CN115247158B - 一种甘油磷酸氧化酶突变体及其筛选方法、制备方法和应用 - Google Patents
一种甘油磷酸氧化酶突变体及其筛选方法、制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种甘油磷酸氧化酶突变体及其筛选方法、制备方法和应用。本发明构建了野生型甘油磷酸氧化酶(G3PO)的突变文库，在50多个位点进行单点突变及组合突变，分别构建了重组表达菌株，进行诱导表达，对得到的突变产物进行活力和热稳定性分析，筛选得到了20多种热稳定显著提升的单点突变方式的G3PO突变体，包括但不限于D102N、T90V、A363S和F555E四种单点突变体，还筛选得到了40多种包含前述单点突变的较佳的组合突变体。本发明还公开了G3PO突变体的融合蛋白、核酸构建物、重组载体、工程菌以及其制备方法。本发明筛选出的G3PO突变体在血清甘油三酯含量检测方面极具应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种甘油磷酸氧化酶突变体及其筛选方法、制备方法和应用。
背景技术
甘油磷酸氧化酶(G3PO，EC 1.1.3.21)是用耦联酶法测定甘油三酯含量的关键酶之一，目前，以其特有的高特异性和高灵敏度被广泛地应用于心脏病和高血脂的临床判断中。
对甘油磷酸氧化酶的研究始于二十世纪三十年代，主要研究对象是Streptococcus faecalis来源的蛋白。目前已有的商品化甘油磷酸氧化酶往往来自于多步的分离纯化产物，主要生产国包括日本、美国和英国等。中国对甘油磷酸氧化酶的研究起步较晚，相关的报道并不是特别多，大部分用于临床诊断的甘油磷酸氧化酶仍需要进口。同时，随着人们生活水平的日益提高，工作压力日益增强，重视健康的理念逐渐被人们作为衡量生活品质高低的标准之一，因此，中国国内对甘油磷酸氧化酶的需求也呈现上升趋势。
目前关于甘油磷酸氧化酶的研究主要集中于Pediococcus acidilactici，Aerococcus viridans，Streptococcus faecalis和Enterococcus SP.等来源。专利文献CN110938607A报道了一种来源于Pediococcus acidilactici的甘油磷酸氧化酶，还进行了随机突变，提高了热稳定性[1]。王腾等报道了一种采用诱导培养基链球菌制备磷酸甘油氧化酶的方法，以Streptococcus faecalis来源的G3PO基因进行重组表达，以聚乙二醇-硫酸铵双水相萃取和两步层析纯化得到G3PO目的蛋白[2]。四川大学于彩霞从23株菌种中筛选出了Enterococcus SP.来源的甘油磷酸氧化酶，利用多步纯化硫酸铵分级沉淀、DADE-Sepharose FF离子交换层析、Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析、Chelating SepharoseFF亲和层析和Sephacryls-200HR处理，操作较为复杂[3]。另外，随着人们生活品质的日渐提升，健康问题受到越来越多的重视，血清甘油三酯含量的检测受到越来越多的关注。检测血清甘油三酯含量的试剂涉及一个重要的酶——甘油磷酸氧化酶，因此该酶具有较好的市场前景。
血清甘油三酯含量检测已经由此前的化学法基本完全转化为目前的酶法。酶法检测甘油三酯快速方便，准确率高，且可以应用在生化分析仪上，还可进行大批量检测。酶法检测的检测原理如下：待检测样品在脂蛋白酯酶(Lipoprotein lipase)的作用下水解生成甘油(glycerol)和脂肪酸(Fatty acid)，甘油和ATP在甘油激酶(Glycerol kinase)作用下生成甘油-3-磷酸(Glycerol-3-P)，甘油-3-磷酸在甘油磷酸氧化酶(L-α-glycerophosphate oxidase)作用下生成磷酸二羟基丙酮(Dihydroxyacetone-P)和双氧水(H2O2)，双氧水可以在4-氨基安替比林(4-Aminoantipyrine，4-AA)、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠(TOOS)以及辣根过氧化物酶(Peroxidase)作用下生成显色物质醌亚胺(Quinoneimine dye)，根据醌亚胺在可见光下的吸收变化可以反应出甘油三酯的含量，达到检测的目的。具体的反应原理如下所示：
此前大部分甘油磷酸氧化酶是利用天然微生物发酵培养获得，产量低、纯化难度高，限制了酶法检测TG试剂的研发和普及，同时甘油磷酸氧化酶的稳定性也会大大影响试剂的检测准确性。
目前，绿色气球菌来源的甘油磷酸氧化酶(G3PO)野生型稳定性有所欠缺，有待开发一种稳定性提高的甘油磷酸氧化酶突变体，从而提高其应用稳定性。
[1]邹炳德,邹继华,章玉胜,汪屹,张帅,张永.热稳定性好的甘油-3-磷酸氧化酶及其在试剂盒中的应用,CN 110938607 A.
[2]王腾,孟延发.用诱导培养基链球菌制备磷酸甘油氧化酶的方法,CN101070529A.
[3]高国生,董飞波,孙毅,华馨,张文宇,杨锦勋.一种重组甘油磷酸氧化酶表达载体及其建立方法,CN 110184289 A.
发明内容
鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题之一是如何开发一种稳定性提高的甘油磷酸氧化酶(G3PO)突变体，从而提高其应用稳定性。
本发明第一方面提供了一种甘油磷酸氧化酶突变体(G3PO突变体)，所述甘油磷酸氧化酶突变体基于野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列进行定点突变，所述野生型甘油磷酸氧化酶(野生型G3PO)的氨基酸序列如SEQ ID No.:4所示，突变方式选自：D102N、T90V、A363S、F555E、F6L、G29P、G399K、G399E、A376K、G399P、H92Q、A341T、E204D、V209N、S218T、L131V、V198A、T221S、H227R、V228R、E392K、T370S、I179S、S501A、K113G、Q474F、V492T、S82A、Q464N及包括前述突变方式的组合突变方式。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述组合突变方式选自D102N、T90V、A363S、F555E、F6L、G29P、G399K、G399E、A376K、G399P、H92Q、A341T、E204D、V209N、S218T、L131V、V198A、T221S、H227R、V228R、E392K、T370S、I179S、S501A、K113G、Q474F、V492T、S82A、Q464N中至少两种突变方式组合而成的组合突变方式。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述突变方式选自：D102N、T90V、A363S、F555E及包括前述突变方式的组合突变方式。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述组合突变方式选自以下任一种组合突变方式：
L4F+E574K，D102N+T90V+E574K，T370S+F555E+E574K等；
D102N+T90V+A363S+Q464N+F555E+E574K，
T90V+A363S+F555E+I179S+V198A，
D102N+T90V+Q464N+V492T+F555E+E574K，
D102N+T90V+A363S+F555E+F6L，
D102N+T90V+A376K+G399K+S501A+F555E，D102N+T90V+E574K，
D102N+T90V+A341T+T370S+Q474F+E574K，D102N+T90V+A363S+F555E，
F6L+G29P+A341T+A363S+F555E+E574K等；
D102N+T90V+G399K+S501A+Q464N，T90V+L131V+A341T+Q464N，
T90V+F555E+A376K+G399E+Q474F，K113G+I179S+S218T+Q474F+V492T，
V198A+E204D+Q464N+S501A，T90V+A363S+Q464N，
T90V+A363S+Q474F+F555E，S82A+A363S+A341T+T370S+Q464N，
S82A+Q464N，D102N+T90V+Q464N等。
