CN111004785A

CN111004785A - 一种酪氨酸酶蛋白序列及其在制备酪氨酸酶中的应用

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Publication number: CN111004785A
Application number: CN201911291621.9A
Authority: CN
Inventors: 闫云君; 王绪霞; 张龙雨; 王磊; 李欢欢; 龚梦瑶; 袁升; 许赟
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2019-12-16
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2020-04-14

Abstract

本发明公开了一种酪氨酸酶蛋白序列及其在制备酪氨酸酶中的应用，属于酪氨酸酶制备技术领域。本发明提供的酪氨酸酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.4所示。进一步地，本发明公开了编码上述酪氨酸酶蛋白的核酸，以及包含该核酸的表达盒、表达载体、酵母工程菌及其在制备酪氨酸酶中的应用和制备方法。

Description

一种酪氨酸酶蛋白序列及其在制备酪氨酸酶中的应用

技术领域

本发明涉及一种酪氨酸酶蛋白序列及其在制备酪氨酸酶中的应用，属于酪氨酸酶制备技术领域。

背景技术

贻贝隶属于软体动物门，是一种常见的海洋双壳贝类，主要生活在有海浪冲击的石礁上。贻贝足丝蛋白(Mussel foot proteins，Mfp)具备高强度、高韧性、高防水性和极强的基体粘附性能，同时具有很好的生物相容性和可降解性，是一类极具优势和潜力的生物粘合剂。研究表明Mfp的粘性与其特殊的酪氨酸翻译后修饰产物二羟基苯丙氨酸(DOPA，俗称多巴)相关。要想获得与天然贻贝足丝蛋白等效的Mfp粘性蛋白需要将体外重组表达的Mfp蛋白进行酪氨酸酶催化。因此，创建酪氨酸酶高效制备方法，构建能与贻贝足丝蛋白协同表达的菌株具有很高的应用价值。此外，酪氨酸酶具有多种生物学功能，在医药、美容、食品和环保等领域的应用引起了广泛关注(陈清西，宋康康.酪氨酸酶的研究进展[J].厦门大学学报(自然科学版)，2006，45(5)：731-737.)。此外，结合固定化、生物传感器等技术，在有机合成、环境保护、生物检测等领域，利用酪氨酸酶进行催化氧化、处理工业废水、检测化合物等方向已经逐渐成为目前国内外研究的热点(屈佳玉.微生物固定化技术及其在污水处理领域的研究进展[J].工业水处理， 2010，30(10)：14-16.)。

解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一种非常规酵母，属于半子囊菌类(Hemiascomycetes)。该酵母的抗逆性较强，可耐受高盐、低温以及过高的酸碱环境，因此在自然界中分布广泛。与传统的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 相比，解脂耶氏酵母有很多独特的理化性质、代谢特点以及基因结构(Kellershohn J,Russell I.YeastBiotechnology[M].Advances in Food Biotechnology.John Wiley& Sons Ltd,2015.)。解脂耶氏酵母被美国FDA批准为安全微生物。由于在环境安全性、底物来源、翻译后修饰等方面的优势，解脂耶氏酵母在上世纪90年代起被开发为一种新的酵母表达***，并成功表达超过上百种异源蛋白(赵鹤云，黄瑛，杨江科，等.解脂耶氏酵母表达***研究进展[J].生物加工过程，2008，6(3)： 10-16.)。虽然有部分资料公开了在解脂耶氏酵母中表达的酪氨酸酶，但是表达的量非常低，不能用于工业化生产(赵鹤云，汪小锋，潘小幸，等.解脂耶氏酵母新型表达载体构建及癌基因rho在其中的表达[J].微生物学通报，2011，38(12)：1778-1785.；Rao A,Pimprikar P,Bendigiri C,et al.Cloning and expression of atyrosinase from Aspergillus oryzae in Yarrowia lipolytica:application in L-DOPA biotransformation[J].Appl Microbiol Biotechnol,2011,92(5):951-9.)

发明内容

本发明拟解决的技术问题是在解脂耶氏酵母中高效表达酪氨酸酶。

本发明通过搜集并测试一系列酪氨酸酶基因，并在解脂耶氏酵母中进行酪氨酸酶表达测试，得到了能够在解脂耶氏酵母中成功表达酪氨酸酶的基因和蛋白序列。进一步对核酸序列表达菌株进行了优化和测试，获得了高效的酪氨酸酶制备方法。

本发明提供了一种可用于在解脂耶氏酵母中表达的酪氨酸酶蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示；在一些实施方案中，所述的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在又一方面，本发明还提供了一种核酸，其特征在于，上述核酸编码上述的蛋白；在一些实施方案中，上述核酸序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.12所示。

在又一方面，本发明还提供了一种基因表达盒，其特征在于，上述表达盒含有上述的核酸序列；在一些实施方案中，上述核酸与hp4d启动子和XPR2t终止子可操作地连接。

在又一方面，本发明还提供了一种表达载体，其特征在于，含有上述表达盒；在一些实施方案中，上述载体还包含分泌信号肽XPR2pre，筛选标记尿嘧啶 ura3d4，载体抗性KanR。

在又一方面，本发明还提供了一种酵母工程菌，其特征在于，用上述的表达载体转化酵母菌株，得到酵母工程菌；在一些实施方案中，上述酵母菌株为解脂耶氏酵母Polf和Polh菌株。

在又一方面，本发明还提供了上述蛋白、核酸、基因表达盒、表达载体、酵母工程菌在制备酪氨酸酶中的应用。

在又一方面，本发明还提供了一种制备酪氨酸酶的方法，其特征在于，将上述的酵母工程菌进行发酵培养，分离纯化酪氨酸酶。

与现有技术相比，本发明的优点在于：酪氨酸酶能够用于催化体外表达的贻贝足丝蛋白，解脂耶氏酵母表达***在安全性、底物来源、翻译后修饰等方面具有优势。虽然有部分资料公开了在解脂耶氏酵母中表达的酪氨酸酶，但是表达的量非常低，不能用于工业化生产。没有资料显示本发明提供的蛋白、核酸、酵母工程菌可用于在解脂耶氏酵母中高效表达酪氨酸酶。

