CN114958813B - 一种碱性蛋白酶sp4及其突变体、编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种碱性蛋白酶SP4及其突变体、编码基因和应用。所述碱性蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。蛋白酶SP4及其突变体SP4‑M1的最适温度、最适pH、pH和热稳定性并未发生明显变化，但SP4‑M1的比活力较野生型提高了50％。此外洗涤环境稳定性检测结果也显示，蛋白酶SP4及其催化活性提高的突变体SP4‑M1洗涤剂稳定性良好，具有洗涤用蛋白酶制剂的应用潜力。

Description

一种碱性蛋白酶SP4及其突变体、编码基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种碱性蛋白酶SP4及其突变体、编码基因和应用。
背景技术
蛋白酶是一类重要的肽键水解酶类，其广泛的存在于动物、植物和微生物中。长久以来，蛋白酶一直占据全球酶制剂市场60％以上的销售份额，被广泛的应用于食品、饲料、皮革和、洗涤和医药等众多工业领域。而洗涤用酶占到全工业领域用酶制剂的2/5左右，是不可忽视的重要应用领域。欧美等发达国家的衣料用洗涤剂中加酶洗涤剂的占比高达80％。1913年，德国化学家Otto最早提出了加酶洗涤剂这一应用策略，并将从动物胰脏中提取到的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶加入到洗涤剂中用于实际生产。但是由于动物源胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在碱性洗涤剂中的不稳定性和生产成本过高，洗涤用蛋白酶并未得到有效的发展。直到七八十年代，解决了酶制剂生产成本过高的源头问题，洗涤用酶制剂得以获得了飞速发展的机会。酶制剂作为一种绿色、高效的优良添加剂被广泛应用到洗涤行业中，时至今日，蛋白酶依然是洗涤行业中应用最多的酶种。这主要得益于日常生活中，蛋白质污渍是主要的污渍种类，并且难以完全去除，如奶渍、汗渍、血渍、各种食物污渍以及人体皮肤细胞新陈代谢产生的角质等。蛋白酶能够高效水解蛋白质中的肽键，将难溶大分子降解为易溶小分子而被清除。
目前洗涤剂市场上添加的主要是碱性蛋白酶，大多以细菌来源的碱性蛋白酶为主，这些酶的最适pH范围主要在9.0-10.0之间，最适温度范围主要集中在50-60℃。但是在实际洗涤过程中，家用洗涤环境一般控制温度在30-40℃，而商用洗涤环境甚至更低。此外，随着人们对衣料品质的追求，碱性洗涤剂正在慢慢退出历史舞台，取而代之的是更为柔和的中性洗涤剂。因此洗涤用酶的实际应用效果大打折扣。相较于细菌来源的碱性蛋白酶，真菌来源的蛋白酶有着更为丰富的资源库。因此，挖掘真菌来源的中低温碱性蛋白酶来丰富洗涤用酶制剂市场，为行业发展奠定基础尤为重要。
酶的催化活性一直是衡量酶工业化重要指标之一，是酶制剂领域的研究重点。除了从根源上挖掘得到高酶活的野生型蛋白酶外，还可以通过蛋白质工程的手段对蛋白酶分子进行分子改良，以获得催化活性更为优异的突变体来满足工业生产的需要。植酸酶、葡萄糖氧化酶、淀粉酶等重要工业酶种都通过蛋白质工程化改造得到了大量催化活性优异的酶种用以工业生产中。
发明内容
本发明的目的是提供一种洗涤用碱性蛋白酶SP4。
本发明在于目的是提供上述碱性蛋白酶SP4的突变体SP4-M1。
本发明的再一目的是提供上述蛋白酶SP4及突变体SP4-M1的基因。
本发明的再一目的是提供包含上述蛋白酶SP4及突变体SP4-M1编码的重组载体。
本发明的再一目的是提供包含上述蛋白酶基因sp4及突变体基因sp4-m1的重组菌株。
本发明的再一目的是提供上述蛋白酶及突变体SP4-M1的应用。
本发明提供一种来源于Fusarium pseudograminearum的中碱性蛋白酶SP4，其在温度、pH和稳定性方面表现优异，在洗涤剂行业有着巨大的应用潜力，弥补了市场中洗涤用蛋白酶不适合中低温洗涤和中性洗涤剂的技术不足，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1：
其中，该酶全长为389个氨基酸，N端前15个氨基酸为信号肽序列，使用双下划线作为标注；第16位到108位氨基酸为蛋白酶前导肽序列，使用单下环线标注。碱性蛋白酶SP4以成熟酶形式存在于发酵液上清中，因此其成熟酶理论分子量为28.3kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
该蛋白酶的最适pH为8.5，在pH 7.0-pH 10.0范围内，相对酶活在80％以上；25℃条件下在各个pH缓冲液中孵育1小时，蛋白酶SP4在pH 4.0-pH 12.0可以保持90％以上剩余酶活。最适温度40℃，在30-45℃条件下具有70％以上的相对酶活力；其在25-35℃条件下孵育1h可以保持70％以上剩余酶活。
