CN116023376B - 保健品中利血平的快速检测装置及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了保健品中利血平的快速检测装置及其制备与应用,涉及利血平半抗原、抗原、抗体、胶体金层析检测装置及其制备和检测保健品中利血平的应用。本发明提供由利血平半抗原偶联载体蛋白制备的人工抗原,以及免疫实验动物后使其机体产生的特异性针对利血平的抗体,效价高,其IC50值为2.51 ng/mL。本发明提供的免疫学检测方法针对保健品中的利血平,具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、可实现现场快速检测等优点,能更好的满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域,更具体地,本发明涉及一种保健品中利血平的快速检测装置及其制备与应用。
背景技术
降压类西药降压疗效迅速,但长期使用会产生某些副作用,患者希望服用副作用小的中成药。造假者为迎合患者的这一需求,在一些降压中成药及保健品中擅自添加氢***、利血平、盐酸可乐定、硝苯地平等降压西药。患者误认为中成药属天然中药不知其中添加了西药,如再与西药降压药同服,往往使血压骤然下降或发生较大波动,还易加重肾损害诱发中风甚至造成生命危险。BJS 201710《保健食品中75种非法添加化学药物的检测》中将利血平列为重要检测物质之一。加强对中成药及保健品添加化学药品鉴别方法的分析研究,可以进一步提高药品监督管理部门对流通环节中假劣中成药及保健品的查处,使制售假药的违法行为得到有效扼制。
目前,关于利血平的检验方法主要有高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法、薄层色谱法、分光光度法、毛细管色谱法等。专利申请号为201310082621.4,专利名称为一种测定利血平含量的高效液相色谱方法的发明专利,公开了使用高效液相色谱法对利血平制剂及原料药中利血平的含量进行准确测定。但是上述采用大型仪器的检测方法具有操作繁琐、检验时间长,不满足现场快速检测需求的问题。
因此,亟需设计和开发出合适的利血平半抗原,并由此建立保健品中利血平的快速检测方法,实现通过免疫学方法来快速检测保健品及中成药中的利血平,以满足药品监督管理部门对中成药及保健品进行快速检测的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供了利血平半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和检测方法,针对于保健品中的利血平进行快速检测。
根据本发明的一个方面,提供了利血平半抗原,其结构如式(Ⅰ)所示:
根据本发明的另一个方面,提供了制备利血平半抗原的方法,包括以下步骤:
S1. 将利血平、3-溴丙炔用DMF溶解,在-20℃下加入氢化钠,反应生成含有炔烃结构的中间体1,中间体1的结构式如下式所示,
S2. 将含有炔烃结构的中间体1与叠氮乙酸在七水硫酸铜催化下,生成带有稳定的三氮唑结构以及羧基结构的目标物,即制得式(I)所示的利血平半抗原。
在一些实施方式中,步骤S1中利血平、3-溴丙炔、氢化钠的摩尔比为1:(1~2):(3~4)。
在一些实施方式中,步骤S2中中间体1与叠氮乙酸的摩尔比为1:(2~3)。
根据本发明的再一个方面,利血平抗原为利血平半抗原与载体蛋白的偶联物,载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。
根据本发明的第四个方面,利血平抗体是由利血平抗原经动物免疫制备得到,利血平抗体为利血平单克隆抗体。
根据本发明的第五个方面,提供了利血平半抗原、利血平抗原在利血平的免疫学检测中的应用。
根据本发明的第六个方面,检测装置为利血平胶体金层析检测卡,其中,检测装置包括NC膜、金标垫、样品垫、吸水垫以及PVC底板,NC膜上有检测区和质控区,检测区包被有利血平抗原,金标垫中含有胶体金标记的利血平抗体。
根据本发明的第七个方面,方法为使用利血平的胶体金层析检测装置对保健品中利血平进行检测。