附图说明

图1 PiNA1297载体图。各元件英文及各缩写含义列举如下：

Zeta 酵母多位点整合位点

Ura3d4 营养型标记

Hp4d pXPR2是解脂耶氏酵母中最常用的强启动子，编码胞外蛋白酶。Hp4d是由4个pXPR2的UAS1串联再加上LEU2启动子杂交形成的组成型强启动子。

XPR2pre 分泌信号肽

XPR2term 终止子

kanR 抗生素抗性

图2表达载体转化解脂耶氏酵母在MD筛选平板上的克隆。左上：T1；右上： T2；左下：T3；右下：T4。

图3酪氨酸酶工程菌基因组PCR验证阳性克隆。A：T1基因的检测，检测片段 510bp；B：T2基因的检测，检测片段1249bp；C：T3基因的检测，检测片段 749bp；D：T4基因的检测，检测片段759bp。

图4酪氨酸酶工程菌的摇瓶筛选。A：T1；B：T2；C：T3；D：T4。

图5酪氨酸酶工程菌在YPD平板上的氧化反应。

图6酪氨酸酶基因表达分析。包含T1-T4基因转化野生型菌株polh、polf后的不同工程菌菌株。

图7蛋白测定标准曲线。

图8酪氨酸酶活性测定。A：清水对照加入反应底物1小时后显示反应；B：样品T4h-1加入反应底物1小时后显示反应；C：样品T4f-3加入反应底物1小时后；D、E、F分别为清水对照、T4h-1、T4f-3加入反应底物2小时后显示反应。

图9目的蛋白SDS-PAGE检测图。M：蛋白maker；1、发酵上清液；2、流川液； 3、咪唑50洗脱；4、咪唑100洗脱。

图10 T4的肽段蛋白质谱检测结果。

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。

在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的酵母密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用酵母偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据酵母偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found., Washington,D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。所述杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可以用诸如32P的可检测基团或其它可检测标志物来标记。因而，例如，可以通过标记基于实施方案序列的合成寡核苷酸制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA及基因组文库的方法通常为本领域已知。可以在严紧条件下进行所述序列的杂交。如本文所用，术语“严紧条件”或“严紧杂交条件”表示如下条件，即在该条件下，相对于与其它序列杂交，探针将以可检测的更大程度(例如，背景的至少2倍、5倍或10倍)与其靶序列杂交。严紧条件是序列依赖性的并且在不同环境中有所不同。通过控制杂交严紧性和/或控制清洗条件，可以鉴定与所述探针100％互补的靶序列(同源探针法)。可选择地，可以调节严紧条件，以允许一些序列错配，以便检测较低的相似度(异源探针法)。通常，探针长度少于约1000或500个核苷酸。通常，严紧条件是如下的条件，即在该条件中，盐浓度为pH 7.0至8.3下，少于约1.5 M Na离子，通常约0.01M至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，并且温度条件为：当用于短探针时(例如10到50个核苷酸)，至少约30℃；当用于长探针时(例如大于50个核苷酸)，至少约60℃。还可以通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现严紧条件。示例性的低严紧条件包括37℃下使用30％至 35％的甲酰胺缓冲液、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)杂交，50℃至 55℃下在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中清洗。示例性的中度严紧条件包括37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS 中杂交，55℃至60℃下在0.5×至1×SSC中清洗。示例性的高严紧条件包括 37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，60℃至65℃下在0.1×SSC 中最后清洗至少约20分钟。任选地，清洗缓冲液可以包含约0.1％至约1％ SDS。杂交持续时间通常少于约24小时，通常为约4小时至约12小时。特异性通常依赖杂交后的清洗，关键因素在于最后清洗溶液的离子强度和温度。DNA-DNA杂合体的Tm(热力学熔点)可以近似自Meinkoth and Wahl (1984)Anal.Biochem.138:267-284的公式：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％ GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M是一价阳离子的克分子浓度，％GC是 DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，“甲酰胺％”是杂交溶液的甲酰胺百分数，而L是杂合体的碱基对长度。Tm是(确定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。通常将清洗至少进行至达到平衡，并且达到低的杂交背景水平，诸如进行2小时、1小时或30分钟。每 1％的错配对应使Tm降低约1℃；因而，可以调节Tm、杂交和/或清洗条件，从而与所需一致性的序列杂交。例如，如果需要≥90％一致性的序列，可以将Tm降低10℃。通常，将严紧条件选择为比确定离子强度和pH下的特异序列及其互补序列的Tm低约5℃。然而，在非常严紧的条件下，可以在比所述Tm低4℃下进行杂交和/或清洗；在中度严紧条件下，可以在比所述Tm 低6℃下进行杂交和/或清洗；在低严紧条件下，可以在比所述Tm低11℃下进行杂交和/或清洗。

在一些实施方案中，本发明通过搜集一系列酪氨酸酶基因，并在解脂耶氏酵母中进行酪氨酸酶表达测试，发现嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、纤维芽孢杆菌(Bacillus filamentosus)中的酪氨酸酶基因(核酸序列如SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO.8所示)能够在解脂耶氏酵母中表达出酪氨酸酶。

进一步地，根据上述酪氨酸酶基因编码的氨基酸序列(如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.4所示)，依照解脂耶氏酵母的密码子偏爱性对酪氨酸酶基因序列进行优化，获得新的酪氨酸酶基因核酸序列(如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.12所示)，人工合成的核酸片段连入PiNA1297载体获得表达载体，转化解脂耶氏酵母Polf 和Polh菌株获得工程菌。将酵母工程菌进行发酵培养，发现这些工程菌能够高效表达酪氨酸酶。其中T4h-1菌株表达的酪氨酸酶活性最高。

进一步地，本发明公开了一种制备酪氨酸酶的方法，即通过基因工程技术在解脂耶氏酵母表达上述蛋白序列，并将酵母工程菌进行发酵培养，分离纯化酪氨酸酶。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook 等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1酪氨酸酶基因的筛选鉴定

1、基因序列的搜集合成及表达载体构建。

本发明从NCBI数据库中搜集了一系列酪氨酸酶基因序列(具体序列信息见表1)，合成DNA序列，构建到表达载体PiNA1297上。

PiNA1297是一个酵母表达载体(Madzak C,Gaillardin C,Beckerich J M.Heterologous protein expression and secretion in the non-conventional yeastYarrowia lipolytica:a review[J].Journal of Biotechnology,2004,109(1-2): 63-81.)，启动子为生长周期型启动子hp4d，载体含分泌信号肽XPR2pre，终止子为XPR2t，筛选标记为尿嘧啶ura3d4，载体抗性为KanR，整合位点为zeta位点。载体图见图1。将合成的基因序列通过多克隆位点SfiI和KpnI 之间连入PiNA1297载体骨架，得到表达载体。