本发明第二方面提供了一种甘油磷酸氧化酶突变体的融合蛋白，所述甘油磷酸氧化酶突变体的融合蛋白在第一方面所述甘油磷酸氧化酶突变体的N端和/或C端连接有融合标签。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述融合标签包括亲和标签。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述亲和标签选自：His-tag、GST、Flag-tag、MBP及其组合。
本发明第三方面提供了一种核酸构建物，其核苷酸序列选自下述任一种：
(i)编码第一方面所述甘油磷酸氧化酶突变体或者第二方面所述融合蛋白的核苷酸序列；和
(ii)与(i)中所述核苷酸序列互补的核苷酸序列。
所述核酸构建物可以为DNA、mRNA或者其组合。
本发明第四方面提供了一种重组载体，所述重组载体含有第三方面所述核酸构建物。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述重组载体为含有第三方面所述核酸构建物的表达质粒。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述重组载体的类型选自：pET 28a，pET 30a，pANY1，pQE30，pG-KJE8，pGRO7，pKJE7，pG-Tf2，pTf16，pUC18，pUC19和pGEX。
本发明第五方面提供了一种工程菌，所述工程菌的基因组整合有第三方面所述核酸构建物，或者所述工程菌含有第四方面所述重组载体。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述工程菌来源于大肠杆菌。
本发明第六方面提供了一种基因工程细胞，所述基因工程细胞的基因组整合有第三方面所述核酸构建物，或者所述基因工程细胞含有第四方面所述重组载体。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述基因工程细胞来源于大肠杆菌。
本发明第七方面提供了一种从突变文库中筛选甘油磷酸氧化酶突变体的方法，包括以下步骤：
(1)构建如SEQ ID No.:4所示的野生型G3PO的突变文库，突变位点包括：4、6、29、55、78、82、90、92、100、102、113、119、123、127、131、147、179、196、198、204、209、218、221、227、228、261、269、341、363、370、376、392、399、452、460、463、464、466、470、474、492、501、531、547、555、560、572、574和584，得到由G3PO突变体组成的突变文库；突变方式包括单点突变方式及组合突变方式；
(2)以野生型G3PO的基因为模板，得到所述突变文库中各G3PO突变体的编码序列；
(3)对所述突变文库中各G3PO突变体分别构建重组载体(如第四方面所述重组载体)，转化到宿主菌中得到重组表达菌株，诱导所述重组表达菌株，表达得到所述突变文库的G3PO突变体或其融合蛋白(对应第一方面所述G3PO突变体或第二方面所述融合蛋白)；当所述重组载体中的G3PO突变体的编码序列连接有融合标签(如亲和标签)时，表达得到所述突变文库的G3PO突变体的融合蛋白；
(4)对所述G3PO突变体或其融合蛋白进行蛋白比活力和稳定性分析，筛选得到第一方面所述G3PO突变体或者第二方面所述融合蛋白。
本发明第八方面提供了一种甘油磷酸氧化酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将第三方面所述核酸构建物克隆到表达载体上，得到含有所述G3PO突变体或其融合蛋白的编码序列的重组载体；
(2)将所述重组载体转化到宿主菌中，得到含有所述G3PO突变体或其融合蛋的编码序列的重组表达菌株；
(3)诱导所述重组表达菌株，在适宜表达条件下表达得到所述G3PO突变体或其融合蛋(对应第一方面所述G3PO突变体或第二方面所述融合蛋白)。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述重组表达菌株为大肠杆菌，此时，所述适宜表达条件包括：0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，0.1wt％的诱导前体物质，25℃诱导16小时。所述诱导前体物质可以为黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、核酸素、核黄素类似物或者其组合。
本发明第九方面提供了第一方面所述甘油磷酸氧化酶突变体、第二方面所述融合蛋白、第三方面所述核酸构建物、第四方面所述重组载体、第五方面所述工程菌以及第六方面所述基因工程细胞在血清甘油三酯含量检测方面的应用。
本发明公开的技术方案所带来的有益效果包括：
1、本发明构建了野生型甘油磷酸氧化酶的稳定性突变文库，将G3PO突变体基因克隆到表达载体上，然后转化到宿主菌中构建成相应的单位点突变菌株，经诱导表达后，对表达产物进行稳定性分析，筛选得到了20多种热稳定性明显提升的G3PO突变体(包括但不限于D102N、T90V、A363S和F555E四种单点突变体)，还筛选得到了40多种包含前述单点突变的较佳的组合突变体(如D102N、T90V、A363S、Q464N、F555E和E574K的六点组合突变)，均可用于催化甘油-3-磷酸反应生成磷酸二羟基丙酮。
2、本发明公开了20多种热稳定性至少提高40％以上的G3PO单点突变体，活力的定量分析依据蛋白比活力或者46℃孵育20min残余活力百分数。其中，F6L、G29P和G399K突变体的蛋白比活力相对于野生型G3PO略有提升，且热稳定性提高了0.5～1.6倍；D102N、T90V、A363S、F555E突变体的蛋白比活力能达到野生型G3PO的90％以上，且热稳定性提高了2倍以上；G399E、A376K、G399P、H92Q、A341T、E204D和V209N突变体的蛋白比活力能达到野生型G3PO的90％以上，且热稳定性提高了0.8～2.4倍；S501A、K113G、Q474F、V492T、S82A和Q464N突变体的热稳定性相对于野生型G3PO提高了1.5～3.1倍，同时蛋白比活力达到野生型G3PO的21％～60％。
3、综合考虑G3PO突变体的活力和稳定性，本发明获得了综合性能显著提升的单点突变方式的G3PO突变体，包括D102N、T90V、A363S和F555E单点突变方式的G3PO突变体。
4、本发明还公开了保持一定活力基础上稳定性显著提升的、由以下单点突变方式组合而成的组合突变体：L4F、E574K、D102N、T90V、E574K、T370S、F555E、A363S、V492T、G399P、E204D、A376A、G29P等。
5、此外本发明具体公开了40多种热稳定性至少提高60％以上的组合突变方式的G3PO突变体，活力的定量分析依据蛋白比活力或者48℃孵育20min残余活力百分数。其中，L4F+E574K，D102N+T90V+E574K和T370S+F555E+E574K蛋白比活力提升10％以上，稳定性提高80％以上；D102N+T90V+A363S+Q464N+F555E+E574K，T90V+A363S+F555E+I179S+V198A，D102N+T90V+Q464N+V492T+F555E+E574K，D102N+T90V+A363S+F555E+F6L，D102N+T90V+A376K+G399K+S501A+F555E，D102N+T90V+E574K，D102N+T90V+A341T+T370S+Q474F+E574K，D102N+T90V+A363S+F555E，F6L+G29P+A341T+A363S+F555E+E574K等突变体稳定性提高400％以上同时蛋白比活力基本维持不降；D102N+T90V+G399K+S501A+Q464N，T90V+L131V+A341T+Q464N，T90V+F555E+A376K+G399E+Q474F，K113G+I179S+S218T+Q474F+V492T，V198A+E204D+Q464N+S501A，T90V+A363S+Q464N，T90V+A363S+Q474F+F555E，S82A+A363S+A341T+T370S+Q464N，S82A+Q464N，D102N+T90V+Q464N等突变体稳定性提升400％以上，蛋白比活力下降至野生型的30％-80％。
6、综合考虑G3PO突变体的活力和稳定性，本发明获得了综合性能提升极为显著的组合突变体，包括D102N+T90V+A363S+Q464N+F555E+E574K G3PO六点组合突变体，其蛋白比活力提高至野生型G3PO的109.3％，48℃半衰期提升至野生型G3PO的822.9％(也即提高了7倍以上)。