本发明还提供了编码上述蛋白酶的基因。本发明通过提取RNA和反转录的方法分离克隆了这个蛋白酶基因sp4，其cDNA全长为1170bp，编码信号肽的核苷酸序列使用双下划线作为标注，编码前导肽的核苷酸序列使用单下划线作为标注，其序列如SEQ ID NO.3所示：
根据本发明的具体实施方式，将上述中碱性蛋白酶SP4的第70位氨基酸Gln突变为Asn，第142位氨基酸Asp突变为Ser和第143位Ala突变为Ser。结果表明，与野生型蛋白酶SP4相比，突变体SP4-M1的最适pH值、最适温度并未发生变化，但比活力相较于野生型提高了约50％。
根据本发明的催化活性提高的蛋白酶突变体SP4-M1，其氨基酸序列SEQ ID NO：4所示:
本发明提供了编码上述催化活性提高的蛋白酶突变体的基因sp4-m1，所述基因编码通过以下定点突变获得的突变体，(2)通过对氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的碱性蛋白酶进行Q178N/D250S/A251S定点突变而得，或者(2)通过对氨基酸序列如SEQ ID NO：2的碱性蛋白酶进行Q70N/D142S/A143S定点突变而得；或者(3)将氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的碱性蛋白酶去除N端前15个氨基酸后进行Q163N/D235S/A236S定点突变而得。
根据本发明的编码上述催化活性提高的蛋白酶突变体的基因sp4-m1，将氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的碱性蛋白酶去除N端前15个氨基酸后进行Q163N/D235S/A236S定点突变而得的突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
本发明还提供了包含上述蛋白酶和突变体基因的重组载体，优选为pPICZαA-sp4和pPICZαA-sp4-m1。
本发明还提供了包含上述蛋白酶和突变体基因载体的重组菌株GS115/sp4、GS115/sp4-m1。
本发明还提供了一种制备蛋白酶的方法，包括以下步骤：
(1)以上述重组表达载体转化宿主细胞；
(2)培养并诱导宿主细胞异源表达蛋白酶SP4及其突变体SP4-M1；
(3)分离纯化获得蛋白酶SP4及其催化活性提高的蛋白酶SP4-M1。
本发明还提供了洗涤用蛋白酶洗涤环境稳定性的检测方法，通过表面活性剂、有机溶剂和洗涤剂稳定性来初步评估蛋白酶是否具有洗涤用酶制剂应用前景。
根据本发明的具体实施方式，将克隆得到的真菌来源的碱性蛋白酶基因sp4及含有突变体基因sp4-m1重组载体线性化后电转化进毕赤酵母GS115菌株中在基因组中相对应的整合位点发生同源重组，通过牛奶板对阳性转化子进行筛选。挑选牛***解圈最明显的转化子进行摇瓶水平诱导，对粗酶液进行蛋白浓缩及离子柱纯化。利用SDS-PAGE电泳分析检测相应蛋白酶纯度。采用福林酚法测定野生型与突变体的基本酶学性质，并进行洗涤环境稳定性检测。结果表明，蛋白酶SP4及其突变体SP4-M1的最适温度、最适pH、pH和热稳定性并未发生明显变化，但SP4-M1的比活力较野生型提高了50％。此外洗涤环境稳定性检测结果也显示，蛋白酶SP4及其催化活性提高的突变体SP4-M1洗涤剂稳定性良好，具有洗涤用蛋白酶制剂的应用潜力。
附图说明
图1显示本发明重组表达的蛋白酶SP4及突变体SP4-M1的SDS-PAGE分析结果；
图2显示本发明重组表达的蛋白酶SP4及突变体SP4-M1的最适pH值；
图3显示本发明重组表达的蛋白酶SP4及突变体SP4-M1的pH稳定性；
图4显示本发明重组表达的蛋白酶SP4及突变体SP4-M1的最适反应温度；
图5显示本发明重组表达的蛋白酶SP4及突变体SP4-M1的热稳定性；
图6显示本发明重组表达的蛋白酶SP4及突变体SP4-M1的有机溶剂稳定性；
图7显示本发明重组表达的蛋白酶SP4及突变体SP4-M1的表面活性剂稳定性；
图8显示本发明重组表达的蛋白酶突变体SP4-M1的污布洗涤性能实验。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)和表达载体(pPICZαA)为本实验室保存；
2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶购自Thermofisher公司，同源重组和点突变试剂盒购自全式金公司，酪蛋白购自Sigma公司，真菌总RNA提取试剂盒购自OMEGA公司，其它都为国产试剂(均从普通生化试剂公司购买)；
3、培养基：
LB培养基：酵母浸提物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉20g/L，
YPD培养基：酵母浸提物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，