2、解脂耶氏酵母的转化。

用NotI线性化表达载体，醋酸锂法制备Polh和Polf感受态细胞，并进行酵母转化。感受态制备及转化方法如下：

(1)取-80℃保存的Y.lipolytica Po1f/Po1h甘油菌在YPD平板上划线，28℃ 培养1～2d。

(2)挑取单菌落接种至5mL YPD液体培养基中，28℃恒温摇床培养过夜。

(3)菌液重悬于1mL 1×TE缓冲液中，8000rpm离心1min，弃去上清液，重复一次。

(4)细胞重悬于600μL 0.1M LiAc(pH 6.0)缓冲液中，28℃水浴1h。

(5)8000rpm离心1min，弃上清，细胞轻柔的重悬在80～120μL 0.1M LiAc (pH6.0)中。

(6)取40μL细胞悬液，加入预先按3:2(v/v)混匀的线性化DNA及鲑鱼精DNA，轻柔混匀，28℃水浴15min，作为转化体系。

(7)在以上转化体系中加入转化复育体系：2M LiAc(pH 6.0)20μL，50％ PEG4000320μL，1M DTT 16μL，轻柔吹打混匀后28℃水浴1h后，39℃中水浴热激10min。

(8)热激后的体系加600μL 0.1M LiAc(pH 6.0)，8000rpm离心1min，弃去上清，留50-100μL细胞悬浮液涂布于MD平板上。Polf转化时需在MD筛选培养基中添加亮氨酸。

其中，MD固体培养基配制方法为：20g琼脂加入到800mL双蒸水中，121℃ 下蒸汽灭菌20min，冷却至60℃后加入100mL 10×YNB，2mL 500×生物素，40 mL 50％葡萄糖；YPD培养基配制方法为：酵母提取物10g，蛋白胨20g，加入到900mL双蒸水中，121℃下蒸汽灭菌20min，补加40mL单独灭菌的50％葡萄糖(m/v)至终浓度为20g/L，固体培养基另加终浓度为20g/L的琼脂。

转化2-5d后，随机挑取转化出的酵母转化子至YPD液体培养基中，28℃摇床过夜培养，保菌并抽取基因组DNA，设计目的基因阳性检测引物，对基因组进行PCR扩增，获得阳性菌株。

3、重组工程菌的摇瓶发酵。

根据PCR检测结果，选取3-4个阳性克隆，用50mL BMSY培养基进行摇瓶发酵，发酵时间为96h。BMSY培养基(/L)：Tryptone 20g，Yeast Extract 10 g，D-山梨醇50g加ddH₂O至800mL，PH 6.5的1M磷酸钾盐缓冲液100mL。高压蒸汽灭菌后，加10％体积10×YNB和0.2％体积500×生物素。YNB(Yeast Nitrogen Base)为酵母氮碱，不含氨基酸的有机氮源，可用来配制营养缺陷型的筛选培养基。

由于酪氨酸酶在氧气的参与下可以催化单酚生成二元酚，催化二元酚生成相应的醌。而醌在经过一系列酶催化及非酶催化的氧化还原反应后最终生成黑色素(Manivasagan P,Venkatesan J,Sivakumar K,et al.Actinobacterial melanins:current status and perspective for the future[J].World Journal ofMicrobiology and Biotechnology,2013,29(10):1737-1750.)。在摇瓶发酵过程中，观察培养液颜色，明显颜色变黑的说明是有酪氨酸酶活性的菌株(见表1)。

表1本发明筛选的酪氨酸酶基因信息

实施例2酪氨酸酶制备方法的优化

1、基因序列优化

将NCBI中检索到的系列酪氨酸酶基因序列或者蛋白序列(表1)，按照解脂耶氏酵母密码子偏好性进行优化，并重新合成DNA序列。

具体的优化方法为：根据T1-T4基因编码的氨基酸序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4进行优化，根据基因合成公司金斯瑞密码子优化软件OptimumGene^TM对基因进行优化，主要参考解脂耶氏酵母酵母的密码子偏好性，再结合过滤元件及平衡基因GC含量最终完成对基因密码子的优化，得到DNA序列SEQ ID NO. 9-SEQ ID NO.12。合成DNA序列，并按照实施例1的步骤构建到表达载体 PiNA1297上(载体图见图1)。

2、解脂耶氏酵母的转化和重组工程菌的摇瓶发酵。

用NotI线性化表达载体PiNA1297，醋酸锂法制备Polh，Polf感受态细胞，并进行酵母转化。筛选培养基为MD培养基，Polf为尿嘧啶和亮氨酸缺陷型菌株，转化时需在MD筛选培养基中添加亮氨酸(酵母转化结果见图2)。

随机挑取转化出的酵母转化子至YPD液体培养基中，28℃过夜培养，保菌并抽取基因组DNA，设计基因阳性检测引物(T1-F： ATGGACCGAGGTGTCAACGT；T1-R：TTAAGCTCGGGAAGCAGACC；T2-F： GCCTGGCGATGGATTCAAGA T2-R：TAGCAAGGGCGAAAGATCCG；T3-F： GTGCGAAAGAACGTCCTGCA；T3-R：CCAGCCCATGAAGAACGGT；T4-F： TCTGACCGAAACGCTGCTCA；T4-R：GTGGTGGTGGTGGTGGTTGG；T5-F： CGAATCCGAAAGAACGTCCG；T5-R:TCCGGTCTTGTAGGCGAAGG；T6-F： ATGGCCGTCCGAAAGAACG；T6-R:AAGTCGGTAGCCCACACAGGAG)，进行PCR扩增，获得阳性菌株。

PCR扩增加过见图3。根据PCR检测结果，选取3-4个阳性克隆，用50mL BMSY培养基进行摇瓶发酵，发酵时间为96h。BMSY培养基(/L)：Tryptone 20 g，Yeast Extract 10g，D-山梨醇50g加ddH₂O至800mL，PH 6.5的1M磷酸钾盐缓冲液100mL。高压蒸汽灭菌后，加10％体积10×YNB和0.2％体积500×生物素。YNB(Yeast Nitrogen Base)为酵母氮碱，不含氨基酸的有机氮源，可用来配制营养缺陷型的筛选培养基。