7、本发明还提供了一种在大肠杆菌细胞中重组异源表达的甘油磷酸氧化酶及其突变体的批量制备方法及纯化方法，还结合稳定性突变文库筛选出热稳定性较好的G3PO突变体，特别是热稳定性好、酶活力高的G3PO突变体。
以上优点使得本发明的甘油磷酸氧化酶突变体在血清甘油三酯含量检测方面极具应用潜力。
以下将结合附图对本发明的构思、具体技术方案及产生的技术效果作进一步说明，以便充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
通过阅读参照以下附图，对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会阐述得更清晰：
图1、显示了对野生型G3PO和G3PO突变体的性质对比，包括蛋白比活力(U/mg)、46℃半衰期(min)、46℃孵育20min残余活力百分数的分析对比，对比数据以野生型G3PO为基准，采用归一化的方式显示；其中WT表示野生型；
图2、显示了对野生型G3PO和G3PO组合突变体的性质对比，包括对蛋白比活力(U/mg)、48℃半衰期(min)、48℃孵育20min残余活力百分数的分析对比，对比数据以野生型G3PO为基准，采用归一化的方式显示；其中WT表示野生型；
图3、显示了以T90V为例的重组表达的G3PO突变体的纯化过程各样品的SDS-PAGE测试结果；其中M为Marker；泳道1～9分别对应如下的样品：泳道1，破碎上清；泳道2，破碎后沉淀；泳道3，流穿液；泳道4，除杂；泳道5，200mM洗脱；泳道6，400mM洗脱；泳道7，透析液(5和6混合)；泳道8，500mM洗柱1；泳道9，500mM洗柱2。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明提供的具体事实方式作详细说明。
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施方式和优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施方式和实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施方式和实施例。
G3PO：甘油磷酸氧化酶，EC 1.1.3.21。
G3PO突变体：甘油磷酸氧化酶突变体。
表1部分术语的简写和中英文全称
表2部分术语的中外译文对照
本发明中，G3PO突变体，也即甘油磷酸氧化酶突变体，是以野生型G3PO为基础，通过基因工程技术得到的突变体，无如特别限制，指的是通过氨基酸置换得到的突变体。
本发明中，G3PO突变体的融合蛋白，指的是在G3PO突变体的N端和/或C端还连接有融合标签、且仍能发挥G3PO活性的蛋白。从标签大小上，所述融合蛋白可以为肽标签，也可以为蛋白标签。从标签功能上，所述融合标签可以为亲和标签(可用于蛋白纯化)、荧光标签(可用于荧光标记)等中至少一种。
本发明中，“优选”、“特别”、“具体”等词语仅表示效果较佳的或者较为具体的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，“和/或”表示所列项目中的任一种或任意组合。
本发明中，“其组合”、“任何组合”、“任意组合方式”，均指所列相关项目的任意合适的组合方式，以能够顺利实施本发明为准。构成组合的相关项目的数量至少为2。
本发明中，“组合突变”指至少2个位点发生突变的突变方式。“组合突变”对应的突变体记为“组合突变体”。组合突变方式的举例如两点、三点、四点、五点、六点等组合突变方式。组合突变方式可以采用“+”表示相关突变位点的突变方式的组合。比如，“L4F+E574K”表示第4位L→F突变及第574位E→K突变组合而成的两点突变。
本发明中涉及百分比浓度，如无特别限定或说明，表示在相关体系中的终浓度。
本发明中，wt％指的是质量百分比浓度。
本发明上文及下文中涉及的各技术特征可以以任意合适的方式进行组合，只要不存在矛盾，且组合后的技术方案能够顺利实施并能够解决本发明的技术问题。所述任意合适的方式，以能够实现本发明的技术方案，解决本发明的技术问题，且能够实现相应的技术效果为准。
本发明第一方面提供了一种甘油磷酸氧化酶突变体，所述甘油磷酸氧化酶突变体基于野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列进行定点突变，所述野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.:4所示，在本发明的一些较佳实施例中，突变方式选自：D102N、T90V、A363S、F555E、F6L、G29P、G399K、G399E、A376K、G399P、H92Q、A341T、E204D、V209N、S218T、L131V、V198A、T221S、H227R、V228R、E392K、T370S、I179S、S501A、K113G、Q474F、V492T、S82A、Q464N及包括前述突变方式的组合突变方式。
所述野生型甘油磷酸氧化酶来源于Aerococcus viridans。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述组合突变方式选自D102N、T90V、A363S、F555E、F6L、G29P、G399K、G399E、A376K、G399P、H92Q、A341T、E204D、V209N、S218T、L131V、V198A、T221S、H227R、V228R、E392K、T370S、I179S、S501A、K113G、Q474F、V492T、S82A、Q464N中至少两种突变方式组合而成的组合突变方式。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述突变方式选自：D102N、T90V、A363S、F555E及包括前述突变方式的组合突变方式。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述组合突变方式选自以下任一种组合突变方式：
L4F+E574K，D102N+T90V+E574K，T370S+F555E+E574K等；
D102N+T90V+A363S+Q464N+F555E+E574K，
T90V+A363S+F555E+I179S+V198A，
D102N+T90V+Q464N+V492T+F555E+E574K，
D102N+T90V+A363S+F555E+F6L，
D102N+T90V+A376K+G399K+S501A+F555E，D102N+T90V+E574K，
D102N+T90V+A341T+T370S+Q474F+E574K，D102N+T90V+A363S+F555E，
F6L+G29P+A341T+A363S+F555E+E574K等；
D102N+T90V+G399K+S501A+Q464N，T90V+L131V+A341T+Q464N，
T90V+F555E+A376K+G399E+Q474F，K113G+I179S+S218T+Q474F+V492T，
V198A+E204D+Q464N+S501A，T90V+A363S+Q464N，
T90V+A363S+Q474F+F555E，S82A+A363S+A341T+T370S+Q464N，
S82A+Q464N，D102N+T90V+Q464N等。
G3PO的各突变方式对应的突变体的氨基酸序列可以根据野生型G3PO的氨基酸序列(SEQ ID No.:4)，结合相应的突变方式直接推理得到。比如，D102N突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.:1所示，T90V突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.:2所示，D102N+T90V+A363S+Q464N+F555E+E574K六点组合突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.:3所示。
在本发明的一个较佳实施例中，D102N突变体的蛋白比活力(U/mg)、46℃半衰期(min)、46℃孵育20min残余活力百分数，分别为野生型G3PO的97.35％、343.92％、383.41％。
在本发明的一些较佳实施例中，T90V、A363S和F555E突变体的蛋白比活力(U/mg)为野生型G3PO的92.29％～93.25％，46℃半衰期(min)为野生型G3PO的271.96％～321.69％，46℃孵育20min残余活力百分数为野生型G3PO的343.78％～378.80％。