BMGY培养基：酵母浸提物10g/L，蛋白胨20g/L，甘油1％(V/V)，YNB 1.34g/L，生物素0.0004g/L，
BMMY培养基：酵母浸提物10g/L，蛋白胨20g/L，甲醇0.5％(V/V)，YNB 1.34g/L，生物素0.0004g/L，
牛奶双层筛选固体培养基：
上层：酵母浸提物10g/L，蛋白胨20g/L，甲醇0.5％(V/V)，YNB 1.34g/L，生物素0.0004g/L，琼脂粉20g/L，
下层：脱脂奶粉80g/L，琼脂粉20g/L。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1蛋白酶编码基因sp4及突变体sp4-m1基因克隆
(1)Fusarium pseudograminearum CS3096基因组RNA提取
真菌总RNA提取试剂盒使用的是OMEGA公司产品，具体操作如下：
取少量菌丝接种于PDB培养基中，以28℃、200rpm条件培养3-4天。收集适量菌丝体放入经过高温灭菌的研钵中，用液氮快速研磨成粉末。取50mg研磨后的菌丝体于2mL EP管中，加入500ul裂解液，上下颠倒混匀。12000rpm，4℃条件下离心5min，将上清转移到预装柱中发，12000rpm，4℃条件下离心2min。吸取500ul上清液转移到新的EP管中，加入250ul无水乙醇，上下颠倒混匀，将液体转移到RNA吸附柱上，12000rpm，4℃条件下离心1min。加入300ul washing bufferⅠ，12000rpm，4℃条件下离心1min。加入75ul加有DNA酶的消化液，室温放置15min。加入400ul RNA washing bufferⅠ，12000rpm，4℃条件下离心1min。加入500ul RNA washing bufferⅡ，12000rpm，4℃条件下离心1min，重复两次。将吸附柱室温放置并晾干。加入50ul ddH2O，静置3min，12000rpm、4℃条件下离心1min收集RNA。使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取质量。
(2)蛋白酶RNA反转录和cDNA的获取
以提取到的总RNA为模板进行反转录。使用2.5ul Oligo(dT)20(10umol/L)和27.5ul的RNA合成cDNA第一条链。使用蛋白酶基因sp4引物(见表1)扩增cDNA序列，获得的DNA片段连接到T载体上送至测序。
表1基因克隆引物表
实施例2蛋白酶表达载体pPICZαA-sp4及pPICZαA-sp4-m1构建
(1)蛋白酶野生型表达载体构建pPICZαA-sp4
以测序正确的蛋白酶sp4的cDNA为模板，设计合成了带有EcoR I和Not I限制性酶切位点的引物sp4-ZF和sp4-ZR(见表2)，对sp4的成熟蛋白的编码区进行扩增。使用EcoR I和Not I对表达载体pPICZαA进行双酶切，通过同源重组试剂盒将扩增片段连接于表达载体信号肽序列下游，形成正确的开放式阅读框，成功构建蛋白酶SP4表达载体pPICZαA-sp4，热激转化进入大肠杆菌克隆宿主XL10(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)。使用博来霉素进行阳性克隆子的筛选并送到测序公司测序。挑选测序正确的转化子进行表达质粒的制备。
表2表达载体构建引物表
(2)蛋白酶突变体表达载体构建pPICZαA-sp4-m1
以重载载体pPICZαA-sp4为模板，通过点突变引物(见表2)对载体进行扩增，使用DMT酶消化具有甲基化修饰的模板，获得含有突变的重组载体转化进克隆宿主，筛选并送到测序公司测序。挑选测序正确的转化子进行表达质粒的制备。
实施例3蛋白酶表达菌株的构建
(1)表达载体电转化表达宿主
使用限制性内切酶Dra I线性化表达载体，电击转化进表达宿主GS115感受态细胞中，使用山梨醇孵育30min后涂布于带有博来霉素抗性(100ul/100mL)的YPD平板上，30℃培养2天。
(2)高蛋白酶活性转化子的筛选
用灭过菌的牙签从长有转化子的YPD板上挑取单菌落，接种于牛奶双层筛选固体平板上，30℃培养过夜。牛奶板上出现肉眼可见的牛***解透明圈，挑选水解圈最大的转化子接种于30mLYPD培养基中。
实施例4重组蛋白酶的表达与纯化
(1)蛋白酶SP4及突变体SP4-M1的摇瓶水平表达
将筛选得到的酶活较高的转化子按1％接菌量接种于300mL的BMGY培养基中，在30℃、200rpm摇床振荡培养48h后，以4500rpm离心5min，去掉上清。用200mL BMMY培养基振荡重悬，在30℃、200rpm摇床继续振荡培养48h。培养期间，每24h向培养基中补加0.5％甲醇。培养结束后，以12000rpm离心10min收集上清发酵液，用以进行纯化。
(2)蛋白酶SP4及SP4-M1的纯化