在摇瓶发酵过程中，观察培养液颜色，明显颜色变黑的说明是酪氨酸酶活性的菌株。结果显示，这4种酵母工程菌均有明显的变黑，而T3和T4基因的转化菌株黑色颜色最深，说明获得的酪氨酸酶菌株活性较高(图4)，将筛选到的菌株进一步在YPD平板上进行验证，YPD平板培养4-5天后，也有黑色素氧化的现象(图5)。

3、酪氨酸酶基因表达分析

将对照Polh，Polf，测试工程菌在50mL BMSY中发酵，24h后取样，进行 RNA抽提及后续表达分析实验，各基因定量PCR引物见表2，Act1为解脂耶氏酵母内参基因(GenBank:AJ250347.1)，数据分析采用ΔΔCT法：

A＝CT(目的基因，待测样本)-CT(内标基因，待测样本)；

B＝CT(目的基因，对照样本)-CT(内标基因，对照样本)；

表达倍数＝2^-(A-B)。

表2酪氨酸酶基因表达分析引物信息

结果见图6。对照Polh和Polf中均检测不到T1-T4酪氨酸酶基因的表达，而包含T1-T4基因的Polh和Polf工程菌均能够检测到酪氨酸酶基因不同水平的表达。其中包含T4基因的工程菌表达量最高，T4h-1达到9.38，T4h-2达到5.71， T4f-3达到8.34，T4f-4达到8.36。

4、蛋白含量的测定

对T4h-1，T4h-2，T4f-3，T4f-4及阴性对照po1h，pofl进行蛋白含量测定，样品来自50ml BMSY中发酵液体，离心后取上清。

蛋白含量测定采用传统BSA法，其原理是考马斯亮蓝G-250在酸性条件下和蛋白质结合，使得染料最大吸收峰从465nm变为595nm，在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量本实验。使用天根Bradford蛋白质定量试剂盒(目录号PA102)对总蛋白含量进行测定。标准曲线如图7所示。

将测试样品及阴性对照进行稀释后测量吸光值，结合以上标曲计算，获得在小体积50mL发酵液下T4h-1，T4h-2，T4f-3，T4f-4总蛋白含量分别为0.43 g/mL，0.46g/mL，0.26g/mL和0.21g/mL的蛋白产量。

5、酪氨酸酶活性测定

采用齐一生物科技(上海)细胞酪氨酸酶(tyrosinase)活性定量检测试剂盒 (货号GMS70112.1，按照说明书操作)对样品中的酪氨酸酶活性进行测试，结果见表3。

表3酪氨酸酶活性

h：Polh；f：Polf。

通过酶活测定，最终获得在摇瓶里最大酶活为0.147微摩多巴/分钟.毫升的工程菌T4h-1。两种最大酶活工程菌T4h-1和T4f-3的酶活测试反应图见图8。

实施例3酪氨酸酶的分离纯化

结合以上酪氨酸酶基因表达分析及酪氨酸酶活性测定结果，选取T4h-1菌株进行目的蛋白的发酵及纯化。在50mL BMSY培养下，37度摇床，200rpm发酵4天，发酵液经高速离心取上清。将上清液用碧云天his标签蛋白纯化试剂(产品编号p2226)进行目的蛋白的纯化，目标蛋白预测为34KD左右，纯化后的目的蛋白经SDS-PAGE检测见图9。

实施例3酪氨酸酶的分离纯化

表4蛋白凝胶样品质谱鉴定

在SDS-PAGE中45KD-65KD处也有特异条带，该条带质谱检测为解脂耶氏酵母内源蛋白已糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(又称半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶) 是乳糖代谢中Leloir途径的一个关键酶。其活性中心含有两个组氨酸[his～(164) 和his～(166)]上的咪唑环为亲核催化基团,所以很容易在镍柱纯化中一起被洗脱下来。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 华中科技大学

<120> 一种酪氨酸酶蛋白序列及其在制备酪氨酸酶中的应用

<130> 1

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 169

<212> PRT

<213> 嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)

<400> 1

Met Asp Arg Gly Val Asn Val Ala Lys Gln Met Lys Phe Thr Asn Ala

1 5 10 15

Pro Asp Phe Ser Gly Ala Leu Asn Val Glu Tyr Arg Thr Glu Leu Ala

20 25 30

Ser Ala Gly Asn Leu Ser Ala Arg Val Ser Tyr Ser Tyr Gln Ser Glu

35 40 45

Val Trp Pro Thr Thr Asp Leu Ser Pro Val Ile Arg Gln Asp Gly Tyr

50 55 60

Gly Leu Val Asn Ala Gly Val Ile Trp Lys Leu Asp Asp Ala Trp Thr

65 70 75 80

Phe Ser Leu Gln Gly Thr Asn Leu Ala Asp Lys Glu Tyr Arg Thr Thr

85 90 95

Gly Tyr Asn Ile Pro Ala Val Gly Thr Leu Ile Gly Phe Tyr Gly Pro

100 105 110

Pro Arg Gln Tyr Thr Ser Ala Ser Val Thr Ile Ser Arg Asn Arg Leu

115 120 125

His Asp Thr Val Leu Arg Leu Ile Cys Thr Gly Lys Val Thr Met Val

130 135 140

Cys Ala Cys Met Arg Ala Ile Met Pro Gln Ala Arg Asp Ser His Pro

145 150 155 160

Val Ala Arg Trp Ser Ala Ser Arg Ala

165

<210> 2

<211> 539

<212> PRT

<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400> 2

Met Ala Ser Val Glu Pro Ile Lys Thr Phe Glu Ile Arg Gln Lys Gly

1 5 10 15

Thr Val Glu Thr Lys Ala Glu Arg Lys Ser Ile Arg Asp Leu Asn Glu

20 25 30

Glu Glu Leu Asp Lys Leu Ile Glu Ala Trp Arg Trp Ile Gln Asp Pro

35 40 45

Ala Arg Thr Gly Glu Asp Ser Phe Phe Tyr Leu Ala Gly Leu His Gly

50 55 60

Glu Pro Phe Arg Gly Ala Gly Tyr Asn Asn Ser His Trp Trp Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Cys His His Gly Asn Ile Leu Phe Pro Thr Trp His Arg Ala Tyr

