CN110982737A - 一种犬用生物被膜态乳酸菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及乳酸菌剂技术领域，特别涉及一种犬用生物被膜态乳酸菌剂及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：将乳酸杆菌接种于改良MRS培养基中活化培养，将培养液转接并平铺至细胞培养板中静置培养，获得被膜态菌液；将所述被膜态菌液制成犬用生物被膜态乳酸菌剂。本发明所述制备方法制得的被膜态乳酸菌剂可以显著提高犬类平均日增重，降低料重比，对犬肠道菌群具有明显调节作用。

Description

一种犬用生物被膜态乳酸菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及乳酸菌剂技术领域，尤其涉及一种犬用生物被膜态乳酸菌剂及其制备方法。

背景技术

犬是最早驯化的动物之一，是目前世界上最为流行的伴侣动物。其在世界范围的喂养规模都极其巨大。如此大规模的饲养是由于犬类具有很大的价值，例如其智力水平较高、具有社会性行为、拥有比人类更发达的感觉器官、在人类社会扮演多种角色、常被训练为工作犬等。因此，犬类的健康受到越来越多的关注。

犬类的健康很大程度上依赖于它们的胃肠道微生物，其肠道微生物群落组成和活性与一些疾病相关。这种微生物生态***在多种方面发挥作用，如影响营养物质的吸收代谢，宿主的营养和保护功能。胃肠道菌群的任何紊乱都可能导致多种疾病的发生，例如腹泻、过敏、肥胖和压力综合征。为了平衡菌群结构和对抗感染，不同的治疗方法都在发展，其中益生菌疗法受到很大的关注。

生物被膜是指细菌粘附于接触表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物。在自然状态下的微生物常以生物被膜态的形式生存，具有传统培养状态不可比拟的优势。目前，关于有害微生物生物被膜的研究比较多，有关益生菌尤其是乳酸菌生物被膜的研究却极为少见，适用于犬类，可有效提高犬类平均日增重，且对犬肠道菌群具有明显调节作用的生物被膜还未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种犬用生物被膜态乳酸菌剂及其制备方法。本发明提供的生物被膜态乳酸菌剂可有效提高犬类平均日增重，对犬肠道菌群具有明显调节作用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种犬用生物被膜态乳酸菌剂的制备方法，包括以下步骤：

将乳酸杆菌接种于改良MRS培养基中活化培养，将培养液转接并平铺至细胞培养板中静置培养，获得被膜态菌液；将所述被膜态菌液制成犬用生物被膜态乳酸菌剂；

所述改良MRS培养基包括液体改良MRS培养基和固体改良MRS培养基，所述液体改良MRS培养基由以下组分组成：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，柠檬酸二铵2g/L，葡萄糖20g/L，MgSO₄·7H₂O 0.58g/L，牛肉浸膏10g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，乙酸钠5g/L，吐温80 1g/L，MnSO₄·4H₂O 0.25g/L，0.1％～1％信号因子AI-2；所述固体改良MRS培养基由以上组分和琼脂16g/L组成。

一些实施方案中，所述乳酸杆菌为Lactobacillus plantarum LR-1。

一些具体实施方案中，所述液体改良MRS培养基由以下组分组成：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，柠檬酸二铵2g/L，葡萄糖20g/L，MgSO₄·7H₂O 0.58g/L，牛肉浸膏10g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，乙酸钠5g/L，吐温80 1g/L，MnSO₄·4H₂O 0.25g/L，0.5％信号因子AI-2；所述固体改良MRS培养基由以上组分和琼脂16g/L组成。

一些实施方案中，所述活化培养具体为将乳酸杆菌接种于固体改良MRS培养基中划线培养，然后取单菌落于液体改良MRS培养基中进行培养。

一些实施方案中，所述划线培养为三区划线培养。

一些实施方案中，所述转接具体为：向所述培养液中按照体积比为1:100加入所述液体改良MRS培养基。

一些实施方案中，所述静置培养的温度为30℃～37℃，所述静置培养至活菌数≥1×10⁸CFU/mL。一些具体实施例中，所述静置培养的温度为30℃，所述静置培养至活菌数为1×10⁸CFU/mL。

一些实施方案中，所述将被膜态菌液制成犬用生物被膜态乳酸菌剂具体为：取所述被膜态菌液经冷冻离心、富集、重悬、冷冻干燥后，制得犬用生物被膜态乳酸菌剂。

进一步，所述冷冻离心的温度为4～8℃，时间为5～10min，转速为4000～6000g。一些具体实施方案中，所述冷冻离心的温度为4℃，时间为5min，转速为5000g。