在本发明的一些较佳实施例中，F6L、G29P和G399K突变体的蛋白比活力(U/mg)为野生型G3PO的101.45％～104.82％，46℃半衰期(min)为野生型G3PO的116.40％～182.01％，46℃孵育20min残余活力百分数为野生型G3PO的153.46％～256.22％。
在本发明的一些较佳实施例中，G399E、A376K、G399P、H92Q、A341T、E204D和V209N突变体的蛋白比活力(U/mg)为野生型G3PO的90.60％～99.76％，46℃半衰期(min)为野生型G3PO的145.50％～210.58％，46℃孵育20min残余活力百分数为野生型G3PO的144.24％～258.99％。
在本发明的一些较佳实施例中，S218T、L131V、V198A、T221S、H227R、V228R、E392K、T370S和I179S突变体的蛋白比活力(U/mg)为野生型G3PO的68.67％～88.67％，46℃半衰期(min)为野生型G3PO的124.34％～291.53％，46℃孵育20min残余活力百分数为野生型G3PO的183.87％～337.33％。
在本发明的一些较佳实施例中，S501A、K113G、Q474F、V492T、S82A和Q464N突变体的蛋白比活力(U/mg)为野生型G3PO的21.20％～59.76％，46℃半衰期(min)为野生型G3PO的242.3％～451.85％，46℃孵育20min残余活力百分数为野生型G3PO的247.93％～413.82％。
在本发明的一些较佳实施例中，相较于野生型G3PO，一些组合突变体(比如L4F+E574K，D102N+T90V+E574K和T370S+F555E+E574K)的蛋白比活力提升10％以上，稳定性提高80％以上。
在本发明的一些较佳实施例中，相较于野生型G3PO，一些组合突变体(比如D102N+T90V+A363S+Q464N+F555E+E574K，T90V+A363S+F555E+I179S+V198A，D102N+T90V+Q464N+V492T+F555E+E574K，D102N+T90V+A363S+F555E+F6L，D102N+T90V+A376K+G399K+S501A+F555E，D102N+T90V+E574K，D102N+T90V+A341T+T370S+Q474F+E574K，D102N+T90V+A363S+F555E，F6L+G29P+A341T+A363S+F555E+E574K等组合突变体)的稳定性提高400％以上同时蛋白比活力基本维持不降(比如至少为野生型G3PO蛋白比活力的90％)。
在本发明的一些较佳实施例中，相较于野生型G3PO，一些组合突变体(比如D102N+T90V+G399K+S501A+Q464N，T90V+L131V+A341T+Q464N，T90V+F555E+A376K+G399E+Q474F，K113G+I179S+S218T+Q474F+V492T，V198A+E204D+Q464N+S501A，T90V+A363S+Q464N，T90V+A363S+Q474F+F555E，S82A+A363S+A341T+T370S+Q464N，S82A+Q464N，D102N+T90V+Q464N等组合突变体)的稳定性提升400％以上，蛋白比活力为野生型的30％-80％。
在本发明的一些较佳实施例中，相较于野生型G3PO，一些组合突变体(比如G29P+A341T，T370S+F555E+E574K，F6L+G29P+A341T+A363S+F555E+E574K，L4F+E574K，D102N+T90V+E574K，D102N+T90V+A363S+Q464N+F555E+E574K，T90V+A363S+E574K和D102N+T90V+Q464N+V492T+F555E+E574K等组合突变体)的蛋白比活力较野生型WT均有所提升，达到106.0％～127.6％，且热稳定性提高1.8倍以上。
在本发明的一些较佳实施例中，相较于野生型G3PO，一些组合突变体(比如D102N+T90V+A363S+Q464N+F555E+E574K，T90V+A363S+E574K，D102N+T90V+Q464N+V492T+F555E+E574K，D102N+T90V+E574K，D102N+T90V+A341T+T370S+Q474F+E574K，A363S+T370S+E574K，F6L+G29P+A341T+A363S+F555E+E574K)在48℃下的半衰期较野生型提高至386.7％～822.9％，并且蛋白比活力在野生型的100％以上；一些组合突变体(比如D102N+T90V+A376K+G399K+S501A+F555E，T90V+A363S+F555E+I179S+V198A，T90V+F555E+G399P+Q464N+S501A+E574K，D102N+T90V+A363S+F555E，D102N+F6L+G399K+S501A)在48℃下的半衰期较野生型提高至422.7％～695.2％，并且蛋白比活力为野生型的90％-100％；一些组合突变体(比如T90V+F555E+A376K+G399E+Q474F，T90V+T221S+G399E+I179S，D102N+H92Q+H227R+K113G，E574K+Q464N，D102N+T90V+V492T，G29P+I179S+V198A+V228R+A363S)在48℃下的半衰期较野生型提高至343.4％～580.7％，蛋白比活力为野生型的80％-90％；一些组合突变体(比如D102N+T90V+G399K+S501A+Q464N，T90V+A363S+Q474F+F555E，D102N+T90V+Q464N)在48℃下的半衰期较野生型提高至434.9％～627.7％，蛋白比活力为野生型的70％-80％；一些组合突变体(比如S82A+A363S+A341T+T370S+Q464N，T90V+Q474F，D102N+V492T)在48℃下的半衰期较野生型提高至374.7％～518.1％，蛋白比活力在60％-70％；一些组合突变体(比如T90V+L131V+A341T+Q464N，T90V+A363S+Q464N，D102N+Q464N，S501A+F555E，A363S+Q464N)在48℃下的半衰期较野生型提高至386.7％～562.7％，蛋白比活力为野生型的50％-60％；一些组合突变体(比如K113G+I179S+S218T+Q474F+V492T，S82A+Q464N，)在48℃下的半衰期较野生型提高至434.9.7％～467.5％，但是蛋白比活力低于野生型的50％。
在本发明的一些较佳实施例中，D102N，T90V等一些单点或组合突变体对稳定性提升明显，同时对活力的不利影响不大，蛋白比活力可基本保持不变或变化幅度较小。
在本发明的一些较佳实施例中，相对于野生型G3PO，一些组合突变体的蛋白比活力、48℃半衰期、孵育20min后的残余活力均有较大提升。比如D102N+T90V+A363S+Q464N+F555E+E574K六点组合突变体，蛋白比活力较野生型提高至109.3％，48℃半衰期提升至野生型的822.9％，孵育20min后的残余活力相较于野生型也大幅度提高。
需要说明的是，蛋白比活力下降对G3PO突变体的应用影响可以通过增加酶用量来克服或缓解，因此，在稳定性显著提升的情况下，即使蛋白比活力存在一定程度的下降也在本发明的保护范围之内。作为举例，可接受的蛋白比活力的变化程度比如在野生型G3PO的30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、100％以上。这里的“以上”包括本数。在本发明的一些较佳实施例中，优选的G3PO突变体的蛋白比活力至少为野生型的50％。
本发明第二方面提供了一种甘油磷酸氧化酶突变体(G3PO突变体)的融合蛋白，其为第一方面所述G3PO突变体的融合蛋白。在本发明的一些较佳实施方式中，所述融合蛋白在第一方面所述甘油磷酸氧化酶突变体的N端和/或C端连接有融合标签。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述融合标签包括亲和标签、荧光标签等中的至少一种。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述亲和标签选自：His-tag、GST、Flag-tag、MBP及其组合，对亲和标签的选择还可以参考文献Protein Expression andPurification,41(2005)98–105，包括但不限于树脂类型和洗脱试剂均可参考该文献。
本发明第三方面提供了一种核酸构建物，其核苷酸序列选自下述任一种：
(i)编码第一方面所述甘油磷酸氧化酶突变体(G3PO突变体)或者第二方面所述融合蛋白的核苷酸序列；和
(ii)与(i)中所述核苷酸序列互补的核苷酸序列。