85 90 95

Leu Met Ala Val Glu Lys Ala Leu Arg Lys Ala Cys Pro Asp Val Ser

100 105 110

Leu Pro Tyr Trp Asp Glu Ser Asp Asp Glu Thr Ala Lys Lys Gly Ile

115 120 125

Pro Leu Ile Phe Thr Gln Lys Glu Tyr Lys Gly Lys Pro Asn Pro Leu

130 135 140

Tyr Ser Tyr Thr Phe Ser Glu Arg Ile Val Asp Arg Leu Ala Lys Phe

145 150 155 160

Pro Asp Ala Asp Tyr Ser Lys Pro Gln Gly Tyr Lys Thr Cys Arg Tyr

165 170 175

Pro Tyr Ser Gly Leu Cys Gly Gln Asp Asp Ile Ala Ile Ala Gln Gln

180 185 190

His Asn Asn Phe Leu Asp Ala Asn Phe Asn Gln Glu Gln Ile Thr Gly

195 200 205

Leu Leu Asn Ser Asn Val Thr Ser Trp Leu Asn Leu Gly Gln Phe Thr

210 215 220

Asp Ser Glu Gly Lys Gln Val Lys Ala Asp Thr Arg Trp Lys Ile Arg

225 230 235 240

Gln Cys Leu Leu Thr Glu Glu Tyr Thr Val Phe Ser Asn Thr Thr Ser

245 250 255

Ala Gln Arg Trp Asn Asp Glu Gln Phe His Pro Leu Glu Ser Gly Gly

260 265 270

Lys Glu Thr Glu Ala Lys Ala Thr Ser Leu Ala Val Pro Leu Glu Ser

275 280 285

Pro His Asn Asp Met His Leu Ala Ile Gly Gly Val Gln Ile Pro Gly

290 295 300

Phe Asn Val Asp Gln Tyr Ala Gly Ala Asn Gly Asp Met Gly Glu Asn

305 310 315 320

Asp Thr Ala Ser Phe Asp Pro Ile Phe Tyr Phe His His Cys Phe Ile

325 330 335

Asp Tyr Leu Phe Trp Thr Trp Gln Thr Met His Lys Lys Thr Glu Ala

340 345 350

Ser Gln Ile Thr Ile Leu Pro Glu Tyr Pro Gly Thr Asn Ser Val Asp

355 360 365

Ser Gln Gly Pro Thr Pro Gly Ile Ser Gly Asn Thr Trp Leu Thr Leu

370 375 380

Asp Thr Pro Leu Asp Pro Phe Arg Glu Asn Gly Asp Lys Val Thr Ser

385 390 395 400

Asn Lys Leu Leu Thr Leu Lys Asp Leu Pro Tyr Thr Tyr Lys Ala Pro

405 410 415

Thr Ser Gly Thr Gly Ser Val Phe Asn Asp Val Pro Arg Leu Asn Tyr

420 425 430

Pro Leu Ser Pro Pro Ile Leu Arg Val Ser Gly Ile Asn Arg Ala Ser

435 440 445

Ile Ala Gly Ser Phe Ala Leu Ala Ile Ser Gln Thr Asp His Thr Gly

450 455 460

Lys Ala Gln Val Lys Gly Ile Glu Ser Val Leu Ser Arg Trp His Val

465 470 475 480

Gln Gly Cys Ala Asn Cys Gln Thr His Leu Ser Thr Thr Ala Phe Val

485 490 495

Pro Leu Phe Glu Leu Asn Glu Asp Asp Ala Lys Arg Lys His Ala Asn

500 505 510

Asn Glu Leu Ala Val His Leu His Thr Arg Gly Asn Pro Gly Gly Gln

515 520 525

Arg Val Arg Asn Val Thr Val Gly Thr Met Arg

530 535

<210> 3

<211> 297

<212> PRT

<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)

<400> 3

Met Ser Asn Lys Tyr Arg Val Arg Lys Asn Val Leu His Leu Thr Asp

1 5 10 15

Thr Glu Lys Arg Asp Phe Val Arg Thr Val Leu Ile Leu Lys Glu Lys

20 25 30

Gly Ile Tyr Asp Arg Tyr Ile Ala Trp His Gly Ala Ala Gly Lys Phe

35 40 45

His Thr Pro Pro Gly Ser Asp Arg Asn Ala Ala His Met Ser Ser Ala

50 55 60

Phe Leu Pro Trp His Arg Glu Tyr Leu Leu Arg Phe Glu Arg Asp Leu

65 70 75 80

Gln Ser Ile Asn Pro Glu Val Thr Leu Pro Tyr Trp Glu Trp Glu Thr

85 90 95

Asp Ala Gln Met Gln Asp Pro Ser Gln Ser Gln Ile Trp Ser Ala Asp

100 105 110

Phe Met Gly Gly Asn Gly Asn Pro Ile Lys Asp Phe Ile Val Asp Thr

115 120 125

Gly Pro Phe Ala Ala Gly Arg Trp Thr Thr Ile Asp Glu Gln Gly Asn

130 135 140

Pro Ser Gly Gly Leu Lys Arg Asn Phe Gly Ala Thr Lys Glu Ala Pro

145 150 155 160

Thr Leu Pro Thr Arg Asp Asp Val Leu Asn Ala Leu Lys Ile Thr Gln

165 170 175

Tyr Asp Thr Pro Pro Trp Asp Met Thr Ser Gln Asn Ser Phe Arg Asn

180 185 190

Gln Leu Glu Gly Phe Ile Asn Gly Pro Gln Leu His Asn Arg Val His

195 200 205

Arg Trp Val Gly Gly Gln Met Gly Val Val Pro Thr Ala Pro Asn Asp

210 215 220

Pro Val Phe Phe Leu His His Ala Asn Val Asp Arg Ile Trp Ala Val

225 230 235 240

Trp Gln Ile Ile His Arg Asn Gln Asn Tyr Gln Pro Met Lys Asn Gly

245 250 255

Pro Phe Gly Gln Asn Phe Arg Asp Pro Met Tyr Pro Trp Asn Thr Thr

260 265 270

Pro Glu Asp Val Met Asn His Arg Lys Leu Gly Tyr Val Tyr Asp Ile

275 280 285

Glu Leu Arg Lys Ser Lys Arg Ser Ser

290 295

<210> 4

<211> 301

<212> PRT

<213> 纤维芽孢杆菌(Bacillus filamentosus)