将收集的发酵液使用5kDa膜包进行浓缩，浓缩至15mL。使用3kDa透析袋在20mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 6.0)过夜透析去除盐离子。使用20mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH6.0)A液和B液进行阴离子交换层析进行纯化。对1M NaCl线性洗脱液进行酶活检测和SDS-PAGE电泳分析(图1)。
实施例5重组蛋白酶酶学性质分析
采用福林酚法对蛋白酶SP4及突变体SP4-M1进行酶学性质测定，缓冲体系分别为乳酸-乳酸钠缓冲体系(50mM，pH 1.0-5.0)、磷酸盐缓冲体系(200mM，pH 5.0-8.0)和硼砂-氢氧化钠缓冲体系(100mM，pH 8.0-12.0)具体方法如下：
以酪蛋白为底物，500ul底物(1％W/W)和500ul适当稀释倍数的酶液，在不同温度下反应20min，加入1mL 0.4M三氯乙酸溶液终止反应。将该反应体系转入2mL EP管中，使用12000rpm离心3min后，吸取500ul上清加入2.5mL 0.4M碳酸钠溶液中，再加入500ul福林酚试剂，40℃下显色30min，冷却后吸取250ul显色体系读取其在680nm的吸光值。蛋白酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解底物酪蛋白生成lμmol酪氨酸所需的酶量为1个活性单位(U)。
(1)最适pH及pH稳定性
利用不同pH的缓冲液将酶液稀释至适当倍数，在适当温度下与对应pH的底物反应20min，测定其酶活，以探究其最适pH。结果表明(图2)，蛋白酶SP4的最适pH为8.5，突变体SP4-M1的最适pH未发生变化。蛋白酶在pH 7.0-pH 10.0范围内，相对酶活在80％以上。
将纯化后的酶液用不同pH缓冲液稀释至100ng/mL在25℃下孵育1h，对处理后的酶液进行适当稀释，在最适温度及pH下测定其pH稳定性。结果表明(图3)，蛋白酶SP4及突变体SP4-M1的pH稳定性基本一致，在25℃条件下具有很宽的pH稳定性范围，适合在中性洗衣液和碱性洗衣粉中的应用。
(2)最适温度及热稳定性
将纯化后的酶液用最适pH条件下的缓冲液稀释适当倍数，测定不同温度下酶活，以探究其最适温度。结果表明(图4)，蛋白酶SP4及突变体SP4-M1的最适温度均为40℃，在在30-45℃条件下具有70％以上的相对酶活力，符合家庭洗涤环境温度。
将纯化后的酶液稀释至100ng/mL在不同温度下孵育1h，不同时间取样，对处理后的酶液进行适当稀释，在最适温度及pH下测定其热稳定性。结果表明(图5)，其在25-35℃条件下孵育1h可以保持70％以上剩余酶活。
(3)动力学常数测定
分别配制浓度为0.5、0.8、1.0、1.3、1.5、2.0、2.5、5.0、8.0、10.0、12.0、15.0mg/mL的酪蛋白为底物，对纯化后的酶液适当稀释与不同浓度底物在最适温度和pH下反应10min，测定其酶活力。使用GraphPad Prism version 5.01软件拟合米氏方程常数，计算Km和Vmax。
比活测定结果如表3所示，蛋白酶SP的比活力为416.62±5.87U·mg-1，而突变体SP4-M1的比活为615.84±8.46U·mg-1。相较于SP4，突变体SP4-M1的Km值明显变小，Q70N点突变造成的底物亲和力的改变。Vmax值变化明显，由625.2±6.78U·mg-1提高到875.2±8.57U·mg-1。转换数由295.16±3.20s-1提高至413.18±4.05s-1，最终kcat/Km由51.40±0.63mL·s–1·mg–1提高至93.02±1.48mL·s–1·mg–1。
表3蛋白酶SP4和SP4-M1动力学参数
实施例6重组蛋白酶洗涤环境稳定性和洗涤能力检测
(1)有机溶剂、表面活性剂、洗涤剂稳定性测定
将纯化后的酶液稀释至100ng/mL，分别与终浓度10％有机溶剂、0.5％表面活性剂在25℃下孵育30min，以未处理酶液作为对照，在最适温度及pH下测定其有机溶剂和表面活性剂稳定性。结果表明(图6和图7)，除了正丁醇和H2O2对蛋白酶的酶活由较大影响外，其他有机试剂和表面活性剂对蛋白酶酶活影响不大。特别是0.5％SDS(约等于17mM SDS)孵育后，剩余酶活仍然在70％以上。
将纯化后的酶液稀释至100ng/mL，分别与终浓度1％洗衣液和7mg/mL洗衣粉在25℃下孵育30min、60min和90min，以未处理酶液作为对照，在最适温度及pH下测定其洗涤剂稳定性。结果表明，蛋白酶SP4及SP4-M1在洗衣液和洗衣粉中孵育90min后，剩余酶活在80％以上，适合作用洗涤用酶加入到洗涤剂中。
(2)蛋白酶污布洗涤性能实验