所述核酸构建物可以为DNA、mRNA或者其组合。
以野生型G3PO的基因为模板，可得到编码所述G3PO突变体的核酸构建物。
第一方面所述G3PO突变体的编码序列，以及第二方面所述融合蛋白的编码序列，均在本发明第三方面所述核酸构建物的范围内。
本发明第四方面提供了一种重组载体，所述重组载体含有第三方面所述核酸构建物。
在本发明的一些较佳实施方式中，将第三方面所述核酸构建物克隆到表达载体上，可以得到含有所述G3PO突变体或其融合蛋白的编码序列的重组载体。
在本发明的一些较佳实施方式中，将编码G3PO突变体的核酸构建物克隆到表达载体上，可得到含有所述G3PO突变体的编码序列的重组载体。
在本发明的一些较佳实施方式中，在含有所述G3PO突变体的编码序列的质粒上，还在G3PO突变体基因的5’端或3’端添加亲和标签。所述亲和标签可以是His-tag、GST、Flag-tag、MBP等亲和标签的一种或者其组合。
本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒、粘粒等。在生产本发明中的G3PO突变体时，可以将G3PO突变体的编码序列可操作地连接于表达调控序列，从而形成G3PO突变体的表达载体。所述表达调控序列包括但不限于转录增强元件、翻译增强元件等。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述重组载体为含有第三方面所述核酸构建物的表达质粒。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述重组载体的类型选自：pET 28a，pET 30a，pANY1，pQE30，pG-KJE8，pGRO7，pKJE7，pG-Tf2，pTf16，pUC18，pUC19和pGEX，可参考相关文献Biotechnol Lett(2008)30:755–762；Appl Environ Microb(2002)68(1):263-270，可购自Biovector中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心。这些均是本领域的已知质粒载体，本领域的普通技术人员可以知晓、理解和使用。
本发明第五方面提供了一种工程菌，所述工程菌的基因组整合有第三方面所述核酸构建物，或者所述工程菌含有第四方面所述重组载体。
所用的第四方面所述重组载体，可以为游离形式，也可以整合入基因组。
本发明第六方面提供了一种基因工程细胞，所述基因工程细胞的基因组整合有第三方面所述核酸构建物，或者所述基因工程细胞含有第四方面所述重组载体。在本发明的一些较佳实施方式中，所述基因工程细胞来源于大肠杆菌。
所用的第四方面所述重组载体，可以为游离形式，也可以整合入基因组。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述工程菌来源于原核生物。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述工程菌来源于大肠杆菌。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述工程菌来源于大肠杆菌BL21(DE3)。
在本发明的一些较佳实施方式中，将第四方面所述重组载体转化到宿主菌中，得到的重组表达菌株能够表达合成第一方面所述G3PO突变体或者第二方面所述融合蛋白。
在本发明的一些较佳实施方式中，将含有所述G3PO突变体的编码序列的重组载体转化到宿主菌中，可以得到能够进行G3PO突变体的基因表达的重组表达菌株。所得重组表达菌株中含有编码所述G3PO突变体的核酸构建物，且含有所述重组载体。
本发明第七方面提供了一种从突变文库中筛选甘油磷酸氧化酶突变体的方法，包括以下步骤：
(1)构建如SEQ ID No.:4所示的野生型G3PO的突变文库，在野生型的基础上，基于理性和半理性设计了50多个突变体，突变位点包括：4、6、29、55、78、82、90、92、100、102、113、119、123、127、131、147、179、196、198、204、209、218、221、227、228、261、269、341、363、370、376、392、399、452、460、463、464、466、470、474、492、501、531、547、555、560、572、574和584，得到由G3PO突变体组成的突变文库；突变方式包括单点突变方式及组合突变方式；
(2)以野生型G3PO的基因为模板，得到所述突变文库中各G3PO突变体的编码序列；
(3)对所述突变文库中各G3PO突变体分别构建重组载体，转化到宿主菌中得到重组表达菌株，诱导所述重组表达菌株，表达得到所述突变文库的G3PO突变体或其融合蛋白(对应第一方面所述G3PO突变体或第二方面所述融合蛋白)；当所述重组载体中的G3PO突变体的编码序列连接有融合标签(如亲和标签时)，表达得到所述突变文库的G3PO突变体的融合蛋白；
(4)对所述G3PO突变体或其融合蛋白进行蛋白比活力和稳定性分析，筛选得到第一方面所述G3PO突变体或者第二方面所述融合蛋白。
本发明第八方面提供了一种甘油磷酸氧化酶突变体(G3PO突变体)的制备方法，包括以下步骤：
(1)将第三方面所述核酸构建物克隆到表达载体上，得到含有所述G3PO突变体或其融合蛋白的编码序列的重组载体；
(2)将所述重组载体转化到宿主菌中，得到含有所述G3PO突变体或其融合蛋白的编码序列的重组表达菌株；
(3)诱导所述重组表达菌株，在适宜表达条件下表达得到所述G3PO突变体或其融合蛋(对应第一方面所述G3PO突变体或者第二方面所述融合蛋白)。在本发明的一些较佳实施方式中，所述G3PO突变体的制备方法在第(3)步之后还进行分离纯化步骤，制备纯化的G3PO突变体。所述分离纯化可以采用本领域已知的从宿主菌中分离纯化蛋白质的方法，包括但不限于离心、柱层析、膜过滤、超滤等方法。
本发明制备方法可以进行批量的制备和纯化。
在本发明的一些较佳实施方式中，所述宿主菌为大肠杆菌，此时第(2)步得到的重组表达菌株为大肠杆菌的重组表达菌株。
在本发明的一些较佳实施方式中，大肠杆菌的重组表达菌株的适宜表达条件包括：0.1mM IPTG，质量浓度0.1％的诱导前体物质，25℃诱导16小时。进一步地，在本发明的一些较佳实施方式中，所述诱导前体物质可以为FAD、核酸素、核黄素类似物或者其组合。在本发明的一些较佳实施方式中，所述核黄素类似物的举例包括但不限于：核黄素磷酸钠，核黄素磷酸钾，核黄素碘盐等。
在本发明的一些较佳实施方式中，在含有G3PO突变体的编码序列的质粒上，还可以在G3PO突变体基因的5’端或3’端添加亲和标签。所述亲和标签可以是His-tag、GST、Flag-tag、MBP等亲和标签的一种或者其组合。连接正确后转化至宿主菌中，得到重组表达菌株(是一种第五方面所述的工程菌)，经表达可以得到第二方面所述G3PO突变体。对表达产物可以利用亲和标签采用亲和层析柱进行纯化。在本发明的一些较佳实施方式中，采用简单的亲和层析方法，可以纯化得到纯度大于90％的G3PO突变体。
对甘油磷酸氧化酶突变体产物进行活力检测的原理如下：
反应生成的醌亚胺量可采用分光光度计在555nm波长处检测。
甘油磷酸氧化酶及其突变体的酶活定义为：单位酶活定义为在一定条件下，每分钟消耗1μmol甘油-3-磷酸所需的酶量。
本发明第九方面提供了第一方面所述甘油磷酸氧化酶突变体、第二方面所述融合蛋白、第三方面所述核酸构建物、第四方面所述重组载体、第五方面所述工程菌以及第六方面所述基因工程细胞在血清甘油三酯含量检测方面的应用。
本发明中，可以采用本领域技术人员已知的检测方法进行血清甘油三酯含量检测，比如可以参照专利文献CN 107991477 A中的检测方法。
下面对本发明的实施例作详细说明。本发明的实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中未注明具体条件的实验方法(比如PCR扩增、化学转化法等)，优选地按照具体实施方式部分的方法和条件进行；然后通常按照常规方法和条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的方法和条件，或者按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：甘油磷酸氧化酶稳定性突变文库构建