<400> 4

Met Thr Thr Lys Tyr Lys Val Arg Lys Asn Val Lys His Leu Thr Lys

1 5 10 15

Lys Glu Arg Arg Asp Phe Ile Arg Ala Val Leu Gly Leu Lys Lys Lys

20 25 30

Gly Ile Tyr Asp Arg Tyr Val Ala Trp His Ala Thr Ala Gly Asn Phe

35 40 45

Pro Thr Pro Pro Gly Ser Asp Arg Asn Ala Ala His Met Gly Pro Ala

50 55 60

Phe Leu Pro Trp His Arg Glu Phe Leu Leu Arg Phe Glu Lys Asp Leu

65 70 75 80

Gln Ser Ile Val Pro Gly Ile Thr Ile Pro Tyr Trp Asp Trp Thr Glu

85 90 95

Asp Ala Lys Met Lys Asp Pro Ser Gln Ser Ser Ile Trp Asn Gln Asp

100 105 110

Phe Met Gly Gly Asn Gly Asn Pro Gln Lys Glu Phe Val Val Asp Thr

115 120 125

Gly Pro Phe Ser Ile Asp Asn Trp Thr Val Ile Asp Ser Gln Gly Asn

130 135 140

Pro Phe Gly Gly Leu Arg Arg Asn Phe Gly Gly Asp Glu Arg Ala Pro

145 150 155 160

Thr Leu Pro Thr Lys Ser Asp Val Arg Asn Val Leu Lys Ile Thr Pro

165 170 175

Tyr Asp Thr Ser Pro Trp Asp Met Thr Ser Thr Pro Ser Phe Arg Asn

180 185 190

Gln Leu Glu Gly Phe Ile Asn Gly Pro Gln Leu His Asn Arg Val His

195 200 205

Val Trp Ile Gly Gly His Met Gly Ser Val Pro Val Ala Pro Asn Asp

210 215 220

Pro Ile Phe Tyr Leu His His Ala Asn Val Asp Arg Ile Trp Ala Ile

225 230 235 240

Trp Gln Ile Ile His Pro Glu Glu Gly Tyr Tyr Pro Arg Asp Asp Gly

245 250 255

Pro Phe Gly Gln Asn Leu Asp Asp Pro Met Tyr Pro Trp Asp Thr Thr

260 265 270

Pro Arg Asp Met Met Asn His Arg Lys Leu Lys Tyr Val Tyr Asp Ile

275 280 285

Glu Leu Lys Lys Ser Lys Arg Ile Gln Leu His Ala Asn

290 295 300

<210> 5

<211> 510

<212> DNA

<213> 嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)

<400> 5

atggatcgtg gcgtcaacgt ggccaagcag atgaagttca ccaacgcacc ggacttctcg 60

ggcgcgctga acgttgaata ccgcaccgag ctggccagtg cgggcaacct gtccgcgcgg 120

gtgagctaca gctatcagag cgaggtgtgg ccaaccaccg atctgagccc ggtgatccgc 180

caggacggct acggactggt caacgccggc gtgatctgga agctcgacga cgcctggacc 240

ttctcgctgc agggcaccaa cctggccgac aaggaatacc gcaccaccgg ttacaacatt 300

ccggcggtcg gcacgctgat tggcttctat gggccgccgc gccaatatac ctcagcgtcc 360

gttacgattt ctaggaaccg tctgcatgac accgtcttac gattgatctg tactggaaaa 420

gtgacgatgg tctgcgcctg catgcgcgcg atcatgcccc aggcgcggga cagccacccc 480

gtggcacggt ggtctgcatc ccgggcctga 510

<210> 6

<211> 1620

<212> DNA

<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400> 6

atggcctcag tcgaacccat caaaaccttt gagatcagac agaagggaac agttgaaacc 60

aaagcggaac gcaagtcgat tcgagacctc aatgaagaag agttagataa actcatcgag 120

gcttggagat ggattcaaga ccccgcgaga acaggcgaag actcattttt ctacctagcc 180

gggctgcatg gtgagccttt ccgaggcgcg ggatacaaca attcccactg gtggggggga 240

tactgccatc atggaaacat cttgtttcca acctggcatc gtgcgtatct gatggctgtg 300

gagaaggctc tacgcaaggc gtgcccagat gtctcactcc catattggga tgaaagtgac 360

gatgaaacgg caaagaaggg gattccgtta attttcaccc agaaagaata caagggaaaa 420

cctaacccac tgtattccta tacgtttagc gaacgaattg tcgaccgctt ggccaaattc 480

cccgatgcag actacagtaa gccacaaggc tataaaactt gccgataccc ttattcgggc 540

ctttgtggcc aggacgacat tgcgatagct caacagcaca acaatttcct tgatgccaac 600

tttaaccaag aacagattac tggtctgctg aatagcaatg tcacgtcatg gcttaatttg 660

gggcaattca ccgatagtga gggcaagcaa gtcaaggccg acacccgctg gaagattcgt 720

cagtgtctct tgacagaaga gtacactgtc ttctcgaata caacttcggc tcaacgatgg 780

aatgatgaac agttccatcc actggagtcg ggtggtaaag agacagaggc caaagcaacc 840

tcactcgctg ttcccctgga aagcccccat aatgacatgc atctcgctat tggtggagtc 900

caaattccgg gctttaatgt tgatcagtat gctggcgcca acggcgacat gggggagaac 960

gacaccgcct cattcgatcc gatcttttac tttcatcatt gctttattga ctatctattc 1020

tggacctggc agacaatgca caagaagaca gaggctagtc aaataacaat cttgccagaa 1080

tatcctggaa cgaacagcgt tgatagccaa ggtcctacac ccgggatctc tggcaacacc 1140

tggcttacct tggacactcc ccttgaccca ttcagagaga atggagataa ggtcacttca 1200

aataaactcc tgaccttgaa agatcttccc tatacataca aggcgcccac gtccggcaca 1260

ggttcggttt tcaatgatgt gcctcggctc aattaccctc tttctccacc aatactacgt 1320

gtctccggta tcaatcgtgc tagtatcgcc ggttcctttg ccttggctat ctcgcagaca 1380

gaccacaccg gcaaagctca agtcaaaggt atcgaatctg tgcttagtag atggcatgta 1440

cagggctgcg cgaactgcca gactcaccta agcacaacag catttgtacc tctttttgag 1500

ctgaatgagg atgatgcaaa aagaaaacat gctaataatg aattggcagt gcacctgcat 1560

actaggggta atccaggagg tcaaagagtg cgcaatgtta ccgtgggaac tatgagatag 1620

<210> 7

<211> 894

<212> DNA

<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)