取2.5cm2的棉布，向其滴加50ul鸡血，室温干燥48h后，以50mL离心管作为处理容器，加入5mL自来水，30℃条件下以200rpm处理10min洗去松散和多余的血液，室温风干12h。取风干后的棉布，分别在各个处理组中添加自来水、洗衣液1％、洗衣粉7mg/mL、SP4-M1(250U)+洗衣液1％和SP4-M1(250U)+洗衣粉7mg/mL，各个处理组总体积均控制在5mL，在30℃和200rpm的条件下处理1h后，用清水冲洗干净残留液体，室温干燥并观察。从实验的结果(图8)中可以看出，水洗棉布被血液染成谈黄褐色，洗衣液和洗衣粉处理组有肉眼可见的圆形血渍，而添加了蛋白酶的处理组棉布的白度明显优于未添加蛋白酶的处理组。
以上实施例仅用于解释本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。
序列表
<110> 山东隆科特酶制剂有限公司
<120> 一种碱性蛋白酶SP4及其突变体、编码基因和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 389
<212> PRT
<213> 小麦冠腐病菌(Fusarium pseudograminearum)
<400> 1
Met Arg Ser Ala Thr Leu Leu Ala Leu Leu Pro Phe Ala Leu Ala Ala
1 5 10 15
Pro Ser Ala Ser Val Ser Arg Arg Thr Glu Pro Ala Pro Val Ile Arg
20 25 30
Pro Arg Gly Val Lys Leu Val Asp Gly Lys Tyr Ile Val Lys Met Lys
35 40 45
Ala Gly Val Arg Ala Ala Ser Val Asp Ser Ala Val Ser Thr Ile Gln
50 55 60
Ala Asp Ala Asp Tyr Thr Tyr Thr Lys Ser Phe Ser Gly Phe Ala Ala
65 70 75 80
Ser Leu Lys Asp Glu Glu Ile Glu Thr Leu Lys His Asp Pro Asn Val
85 90 95
Glu Tyr Ile Glu Gln Asp Ala Val Ile Thr Ile Lys Ala Thr Val Asp
100 105 110
Gln Asp Asn Ala Pro Trp Gly Ile Ala Arg Leu Ser Ser Ser Lys Pro
115 120 125
Gly Ser Lys Thr Tyr Thr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Glu Gly Thr Cys
130 135 140
Ser Tyr Val Ile Asp Thr Gly Ile Asp Val Glu His Pro Asp Phe Asp
145 150 155 160
Gly Arg Ala Lys Phe Leu Lys Asn Phe Ala Gly Gly Arg Asp Gly Asp
165 170 175
Gly Gln Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Gly Ser Thr Thr
180 185 190
Tyr Gly Val Ala Lys Lys Thr Thr Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly
195 200 205
Asp Asp Gly Ser Gly Thr Asn Ser Ala Val Ile Ala Gly Met Asp Phe
210 215 220
Val Ala Gly His Ala Asp Asp Glu Asn Cys Pro Asn Gly Ala Val Val
225 230 235 240
Asn Met Ser Leu Gly Gly Glu Ala Ser Asp Ala Val Asn Ser Ala Ala
245 250 255
Lys Ser Ile Val Asp Ala Gly Leu Phe Leu Ala Val Ala Ala Gly Asn
260 265 270
Glu Ala Val Asp Ala Ser Gly Ser Ser Pro Ala Ser Glu Ala Ser Ala
275 280 285
Cys Thr Val Gly Ala Thr Thr Arg Asn Asp Thr Leu Ser Tyr Phe Ser
290 295 300
Asn Phe Gly Asp Leu Val Asp Val Leu Ala Pro Gly Thr Asp Ile Leu
305 310 315 320
Ser Thr Trp Pro Gly Gly Lys Thr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met
325 330 335
Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Gly Ala Tyr Phe Leu Gly Leu Gly
