 45
cgagcgcaac aacatcgcgg tgcgcaagag ccgcgacaag gccaagcagc gcaacgtgga 60
gacgcagcag aaggtgctgg agctgaccag tgacaatgac cgcctgcgca agcgggtgga 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 46
tgcgcaagag ccgcgacaag gccaagcagc gcaacgtgga gacgcagcag aaggtgctgg 60
agctgaccag tgacaatgac cgcctgcgca agcgggtgga acagctgagc cgcgaactgg 120
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<213> 人工序列(化学合成)
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gccaagcagc gcaacgtgga gacgcagcag aaggtgctgg agctgaccag tgacaatgac 60
cgcctgcgca agcgggtgga acagctgagc cgcgaactgg acacgctgcg gggcatcttc 120
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<213> 人工序列(化学合成)
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gacgcagcag aaggtgctgg agctgaccag tgacaatgac cgcctgcgca agcgggtgga 60
acagctgagc cgcgaactgg acacgctgcg gggcatcttc cgccagctgc cagagagctc 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 49
agctgaccag tgacaatgac cgcctgcgca agcgggtgga acagctgagc cgcgaactgg 60
acacgctgcg gggcatcttc cgccagctgc cagagagctc cttggtcaag gccatgggca 120
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<213> 人工序列(化学合成)
<400> 50
cgcctgcgca agcgggtgga acagctgagc cgcgaactgg acacgctgcg gggcatcttc 60
cgccagctgc cagagagctc cttggtcaag gccatgggca actgcgcgtg aggcgcgcgg 120
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<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 51
acagctgagc cgcgaactgg acacgctgcg gggcatcttc cgccagctgc cagagagctc 60
cttggtcaag gccatgggca actgcgcgtg aggcgcgcgg ctgtgggacc gccctgggcc 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 52
acacgctgcg gggcatcttc cgccagctgc cagagagctc cttggtcaag gccatgggca 60
actgcgcgtg aggcgcgcgg ctgtgggacc gccctgggcc agcctccggc ggggacccag 120
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<213> 人工序列(化学合成)
<400> 53
cgccagctgc cagagagctc cttggtcaag gccatgggca actgcgcgtg aggcgcgcgg 60
ctgtgggacc gccctgggcc agcctccggc ggggacccag ggagtggttt ggggtcgccg 120
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<213> 人工序列(化学合成)
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cttggtcaag gccatgggca actgcgcgtg aggcgcgcgg ctgtgggacc gccctgggcc 60
agcctccggc ggggacccag ggagtggttt ggggtcgccg gatctcgagg cttgcccgag 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 55
actgcgcgtg aggcgcgcgg ctgtgggacc gccctgggcc agcctccggc ggggacccag 60
ggagtggttt ggggtcgccg gatctcgagg cttgcccgag ccgtgcgagc caggactagg 120

Claims (6)

1.一种CEBPA基因的探针设计方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）针对CEBPA基因的编码序列，按照序列反向互补的原则，以rs762459325位点为中心向两侧每隔20bp平铺设计长度为120bp的探针序列；
（2）结合cosmic数据库，对步骤（1）得到的探针序列进行优化，优化原则为：当探针序列前6个碱基内cosmic数据库报道具有6个碱基以上移码突变，探针序列优化位移至报道突变位点两侧，保证该处位置发生移码突变时具有更好的捕获效率。
2. 采用权利要求1所述的探针设计方法得到的探针序列，其特征在于，所述的探针序列如SEQ ID NO .1- SEQ ID NO .55所示。
3.使用权利要求2所述的探针序列制备的DNA探针文库。
4.权利要求3所述的DNA探针文库在制备CEBPA基因突变检测试剂中的应用。
5.一种CEBPA基因突变的检测试剂，所述的检测试剂包含权利要求3所述的DNA探针文库。
6.一种检测受试者CEBPA基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取所述受试者的基因组DNA，将其打断至200-220bp的范围；
（2）对上述打碎的基因组DNA进行DNA小片段文库的制备；
（3）将DNA小片段文库和权利要求3的DNA探针文库或包含权利要求3的DNA探针文库杂交，进行基因的捕获；
（4）对步骤（3）捕获的目的基因进行测序，得到所述基因的测序数据；
（5）将步骤（4）的测序数据与参考基因组进行比对，得出目的基因的突变情况。
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