<400> 7

atgagtaaca agtatagagt tagaaaaaac gtattacatc ttaccgacac ggaaaaaaga 60

gattttgttc gtaccgtgct aatactaaag gaaaaaggga tatatgaccg ctatatagcc 120

tggcatggtg cagcaggtaa atttcatact cctccgggca gcgatcgaaa tgcagcacat 180

atgagttctg cttttttacc gtggcatcgt gaataccttt tacgattcga acgtgacctt 240

cagtcaatca atccagaagt aacccttcct tattgggaat gggaaacgga cgcacagatg 300

caggatccct cacaatcaca aatttggagt gcagatttta tgggaggaaa cggaaatccc 360

ataaaagatt ttatcgtcga taccgggcca tttgcagctg ggcgctggac gacgatcgat 420

gaacaaggaa atccttccgg agggctaaaa cgtaattttg gagcaacgaa agaggcacct 480

acactcccta ctcgagatga tgtcctcaat gctttaaaaa taactcagta tgatacgccg 540

ccttgggata tgaccagcca aaacagcttt cgtaatcagc ttgaaggatt tattaacggg 600

ccacagcttc acaatcgcgt acaccgttgg gttggcggac agatgggcgt tgtgcctact 660

gctccgaatg atcctgtctt ctttttacac cacgcaaatg tggatcgtat ttgggctgta 720

tggcaaatta ttcatcgtaa tcaaaactat cagccgatga aaaacgggcc atttggtcaa 780

aactttagag atccgatgta cccttggaat acaacccctg aagacgttat gaaccatcga 840

aagcttgggt acgtatacga tatagaatta agaaaatcaa aacgttcctc ataa 894

<210> 8

<211> 906

<212> DNA

<213> 纤维芽孢杆菌(Bacillus filamentosus)