340 345 350
Lys Lys Ala Glu Gly Leu Cys Glu Tyr Ile Ala Ser Gln Ala Leu Glu
355 360 365
Gly Val Val Ala Gln Val Pro Arg Asp Thr Val Asn Lys Leu Ile Asn
370 375 380
Asn Gly Val Ser Lys
385
<210> 2
<211> 281
<212> PRT
<213> 小麦冠腐病菌(Fusarium pseudograminearum)
<400> 2
Ala Thr Val Asp Gln Asp Asn Ala Pro Trp Gly Ile Ala Arg Leu Ser
1 5 10 15
Ser Ser Lys Pro Gly Ser Lys Thr Tyr Thr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly
20 25 30
Glu Gly Thr Cys Ser Tyr Val Ile Asp Thr Gly Ile Asp Val Glu His
35 40 45
Pro Asp Phe Asp Gly Arg Ala Lys Phe Leu Lys Asn Phe Ala Gly Gly
50 55 60
Arg Asp Gly Asp Gly Gln Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile
65 70 75 80
Gly Ser Thr Thr Tyr Gly Val Ala Lys Lys Thr Thr Leu Tyr Ala Val
85 90 95
Lys Val Leu Gly Asp Asp Gly Ser Gly Thr Asn Ser Ala Val Ile Ala
100 105 110
Gly Met Asp Phe Val Ala Gly His Ala Asp Asp Glu Asn Cys Pro Asn
115 120 125
Gly Ala Val Val Asn Met Ser Leu Gly Gly Glu Ala Ser Asp Ala Val
130 135 140
Asn Ser Ala Ala Lys Ser Ile Val Asp Ala Gly Leu Phe Leu Ala Val
145 150 155 160
Ala Ala Gly Asn Glu Ala Val Asp Ala Ser Gly Ser Ser Pro Ala Ser
165 170 175
Glu Ala Ser Ala Cys Thr Val Gly Ala Thr Thr Arg Asn Asp Thr Leu
180 185 190
Ser Tyr Phe Ser Asn Phe Gly Asp Leu Val Asp Val Leu Ala Pro Gly
195 200 205
Thr Asp Ile Leu Ser Thr Trp Pro Gly Gly Lys Thr Asn Thr Ile Ser
210 215 220
Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Gly Ala Tyr Phe
225 230 235 240
Leu Gly Leu Gly Lys Lys Ala Glu Gly Leu Cys Glu Tyr Ile Ala Ser
245 250 255
Gln Ala Leu Glu Gly Val Val Ala Gln Val Pro Arg Asp Thr Val Asn
260 265 270
Lys Leu Ile Asn Asn Gly Val Ser Lys
275 280
<210> 3
<211> 1170
<212> DNA
<213> 小麦冠腐病菌(Fusarium pseudograminearum)
<400> 3
atgcgttccg ctactcttct cgctcttttg ccctttgcgc tggccgctcc ttcagcctca 60
gtctctcgac gaactgagcc cgcgcctgtc atccgccctc gcggtgtcaa gcttgtcgat 120
ggcaagtaca tcgtcaagat gaaggccggt gtccgagctg cttctgttga cagcgctgtt 180
tcgaccatcc aggctgatgc cgattacacc tacaccaaga gcttcagtgg ctttgctgct 240
agtctcaagg atgaggagat tgagaccctc aagcacgacc ctaatgtcga gtacattgag 300