一些实施方案中，所述重悬用脱脂乳粉进行。一些具体实施方案中，所述脱脂乳粉与富集后的被膜态菌液的体积比为1:10。一些实施方案中，所述重悬后的活菌数≥1×10⁹CFU/mL。一些具体实施方案中，所述重悬后的活菌数为1×10⁹CFU/mL。

一些实施方案中，所述冷冻干燥的温度为-80℃，冷冻干燥的时间为36～48h。

本发明还提供了由以上制备方法制备得到的犬用生物被膜态乳酸菌剂。

一些具体实施方案中，所述犬用生物被膜态乳酸菌剂的剂型为冻干粉。

本发明提供一种犬用生物被膜态乳酸菌剂及其制备方法，所述犬用生物被膜态乳酸菌剂的制备方法包括以下步骤：将乳酸杆菌接种于固体改良MRS培养基中划线培养，取单菌落于液体改良MRS培养基中进行培养，然后将培养液转接并平铺至细胞培养板中静置培养，获得被膜态菌液；取所述被膜态菌液冷冻离心、富集、重悬、冷冻干燥，获得犬用生物被膜态乳酸菌剂。本发明采用特定工艺结合改良MRS培养基对乳酸杆菌进行培养，制得的被膜态乳酸菌剂可以显著提高犬类平均日增重，降低料重比，对犬肠道菌群具有明显调节作用

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例3中犬血液IgG含量；

图2示实施例3中犬血液sIgA；

图3示实施例3中犬血液IL-6含量；

图4示实施例3中犬血液TNF-α含量；

图5示实施例3中犬血液SOD含量；

图6示实施例3中犬血液丙二醛含量；

图7示实施例4中犬粪便微生物菌群在门水平的表现情况；

图8示实施例4中犬粪便微生物菌群在纲水平的表现情况；

图9示实施例4中犬粪便微生物菌群在属水平的表现情况。

具体实施方式

本发明公开了一种犬用生物被膜态乳酸菌剂及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1植物乳杆菌LR-1活化及生物被膜态冻干菌粉的制备

配制液体改良MRS培养基、固体改良MRS培养基、0.85％生理盐水，灭菌相应物品、烘干、无菌操作台灭菌。

液体改良MRS培养基由以下组分组成：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，柠檬酸二铵2g/L，葡萄糖20g/L，MgSO₄·7H₂O 0.58g/L，牛肉浸膏10g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，乙酸钠5g/L，吐温80 1g/L，MnSO₄·4H₂O 0.25g/L，0.5％信号因子AI-2；所述固体改良MRS培养基由以上组分和琼脂16g/L组成。

活化Lactobacillus plantarum LR-1：将Lactobacillus plantarum LR-1从甘油管中取少许于固体改良MRS培养基中，30℃静置培养至长出单菌落，挑取单菌落于液体改良MRS培养基中，30℃静置培养24h后与液体改良MRS培养基按体积比为1:100的比例转接，并平铺于细胞培养板中，30℃静置培养至活菌数达到10⁸CFU/mL，形成生物被膜。

收集10mL上述菌液，4℃，5000g离心5min，弃上清，无菌生理盐水洗涤一次，离心收集菌泥，重悬于1mL无菌脱脂乳中，置于无菌西林瓶中，灭菌纱布进行封口。将盛有菌液的西林瓶及真空冷冻干燥器托盘一起置于-80℃冰箱进行预冻2-3h，后置入真空冷冻干燥机中冷冻干燥36h，制得的菌粉为本发明生物被膜肽乳酸菌剂。

实施例2本发明生物被膜态乳酸菌剂对体重及消化率的影响

1、乳酸菌剂饲喂

将实施例1中制备的乳酸菌剂用1mL无菌生理盐水稀释，总菌数为10⁹CFU/mL，总体积为1mL，采用注射器对4月龄比格犬进行饲喂，对照组、浮游态处理组、被膜态处理组各5只犬，浮游态处理组，浮游态制备方法如下：乳酸杆菌接种于固体改良MRS培养基中划线培养，取单菌落于液体改良MRS培养基中进行培养，然后将培养液转接至试管中30～37℃震荡培养至活菌数为至少10⁸CFU/mL，获得浮游态菌液；取所述浮游态菌液冷冻离心、富集、重悬、冷冻干燥至活菌数至少为10⁹CFU/mL，此为犬用浮游态乳酸菌剂。对照组饲喂同体积无菌生理盐水。