<400> 8

atgacaacta aatataaagt aagaaaaaat gtgaaacatc ttaccaaaaa agaaaggagg 60

gactttatac gtgctgtttt aggattaaag aaaaaaggta tttatgatcg atatgtagca 120

tggcatgcta ccgcaggtaa tttccctacc ccccctggtt ccgaccgaaa tgcagctcat 180

atggggccag catttcttcc atggcaccgt gaattcctcc tacgatttga aaaagacctt 240

caatcaattg tacctgggat aactattcct tactgggatt ggacagaaga tgcaaaaatg 300

aaggatccat cgcaatcatc tatatggaat caagacttta tgggaggaaa tggaaatccc 360

caaaaagaat ttgttgtgga tacaggacca ttttctattg ataattggac tgttattgat 420

tcgcaaggaa atcctttcgg aggattacgt cgtaatttcg gaggagatga aagggctcca 480

acacttccta ctaaaagtga tgtccgaaat gtcttaaaaa taactccata tgatacatca 540

ccttgggata tgacaagtac tcctagcttc cgtaaccaat tggaaggatt tatcaatgga 600

ccacaacttc ataaccgtgt ccatgtttgg atcggtggtc atatgggatc tgtaccagtg 660

gctccaaatg accctatctt ctatctacac catgctaacg tggaccgtat ctgggcgata 720

tggcaaatta ttcatccaga ggagggatac tatccaaggg atgacgggcc atttggtcaa 780

aatttagatg atcctatgta tccatgggat acaaccccta gagatatgat gaatcataga 840

aaacttaaat atgtttatga tatagaattg aagaaatcaa aacgtattca gctccatgct 900

aactaa 906

<210> 9

<211> 510

<212> DNA

<213> unkown

<400> 9

atggaccgag gtgtcaacgt cgccaagcag atgaagttca ccaacgcccc cgacttctcc 60

ggagctctta acgtcgagta ccgaaccgag ctggcctccg ctggtaacct ttccgctcga 120

gtgtcctact cctaccagtc cgaggtctgg cccaccactg acctttcccc tgtcattcga 180

caggacggct acggcctcgt caacgctggt gttatctgga agctggacga cgcctggact 240

ttctccctgc agggtaccaa cctggctgac aaggagtacc gaactaccgg ctacaacatt 300

cccgctgtcg gtaccctgat cggtttttac ggcccccccc gacagtacac ctccgcttct 360

gttaccatct cccgaaaccg actgcacgac accgtcctgc gactgatctg caccggtaag 420

gttaccatgg tctgcgcctg catgcgagcc atcatgcctc aggctcgaga ctcccacccc 480

gttgctcgat ggtctgcttc ccgagcttaa 510

<210> 10

<211> 1620

<212> DNA

<213> unkown

<400> 10

atggcttccg tcgagcctat caagaccttc gagatccgac agaagggcac cgtcgagacc 60

aaggctgagc gaaagagcat ccgagacctg aacgaggagg agctggacaa gctgatcgag 120

gcctggcgat ggattcaaga ccccgctcga accggagagg actctttctt ctacctcgcc 180

ggcctgcacg gagagccttt tcgaggtgct ggatacaaca acagccactg gtggggcggt 240

tactgccacc atggtaacat tcttttcccc acctggcacc gagcctacct gatggctgtg 300

gagaaggccc tgcgaaaggc ctgtcctgac gtctctctgc cctactggga cgagtccgac 360

gacgagactg ctaagaaggg cattcccctg atcttcaccc agaaggagta caagggcaag 420

cccaaccccc tgtacagcta caccttctcc gagcgaatcg tcgatcgact ggccaagttt 480

cccgacgccg actacagcaa gccccagggt tacaagacct gccgataccc ctactccggc 540

ctctgtggtc aggacgatat cgccatcgcc cagcagcata acaacttcct ggacgccaac 600

ttcaaccagg agcagatcac cggcctgctg aactccaacg ttacctcctg gctcaacctc 660

ggccagttca ctgactccga gggcaagcag gtcaaggccg atacccgatg gaagatccga 720

cagtgcctgc tcaccgagga gtacaccgtc ttctccaaca ccacctccgc ccagcgatgg 780

aacgacgagc agttccaccc cctggagtcc ggtggtaagg agactgaggc caaggccacc 840

tccctcgctg ttcctcttga gtccccccac aacgacatgc acctggctat cggcggcgtc 900

cagatccctg gtttcaacgt cgaccagtac gctggcgcca acggtgatat gggtgagaac 960

gacaccgcct ccttcgaccc tatcttctac tttcaccact gcttcatcga ctacctcttc 1020

tggacttggc agaccatgca caagaagacc gaggcctccc agattaccat tctgcccgag 1080

taccccggca ccaactccgt tgattcccag ggacccaccc ccggtatttc cggtaacacc 1140

tggctgaccc tggacacccc tctggaccct ttccgagaga acggcgacaa ggtcacctcc 1200

aacaagctcc tgaccctgaa ggacctcccc tacacctaca aggcccccac ttccggaacc 1260

ggtagcgttt tcaacgacgt cccccgactt aactaccccc tgtcccctcc tatcctccga 1320

gtctctggca tcaaccgagc ctccatcgcc ggatctttcg cccttgctat ctcccagact 1380

gaccataccg gcaaggccca ggtcaaggga atcgagtccg tcctttcccg atggcacgtc 1440

cagggttgcg ctaactgcca gacccacctg tccactaccg ccttcgtgcc tctcttcgag 1500

ctcaacgagg atgatgccaa gcgaaagcac gccaacaacg agctggccgt ccaccttcac 1560

actcgaggta accccggcgg acagcgagtt cgaaacgtca ctgtcggcac catgcgataa 1620

<210> 11

<211> 894

<212> DNA

<213> unkown

<400> 11

atgtccaaca agtaccgagt gcgaaagaac gtcctgcacc tgaccgacac cgagaagcga 60

gacttcgtgc gaaccgtcct gatcctgaag gagaagggaa tctacgaccg atacattgcc 120

tggcacggcg ccgctggaaa gttccacacc cctcccggtt ctgaccgaaa cgccgctcac 180

atgtcttccg ctttcctgcc ctggcaccga gagtacctgc tgcgattcga gcgagacctg 240

cagtccatca accccgaggt gaccctgccc tactgggagt gggagaccga cgcccagatg 300

caggacccct ctcagtccca gatttggtct gctgacttca tgggcggaaa cggcaacccc 360

atcaaggact tcattgtgga caccggtcct ttcgctgctg gacgatggac caccattgac 420

gagcagggta acccctctgg tggcctgaag cgaaacttcg gagctaccaa ggaagccccc 480

accctgccta cccgagacga cgtgctgaac gccctgaaga tcacccagta cgacacccct 540

ccctgggaca tgacctctca gaactccttc cgaaaccagc tggagggatt cattaacggt 600

ccccagctgc acaaccgagt gcaccgatgg gtcggaggtc aaatgggagt ggtccccacc 660

gctcctaacg accccgtctt cttcctgcac cacgccaacg tggaccgaat ctgggctgtc 720

tggcagatca ttcaccgaaa ccagaactac cagcccatga agaacggtcc cttcggccag 780

aacttccgag accccatgta cccctggaac accacccccg aggacgtgat gaaccaccga 840

aagctgggat acgtctacga cattgagctg cgaaagtcca agcgatcttc ctaa 894

<210> 12

<211> 906

<212> DNA

<213> unkown

<400> 12

atgaccacca agtacaaggt gcgaaagaac gtcaagcacc tgaccaagaa ggagcgacga 60

gacttcatcc gagccgtgct gggcctgaag aagaagggaa tctacgaccg atacgtcgct 120

tggcacgcca ccgctggtaa cttccctacc cctcccggtt ctgaccgaaa cgctgctcac 180

atgggtcctg ccttcctgcc ttggcaccga gagttcctgc tgcgattcga gaaggacctg 240

cagtctatcg tgcccggaat caccattccc tactgggact ggaccgagga cgctaagatg 300

aaggacccct cccagtcttc catttggaac caggacttca tgggcggaaa cggaaacccc 360

cagaaggagt tcgtggtgga caccggtccc ttctctatcg acaactggac cgtcattgac 420

tctcagggta accctttcgg tggcctgcga cgaaacttcg gaggtgacga gcgagccccc 480

accctgccta ccaagtctga cgtgcgaaac gtcctgaaga tcacccccta cgacacctcc 540

ccctgggaca tgacctctac cccctccttc cgaaaccagc tggagggatt catcaacggt 600

ccccagctgc acaaccgagt gcacgtctgg attggcggac acatgggttc tgtgcccgtc 660

gctcccaacg accccatttt ctacctgcac cacgccaacg tggaccgaat ctgggctatt 720

tggcagatca ttcaccccga ggaaggctac tacccccgag acgacggtcc cttcggccag 780

aacctggacg accccatgta cccctgggac accacccctc gagacatgat gaaccaccga 840

aagctgaagt acgtctacga catcgagctg aagaagtcca agcgaatcca gctgcacgcc 900

aactaa 906

Claims

1.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示；任选地，所述的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.核酸，其特征在于，所述的核酸编码权利要求1所述的蛋白；任选地，所述的核酸序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.12所示。

3.基因表达盒，其特征在于，所述表达盒含有权利要求2所述的核酸序列；任选地，所述核酸与hp4d启动子和XPR2t终止子可操作地连接。

4.表达载体，其特征在于，含有权利要求3所述的表达盒；任选地，所述载体还包含分泌信号肽XPR2 pre，筛选标记尿嘧啶ura3d4，载体抗性KanR。

5.酵母工程菌，其特征在于，用权利要求4所述的表达载体转化酵母菌株，得到酵母工程菌；任选地，所述的酵母菌株为解脂耶氏酵母Polf和Polh菌株。

6.权利要求1至权利要求5所述的蛋白、核酸、基因表达盒、表达载体、酵母工程菌在制备酪氨酸酶中的应用。

7.制备酪氨酸酶的方法，其特征在于，将权利要求5所述的酵母工程菌进行发酵培养，分离纯化酪氨酸酶。