分子定向进化是利用现代分子生物学方法创造大量的突变同源基因文库人为模拟自然进化机制，采用灵敏的定向筛选策略，创造出自然界不存在的或某些特性有显著改变的突变蛋白质或其他生物分子。分子定向进化已广泛应用于蛋白质的分子改造，被认为是改良全新蛋白质特性或调控序列的最高效方法。本实施例基于Aerococcus viridans甘油磷酸氧化酶的蛋白结构和生物信息学相关信息，应用Consensus Concept理论，构建了一个定点饱和突变文库，这些突变位点如表3所示，对应一系列甘油磷酸氧化酶突变体(G3PO突变体)，其中WT表示野生型。根据这些位点分别设计引物(表3)，以野生型G3PO为模板，确定各G3PO突变体的编码序列，进行PCR扩增，将得到的突变后的PCR产物转入表达体系，构建得到重组表达菌株，送测序验证，得到测序验证正确后的突变体菌株。所述突变体菌株，也即G3PO突变体的重组表达菌株。
表3稳定性突变体文库构建的引物序列
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表4稳定性突变文库中G3PO的单点突变体的活力和稳定性测试数据，以及以野生型G3PO的数据为基数的归一化数据
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实施例2：甘油磷酸氧化酶(包括野生型和突变体)的重组表达菌株的构建
将甘油磷酸氧化酶基因克隆到表达载体上，构建重组载体和重组表达菌株。
野生型G3PO：基于文献调研和序列分析，Aerococcus viridans菌株中含有甘油-3-磷酸氧化酶(G3PO)的野生型基因序列，以该菌株基因组为模板，设计引物，进行PCR扩增，获得目的基因序列。采用酶切连接的方法构建表达质粒，采用BamH I和Xho I双酶切PCR产物，纯化后的片段与经BamH I和Xho I双酶切的质粒pET28a连接，采用化学转化法转化至E.coli BL21(DE3)中，其中，构建的质粒N端带有6个His，且卡那霉素抗性筛选阳性克隆。采用市售的质粒抽提试剂盒提取阳性克隆的质粒，经BamH I和Xho I双酶切鉴定，获得1900bp左右的DNA片段，经测序鉴定该基因序列正确，即构建成功。在25℃，0.1mM IPTG，质量浓度0.1％的核黄素磷酸盐条件下进行诱导表达、生产甘油磷酸氧化酶，进行活力检测和SDS-Page表达验证。
G3PO突变体：采用相同的方法，将实施例1确定的突变文库的G3PO突变体的编码序列分别独立地克隆到表达载体上，构建重组载体后，再构建重组表达菌株，可以分别得到各G3PO突变体的重组表达菌株。
实施例3：甘油磷酸氧化酶(包括野生型和突变体)的表达、纯化和SDS-PAGE验证
以甘油磷酸氧化酶为目的蛋白，包括野生型G3PO和实施例1的突变文库中的G3PO突变体。
3.1.甘油磷酸氧化酶的表达
取实施例2构建好的重组表达菌株的重组表达细胞菌液，以0.1％的接种量接种于含10mL LB培养基试管中，37℃过夜培养，过夜培养后的种子液以1:100的比例接种于含100mL LB锥心瓶培养基中，37℃振荡培养3h左右，待OD600长至0.8-1.0时，摇床降温至25℃后加入终浓度0.1mM的IPTG，质量浓度0.1％的核黄素磷酸盐，诱导过夜后收集菌体。将收集的菌体按照菌种和重悬缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，0.1M NaCl)质量体积比1:10的比例重悬细胞菌体，冰浴超声破碎，破碎条件为超声4s，停2s，功率40％，共超声15min。超声破碎后的液体离心后上清液体，即为表达得到的目的蛋白的酶液。
3.2.甘油磷酸氧化酶的纯化
取上述步骤3.1.的超声破碎后所得酶液用0.22μm滤膜过滤后备用，准备一个2mL的NTA亲和层析填料柱，用10倍柱体积平衡缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 8.0,0.1M NaCl)进行平衡，然后将过膜后的酶液上样，5倍柱体积的除杂缓冲液(10mM咪唑，50mM Tris-HCl,pH8.7,400mM NaCl)冲洗柱子，5倍柱体积的200mM咪唑洗脱液洗脱目的蛋白，接着5倍柱体积的500mM咪唑缓冲液洗柱，收集每步纯化的过程样品，得到的含目的蛋白的洗脱液即为咪唑洗脱酶液，方便后续分析。
3.3.甘油磷酸氧化酶的SDS-PAGE测试
野生型甘油磷酸氧化酶由611个氨基酸组成，氨基酸序列如SEQ ID No.:4所示，分子量(Molecular Weight)约为66kDa。将上述步骤3.2.中目的蛋白的200mM咪唑洗脱酶液用50mM Tris-HCl在4℃透析两次，除掉buffer中的NaCl和咪唑。然后将上述的纯化过程样品和透析后的酶液进行12％SDS-PAGE跑胶测试，破碎按照1g菌体对应10mL缓冲液重悬，上清和沉淀分别稀释10倍后上样。图3显示其中一种G3PO突变体T90V的SDS-PAGE测试结果，其中，泳道1～9分别对应如下：泳道1，破碎上清；泳道2，破碎后沉淀；泳道3，流穿液；泳道4，除杂；泳道5，200mM洗脱；泳道6，400mM洗脱；泳道7，透析液(5和6混合)；泳道8，500mM洗柱1；泳道9，500mM洗柱2。从图3中可以看到，在66kDa处有一条明显的目的蛋白条带，表明G3PO突变体在大肠杆菌中成功进行了异源重组表达。
实施例4：甘油磷酸氧化酶(野生型和突变体)的活力和半衰期检测
反应液：50mM pH 8.0Tris-HCl缓冲液，0.1M甘油磷酸二钠，75U/mL POD，7.5mMTOOS，7.5mM 4-Aminoantipyrine。
酶稀释样品：用20mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.5，用质量浓度0.2％BSA将待测酶液释至0.15-0.35U/mL进行检测。
半衰期检测：将野生型和突变体纯化后的酶液用酶稀释液稀释至蛋白浓度1mg/ml后，单点突变置于46℃水浴锅中水浴不同时间取出后置于4℃或冰上，组合突变体置于48℃下水浴不同时间取出后置于4℃或冰上；分别按照以下活力检测方法检测水浴不同时间后的残余蛋白比活力，并计算水浴20min后的残余活力。
酶活测定方法：取1mL反应液在37℃分光光度计中温育2min后，加入0.02mL酶稀释样品，移液枪吹打均匀，然后在555nm波长下测定1min内的OD变化值。酶活计算公式为：
Weight activity(U/mg)＝Volume activity×1/C
式中各符号或数字分别表示如下，
Volume activity：体积比活力(U/mL)
Weight activity：质量比活力(U/mg)
ΔA：吸光度变化
1.02：反应液总体积(mL)；
0.02：酶液体积(mL)；
1：反应时间(min)；
1/2：1mol过氧化氢生成1/2mol醌亚胺染料；
df：稀释倍数；
C：酶浓度(mg/mL)；
39.2：标准反应条件下，生色基团在555nm处毫摩尔吸光系数(cm2/μmol)。
实施例5：稳定性定点饱和突变文库筛选
将测序验证后的突变体菌株按照实施例3所述的各步骤进行表达、纯化和验证。将透析后的洗脱酶液全部用50mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液稀释至蛋白浓度1mg/mL，浓度不足1mg/mL的酶液用超滤管浓缩后稀释。分别按照活力检测方法检测各突变体的以下三种参数：蛋白比活力、46℃温度下的半衰期、46℃条件下孵育20min后的残余活力。野生型G3PO(对照组)和各G3PO突变体的测试结果如表1所示，表4中还以野生型G3PO的数值为基准，将各G3PO突变体的数据进行了归一化，以便于比较，归一化的数据对比结果还参照图1；其中，WT表示野生型。
D102N突变体的蛋白比活力(U/mg)、46℃半衰期(min)、46℃孵育20min残余活力百分数，分别为野生型G3PO的97.35％、343.92％、383.41％。热稳定性提高了2倍以上。
T90V、A363S和F555E突变体的蛋白比活力(U/mg)为野生型G3PO的92.29％～93.25％，46℃半衰期(min)为野生型G3PO的271.96％～321.69％，46℃孵育20min残余活力百分数为野生型G3PO的343.78％～378.80％。热稳定性提高了2倍以上。
F6L、G29P和G399K突变体的蛋白比活力(U/mg)为野生型G3PO的101.45％～104.82％，46℃半衰期(min)为野生型G3PO的116.40％～182.01％，46℃孵育20min残余活力百分数为野生型G3PO的153.46％～256.22％。三种突变体的蛋白比活力和热稳定性相对于野生型均有提升，蛋白比活力略有提升，热稳定性显著提升。
G399E、A376K、G399P、H92Q、A341T、E204D和V209N突变体的蛋白比活力(U/mg)为野生型G3PO的90.60％～99.76％，46℃半衰期(min)为野生型G3PO的145.50％～210.58％，46℃孵育20min残余活力百分数为野生型G3PO的144.24％～258.99％。热稳定性明显提升的情况下，蛋白比活力仅略有下降。