2、体重测定

对受试犬只的体重进行检测记录，并计算平均日增重及料重比，结果如表1所示。

表1

注：同行肩标不同字母示有显著差异(P﹤0.05)。

由表1结果可知，与对照组和浮游态处理组相比，本发明被模态处理组可显著提高犬平均日增重(P﹤0.05)，料重比显著降低(P﹤0.05)。

3、消化率测定

将对照组和试验组的犬粪便进行收集，每个样本50g，分别对水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、钙、总磷和灰分7个项目进行测定，比较饲料总的原始组分，计算其中6个项目的消化率，如表2所示。

表2

注：同行肩标不同小写字母示有显著差异(P﹤0.05)，不同大写字母示有极显著差异(P﹤0.01)。

由表2可知，本发明犬用生物被膜态冻干乳酸菌可显著提高粗蛋白、粗脂肪、粗纤维和总磷消化率，与浮游态处理组相比具有显著差异(P<0.05)；在粗蛋白消化率方面与对照组组相比具有显著差异(P<0.05)；在粗脂肪、粗纤维、总磷消化率方面与对照组相比具有显著差异(P<0.05)。

实施例3本发明生物被膜态乳酸菌剂对血液指标的影响

1、乳酸菌剂饲喂

同实施例2中乳酸菌剂饲喂。

2、血液指标测定

利用ELISA试剂盒检测犬血清IgG、sIgA、IL-6、TNF-α含量，利用生化指标检测试剂盒检测SOD、丙二醛含量。

结果如图1至图6所示，表明处理组的IgG的平均含量有所增高。

实施例4犬服用生物被膜态乳酸菌剂后粪便中的微生物多样性情况

1、乳酸菌剂饲喂

同实施例2中乳酸菌剂饲喂。

2.粪便收集

于饲喂28天后，收集粪便，每个样品50g，液氮冻存。

3.基因组提取及构建文库

对收集到的样本进行基因组提取，检测合格的样品进行文库构建，对合格的文库进行cluster制备和测序，用下机得到的数据进行相应的生物信息分析。

4、数据分析

下机数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，剩余高质量的Clean data；基于OUT和物种注释结果进行样品物种复杂分析以及组间物种差异分析。多样性情况基于16SrDNA可变区序列进行测定分析。结果如图7至图9所示。由图7～9可知，本发明被膜态处理组的犬类粪便中微生物多样性出现了显著变化，其中乳杆菌的含量显著增多，表明被膜态处理组乳杆菌定植数更多，因此对犬肠道菌群具有更好的调节作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种犬用生物被膜态乳酸菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将乳酸杆菌接种于改良MRS培养基中活化培养，将培养液转接并平铺至细胞培养板中静置培养，获得被膜态菌液；将所述被膜态菌液制成犬用生物被膜态乳酸菌剂；

所述改良MRS培养基包括液体改良MRS培养基和固体改良MRS培养基，所述液体改良MRS培养基由以下组分组成：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，柠檬酸二铵2g/L，葡萄糖20g/L，MgSO₄·7H₂O 0.58g/L，牛肉浸膏10g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，乙酸钠5g/L，吐温80 1g/L，MnSO₄·4H₂O 0.25g/L，0.1％～1％信号因子AI-2；所述固体改良MRS培养基由以上组分和琼脂16g/L组成。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述乳酸杆菌为Lactobacillusplantarum LR-1。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述液体MRS培养基由以下组分组成：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，柠檬酸二铵2g/L，葡萄糖20g/L，MgSO₄·7H₂O 0.58g/L，牛肉浸膏10g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，乙酸钠5g/L，吐温80 1g/L，MnSO₄·4H₂O 0.25g/L，0.1％～1％信号因子AI-2；所述固体改良MRS培养基由以上组分和琼脂16g/L组成。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述活化培养具体为将乳酸杆菌接种于固体改良MRS培养基中划线培养，然后取单菌落于液体改良MRS培养基中进行培养。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述转接具体为向所述培养液中按照体积比为1:100加入所述液体改良MRS培养基。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述静置培养的温度为30℃～37℃，所述静置培养至活菌数≥1×10⁸CFU/mL。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将被膜态菌液制成犬用生物被膜态乳酸菌剂具体为：取所述被膜态菌液经冷冻离心、富集、重悬、冷冻干燥后，制得犬用生物被膜态乳酸菌剂。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻离心的温度为4～8℃，时间为5～10min，转速为4000～6000g；所述重悬后的活菌数≥1×10⁹CFU/mL；所述冷冻干燥的温度为-80℃，时间为36～48h。

9.权利要求1-8任一项权利要求所述的制备方法制备得到的犬用生物被膜态乳酸菌剂。

10.根据权利要求9所述的犬用生物被膜态乳酸菌剂，其特征在于，所述犬用生物被膜态乳酸菌剂的剂型为冻干粉。

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