caggatgctg tcatcaccat caaggctact gtcgaccagg acaatgctcc ttggggtatc 360
gcccgtcttt ctagctccaa gcccggtagc aagacttaca cctatgacga gagcgctggc 420
gagggtactt gctcctacgt catcgacacc ggtattgatg ttgagcatcc cgactttgat 480
ggacgtgcca agttcctcaa gaactttgct ggtggtcgtg atggtgatgg tcaaggtcac 540
ggcacccacg tcgctggaac tatcggctcc accacctacg gtgtcgccaa gaagaccacc 600
ctctacgccg ttaaggtcct tggtgacgac ggctccggta ccaactctgc tgtcattgct 660
ggtatggact ttgtcgctgg tcatgccgat gacgagaatt gccctaacgg tgccgttgtc 720
aacatgtccc ttggtggcga agcctccgat gctgtcaaca gcgctgccaa gagcatcgtc 780
gatgctggtc tcttccttgc cgtagcagct ggcaacgaag ccgtcgacgc ttccggctca 840
tcccctgctt ccgaggccag cgcctgcacc gtcggcgcaa ccacccgcaa cgatactctt 900
tcctacttct ccaactttgg cgacctcgtc gatgttcttg ctcctggtac cgacatcctg 960
agcacctggc ccggcggcaa gaccaacacc atctccggaa cttccatggc ttcgccccat 1020
gttgctggtc ttggtgctta cttccttggt ctgggcaaga aggccgaggg tctctgcgag 1080
tacattgctt cccaggctct tgagggagtt gtggctcagg tgccccgcga cactgttaac 1140
aagctcatca acaacggtgt tagcaagtaa 1170
<210> 4
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Thr Val Asp Gln Asp Asn Ala Pro Trp Gly Ile Ala Arg Leu Ser
1 5 10 15
Ser Ser Lys Pro Gly Ser Lys Thr Tyr Thr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly
20 25 30
Glu Gly Thr Cys Ser Tyr Val Ile Asp Thr Gly Ile Asp Val Glu His
35 40 45
Pro Asp Phe Asp Gly Arg Ala Lys Phe Leu Lys Asn Phe Ala Gly Gly
50 55 60
Arg Asp Gly Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile
65 70 75 80
Gly Ser Thr Thr Tyr Gly Val Ala Lys Lys Thr Thr Leu Tyr Ala Val
85 90 95
Lys Val Leu Gly Asp Asp Gly Ser Gly Thr Asn Ser Ala Val Ile Ala
100 105 110
Gly Met Asp Phe Val Ala Gly His Ala Asp Asp Glu Asn Cys Pro Asn
115 120 125
Gly Ala Val Val Asn Met Ser Leu Gly Gly Glu Ala Ser Ser Ser Val
130 135 140
Asn Ser Ala Ala Lys Ser Ile Val Asp Ala Gly Leu Phe Leu Ala Val
145 150 155 160
Ala Ala Gly Asn Glu Ala Val Asp Ala Ser Gly Ser Ser Pro Ala Ser
165 170 175
Glu Ala Ser Ala Cys Thr Val Gly Ala Thr Thr Arg Asn Asp Thr Leu
180 185 190
Ser Tyr Phe Ser Asn Phe Gly Asp Leu Val Asp Val Leu Ala Pro Gly
195 200 205
Thr Asp Ile Leu Ser Thr Trp Pro Gly Gly Lys Thr Asn Thr Ile Ser