S218T、L131V、V198A、T221S、H227R、V228R、E392K、T370S和I179S突变体的蛋白比活力(U/mg)为野生型G3PO的68.67％～88.67％，46℃半衰期(min)为野生型G3PO的124.34％～291.53％，46℃孵育20min残余活力百分数为野生型G3PO的183.87％～337.33％。热稳定性提升显著，但蛋白比活力有所下降。
S501A、K113G、Q474F、V492T、S82A和Q464N突变体的蛋白比活力(U/mg)为野生型G3PO的21.20％～59.76％，46℃半衰期(min)为野生型G3PO的242.3％～451.85％，46℃孵育20min残余活力百分数为野生型G3PO的247.93％～413.82％。尽管热稳定性提升的极为显著，但蛋白比活力下降相对多一些。
其中，D102N、T90V、A363S和F555E突变体的蛋白比活力达到野生型G3PO的90％以上，在46℃温度下半衰期从野生型G3PO的18.9min增加到51.4～65min，孵育20min的残余活力从21.7％增加到74.6％～83.2％。其中，相对较佳的突变体为D102N。
实施例6：组合突变文库构建及筛选
根据实施例5单点突变的结果可以看出突变体D102N、T90V、A363S、F555E、F6L、G29P、G399K、G399E、A376K、G399P、H92Q、A341T、E204D、V209N、S218T、L131V、V198A、T221S、H227R、V228R、E392K、T370S、I179S、S501A、K113G、Q474F、V492T、S82A、Q464N等在活力或半衰期上较野生型G3PO有所提升，因此设计如下表5所示的一系列突变体，构建组合突变文库后直接送基因合成后，再按照实施例2、实施例3和实施例4中的表达、纯化和检测方法表征这些突变体性质。
以野生型WT作为对照，提高检测突变体半衰期检测温度到48℃，观测不同组合方式的突变体可否进一步提升G3PO的热稳定性，同时将G3PO的各组合突变体的数据进行了归一化，以便于比较，归一化的数据对比结果如表5和图2所示。
从实验结果中可知，G29P+A341T，T370S+F555E+E574K，F6L+G29P+A341T+A363S+F555E+E574K，L4F+E574K，D102N+T90V+E574K，D102N+T90V+A363S+Q464N+F555E+E574K，T90V+A363S+E574K和D102N+T90V+Q464N+V492T+F555E+E574K组合突变体的蛋白比活力较野生型WT均有所提升，达到106.0％～127.6％，热稳定性提高1.8倍以上。
从实验结果中还可知，T90V+A363S+Q464N，T90V+A363S+E574K，D102N+F6L+G399K+S501A，A363S+T370S+E574K，T90V+A363S+Q474F+F555E，E574K+Q464N，D102N+Q464N，D102N+T90V+A363S+F555E+F6L，T90V+Q474F，D102N+T90V+Q464N，D102N+V492T，D102N+T90V+G399K+S501A+Q464N，D102N+T90V+V492T，T90V+F555E+A376K+G399E+Q474F，S501A+F555E，D102N+T90V+E574K，D102N+T90V+A363S+F555E，S82A+Q464N，S82A+A363S+A341T+T370S+Q464N，K113G+I179S+S218T+Q474F+V492T，D102N+T90V+A376K+G399K+S501A+F555E，T90V+L131V+A341T+Q464N，D102N+H92Q+H227R+K113G，A363S+Q464N，D102N+T90V+A341T+T370S+Q474F+E574K，V198A+E204D+Q464N+S501A，T90V+F555E+G399P+Q464N+S501A+E574K，T90V+A363S+F555E+I179S+V198A，F6L+G29P+A341T+A363S+F555E+E574K，G29P+I179S+V198A+V228R+A363S，D102N+T90V+A363S+Q464N+F555E+E574K，T90V+T221S+G399E+I179S，D102N+T90V+Q464N+V492T+F555E+E574K组合突变体在48℃下的半衰期较野生型提高至374.7％～822.9％，蛋白比活力为野生型的38.2％～109.3％。有些突变体稳定性提高较多，但是活力相对下降明显，例如位点Q464N对稳定性的提升极为明显，但是活力下降相对较多；E574K对酶活有明显提升，但是稳定性急剧下降；D102N，T90V等一些突变体则对稳定性提升明显，同时未对活力产生明显不利，蛋白比活力能够基本保持不变或变化幅度较小。
从表4、表5、图1、图2的结果可以看出，含有较佳单点突变的组合突变，特别是这些较佳单点突变组合而成的组合突变，能够对稳定性的提升产生更好的效果。
在上述单点突变的基础上所做的如下组合突变体并未列出所有可能的排列组合，但是可以总结归纳出一些对稳定性和蛋白比活力极为重要的位点，结合表5所示数据。在表5及图2所示例的组合突变方式中，最优示例为D102N+T90V+A363S+Q464N+F555E+E574K六点组合突变体，其蛋白比活力提高至野生型G3PO的109.3％，48℃半衰期提升至野生型G3PO的822.9％，稳定性均极大幅度地提高。
表5稳定性突变文库中部分组合突变体的活力及其48℃的半衰期
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以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 瀚海新酶生物科技有限公司
<120> 一种甘油磷酸氧化酶突变体及其筛选方法、制备方法和应用
<130> 2021
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 611
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ser Lys Leu Ser Phe Lys Tyr Arg Lys Glu Thr Val Glu Gln Leu
1 5 10 15
Lys Glu Asn Gln Tyr Asp Leu Phe Ile Ile Gly Gly Gly Ile Thr Gly
20 25 30
Ala Gly Val Ala Ile Gln Ala Ala Ala Ser Gly Leu Lys Thr Ala Leu
35 40 45
Val Asp Met Gln Asp Phe Ser Glu Gly Thr Ser Ser Arg Ser Thr Lys
50 55 60
Leu Val His Gly Gly Ile Arg Tyr Leu Lys Asn Phe Asp Leu Glu Val
65 70 75 80
Val Ser Asp Thr Val Thr Glu Arg Ala Thr Val His Asn Ile Ala Pro
85 90 95
His Ile Pro Gln Pro Asn Pro Met Leu Met Pro Leu Tyr Asp Glu Pro
100 105 110
Lys Val Thr Phe Asn Pro Leu Arg Leu Gln Ile Ala Met Asp Ile Tyr
115 120 125
Asp Ser Leu Ala Gly Val Lys Asp Ser Gln Tyr Ala Asn Glu Met Leu
130 135 140
Ser Lys Asp Glu Val Leu Ser Arg Gln Pro Asp Leu Met Ala Glu Gly
145 150 155 160
Leu Ile Gly Gly Gly Lys Tyr Leu Asp Phe Asn Asn Asn Asp Ser Arg
165 170 175
Leu Val Ile Glu Asn Ile Lys Gln Ala Asn Asp Asp Gly Ala Asp Leu
180 185 190
Leu Ser His Ala Lys Val Val Gly Phe Glu Tyr Glu Asn Asp Lys Ile
195 200 205
Val Ala Val Lys Val Glu Asp Leu Leu Ser Gly Glu Thr Phe Thr Val
210 215 220
Lys Ser His Val Val Ile Asn Thr Thr Gly Pro Trp Ser Asp Thr Ile
225 230 235 240
Arg Gln Leu Asp Gly Ser Asp Lys Lys Pro Ala Gln Met Arg Pro Thr
245 250 255
Lys Gly Val His Phe Val Val Asp Lys Ser Lys Leu Thr Val Ser Gln
260 265 270
Pro Ile Tyr Phe Asp Thr Gly Glu Gln Asp Gly Arg Met Val Phe Val
275 280 285
Leu Pro Arg Glu Asn Lys Thr Tyr Phe Gly Thr Thr Asp Thr Asp Tyr
290 295 300
Thr Gly Asp Phe Glu His Pro Thr Val Thr Gln Glu Asp Val Asp Tyr
305 310 315 320
Leu Leu Arg Val Val Asn His Arg Phe Pro Asn Ala Asn Leu Ser Ile
325 330 335
Asn Asp Ile Glu Ala Ser Trp Ala Gly Leu Arg Pro Leu Ile Asp Ser
340 345 350
Asn Asn Ala Ser Asp Tyr Asn Gly Gly Asp Ala Gly Arg Leu Ser Glu
355 360 365
Arg Thr Phe Asp Glu Leu Val Ala Leu Phe Asp Asp Tyr Ser Lys Asp
370 375 380
Lys Val Glu Arg Ser Thr Val Glu Asp Lys Leu Gln Asp Leu Gly Ser
385 390 395 400
Asn Thr Ser Glu Arg Gly Asp Gly Ser Pro Ser Ser Val Ser Arg Gly
405 410 415
Ser Asp Leu Ser Val Ala Pro Ser Gly Leu Phe Thr Leu Ala Gly Gly
420 425 430
Lys Ile Thr Asp Tyr Arg Lys Met Ala Lys Gly Ala Met Glu Arg Ile
435 440 445
Ile Pro Val Val Thr Asp Ile Thr Gly Lys Ser Tyr Glu Leu Val Gln
450 455 460
Ser Ser Thr Tyr Pro Ile Ser Gly Gly Gln Phe Asp Pro Asn Ser Tyr
465 470 475 480
Glu Thr Ala Met Glu Lys Phe Ala Asn Val Gly Val Ala Arg Gly Leu
485 490 495
Thr Tyr Gly Gln Ser Leu Asn Leu Ala Lys Leu Tyr Gly Ser Asn Met
500 505 510
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> Aerococcus viridans Wide-type G3PO
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595 600 605
Tyr Leu Lys
610
Claims (16)
1.一种甘油磷酸氧化酶突变体，其特征在于，所述甘油磷酸氧化酶突变体基于野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列进行定点突变，所述野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，突变方式选自：D102N及包括D102N突变方式的组合突变方式；
所述组合突变方式选自以下任一种组合突变方式：
D102N+T90V，D102N+A363S，D102N+F555E，
D102N+T90V+V228R，D102N+T90V+E574K，D102N+T90V+A363S，
D102N+T90V+A363S+F555E，D102N+F6L+G399K+S501A，
D102N+T90V+A363S+F555E+F6L，D102N+T90V+A376K+G399K+S501A+F555E，
D102N+T90V+A341T+T370S+Q474F+E574K，
D102N+T90V+A363S+Q464N+F555E+E574K或
D102N+T90V+Q464N+V492T+F555E+E574K。
2.一种甘油磷酸氧化酶突变体的融合蛋白，其特征在于，所述甘油磷酸氧化酶突变体的融合蛋白在权利要求1所述甘油磷酸氧化酶突变体的N端和/或C端连接有融合标签。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合标签包括亲和标签。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述亲和标签选自：His-tag、GST、Flag-tag、MBP及其组合。
5.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物的核苷酸序列为下组中任一种核苷酸序列：
(i) 编码权利要求1所述甘油磷酸氧化酶突变体或权利要求2-4中任一项所述融合蛋白的核苷酸序列；和
(ii)与(i)中所述核苷酸序列互补的核苷酸序列。
6.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物为DNA、mRNA或者其组合。
7.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求5或6 所述核酸构建物。
8.如权利要求7所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的类型选自：pET 28a，pET30a，pANY1，pQE30，pG-KJE8，pGRO7，pKJE7，pG-Tf2，pTf16，pUC18，pUC19和pGEX。
9.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌的基因组整合有权利要求5或6所述核酸构建物，或者所述工程菌含有权利要求7或8所述重组载体。
10.如权利要求9所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌来源于大肠杆菌。
11.一种基因工程细胞，其特征在于，所述基因工程细胞的基因组整合有权利要求5或6所述核酸构建物，或者所述基因工程细胞含有权利要求7或8所述重组载体。
12.如权利要求11所述的基因工程细胞，其特征在于，所述基因工程细胞来源于大肠杆菌。
13.一种甘油磷酸氧化酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将权利要求5或6所述核酸构建物克隆到表达载体上，得到含有所述甘油磷酸氧化酶突变体或其融合蛋白的编码序列的重组载体；
（2）将所述重组载体转化到宿主菌中，得到含有所述甘油磷酸氧化酶突变体或其融合蛋白的编码序列的重组表达菌株；
（3）诱导所述重组表达菌株，在适宜表达条件下表达得到所述甘油磷酸氧化酶突变体或其融合蛋白。
14.如权利要求13所述的甘油磷酸氧化酶突变体的制备方法，其特征在于，所述重组表达菌株为大肠杆菌。
15.如权利要求13所述的甘油磷酸氧化酶突变体的制备方法，其特征在于，所述适宜表达条件包括：0.1 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，0.1wt%的诱导前体物质，25 °C诱导16小时；其中，所述诱导前体物质为黄素腺嘌呤二核苷酸、核酸素、核黄素类似物或者其组合。
16.权利要求1所述甘油磷酸氧化酶突变体、权利要求2-4中任一项所述融合蛋白、权利要求5或6所述核酸构建物、权利要求7或8所述重组载体以及权利要求9或10所述工程菌及权利要求11或12所述基因工程细胞在血清甘油三酯含量检测方面的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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