210 215 220
Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Gly Ala Tyr Phe
225 230 235 240
Leu Gly Leu Gly Lys Lys Ala Glu Gly Leu Cys Glu Tyr Ile Ala Ser
245 250 255
Gln Ala Leu Glu Gly Val Val Ala Gln Val Pro Arg Asp Thr Val Asn
260 265 270
Lys Leu Ile Asn Asn Gly Val Ser Lys
275 280
<210> 5
<211> 1125
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctccttcag cctcagtctc tcgacgaact gagcccgcgc ctgtcatccg ccctcgcggt 60
gtcaagcttg tcgatggcaa gtacatcgtc aagatgaagg ccggtgtccg agctgcttct 120
gttgacagcg ctgtttcgac catccaggct gatgccgatt acacctacac caagagcttc 180
agtggtttcg ctgctagtct caaggatgag gagattgaga ccctcaagca cgaccccaat 240
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gccaagagca ttgttgatgc tggtctcttc cttgccgtcg cagctggcaa cgaagccgtc 780
gacgcttccg gctcatcccc tgcttccgag gccagcgcct gcaccgttgg cgcaaccact 840
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ggtaccgaca tcctgagcac ctggcccggc ggcaagacca acaccatctc cggaacttcc 960
atggcttcgc cccatgtcgc tggtctgggc gcttacttcc ttggacttgg aaagaaggcc 1020
gagggtctct gcgagtacat tgcttctcag gctcttgagg gagttgtggc ccaggtgcct 1080
cgcgacactg ttaacaagct catcaacaac ggtgttagca agtaa 1125

Claims (8)

1.一种比活和催化效率提高的蛋白酶突变体SP4-M1，其特征在于，所述突变体通过对氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的碱性蛋白酶进行Q178N、D250S和 A251S定点突变而得；
所述突变体通过将氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的碱性蛋白酶去除N端前15个氨基酸后进行Q163N、 D235S和A236S定点突变而得；或者
所述突变体通过对氨基酸序列如SEQ ID NO：2的碱性蛋白酶进行Q70N、D142S和A143S定点突变而得。
2.一种碱性蛋白酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的比活和催化效率提高的蛋白酶突变体SP4-M1。
3.根据权利要求2所述的碱性蛋白酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
4.包含权利要求2所述碱性蛋白酶基因的重组表达载体。
5.包含权利要求2所述碱性蛋白酶基因的重组菌株。
6.一种制备碱性蛋白酶的方法，其特征在于，所述包括以下步骤：
（1）以权利要求4所述的重组表达载体转化宿主细胞；
（2）培养并诱导宿主细胞异源表达碱性蛋白酶；
（3）分离纯化获得碱性蛋白酶。
7.权利要求1所述的比活和催化效率提高的蛋白酶突变体SP4-M1的在制备洗涤剂中的应用。
8.一种提高蛋白酶的比活和催化效率的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：对氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的碱性蛋白酶进行Q178N、 D250S和 A251S定点突变，或者去除N端前15个氨基酸后进行Q163N、D235S和A236S定点突变；
或者，
对氨基酸序列如SEQ ID NO：2的碱性蛋白酶进行Q70N、D142S和A143S定点突变。
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