本发明的有益效果:本发明提供由利血平半抗原偶联载体蛋白制备的人工抗原,以及免疫实验动物后使其机体产生特异的针对利血平的抗体,效价高,其IC50值为2.51ng/mL。本发明提供的免疫学检测方法针对保健品中的利血平,具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、可实现现场快速检测等优点,能更好的满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要。
附图说明
图1为本发明的一种实施方案的利血平半抗原的质谱图。
图2为本发明的一种实施方案的基于利血平单克隆抗体建立的间接竞争ELISA标准曲线。
图3为本发明的一种实施方案的利血平半抗原的制备方法的反应过程图。
具体实施方式
通过具体的实施案例对本发明作进一步详细的描述,应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围,在阅读了本发明之后,本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。若无特殊说明,本发明的所有原料和试剂均为常规市场可购买的原料、试剂。
实施例1 本实施例中利血平选择国药集团化学试剂有限公司供应的色谱纯利血平,3-溴丙炔选择国药集团化学试剂有限公司供应的97%溴丙炔,氢化钠选择国药集团化学试剂有限公司供应的60%氢化钠,乙酸乙酯选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯乙酸乙酯,叠氮乙酸选择郑州阿尔法化工有限公司供应的97% 叠氮乙酸,L-抗坏血酸选择国药集团化学试剂有限公司供应的99% L-抗坏血酸,以下实施例2-11均采用本实施例1中的试剂。
实施例2 利血平半抗原的合成
利血平半抗原的制备方法,包括以下步骤:
S1. 将1eq利血平以及1eq 3-溴丙炔溶于5mL DMF,-20℃下分批加入3eq氢化钠,搅拌反应1h。反应结束后,加入适量水并用乙酸乙酯萃取2-3遍,合并有机相蒸干并过柱纯化,得到黑色固体的中间体1;
S2. 将0.3g中间体1,72mg 叠氮乙酸,加入到6mL DMF以及2mL水(含47mg七水硫酸铜,66mg L-抗坏血酸)中,60℃反应4h,减压蒸干。加入乙酸乙酯、水,超声溶解。使用饱和氯化钠溶液洗涤,加入无水硫酸钠干燥,收取有机相蒸干,并过柱纯化得到褐色固体的目标物,即利血平半抗原。
采用质谱法鉴定利血平半抗原,所得到的质谱图见图1。从质谱图可以看出,利血平半抗原的分子离子峰为m/z 746.2 [M-H]-且为最高峰,其与该利血平半抗原的分子量746.3相符,表明成功合成了式(Ⅰ)所示的利血平半抗原。
实施例3 利血平免疫用抗原、包被用抗原的制备
取实施例2制备得到的利血平半抗原 0.1mmol 溶于2mL DMF中,搅拌加入0.2mmolDCC和0.15mmol NHS,4℃下磁力搅拌反应过夜,离心后,取上清夜为A液,称取140mg 血蓝蛋白(KLH)溶于10mL浓度为0.1mol/L的PBS(pH8.0)中。加入1mL DMF,搅拌溶解制备得到B液,磁力搅拌下,将A液逐滴滴入B液中,4℃下反应 12h。离心后,取上清液,4℃下用生理盐水透析3天,每天更换3次透析液,离心,制备得到利血平免疫用抗原,即利血平半抗原-KLH偶联物,将利血平免疫用抗原以1mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中,冻存于-20℃保存。
采用同样的方法,用BSA代替血蓝蛋白,制备得到包被用抗原,即利血平半抗原-BSA偶联物。
实施例4 利血平单克隆抗体的制备、纯化及间接竞争ELISA标准曲线的建立
利用实施例3中制备的利血平免疫用抗原制备单克隆抗体。使用利血平免疫用抗原经鉴定后免疫4只6周龄BALB/C小鼠,加强免疫三次后,采血测效价,待血清效价不再上升,用两倍剂量的利血平免疫用抗原不加佐剂免疫小鼠,三天后脱颈致死小鼠,在无菌条件下取脾脏制备脾细胞,与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按8:1的比例混合于50mL离心管,加入30mL无血清IPMI1640培养基,1100r/min离心5min弃上清,将细胞团轻轻振松,置于37℃水浴中。把1mL 50%PEG-4000缓缓加入细胞中,在1min内滴完,同时轻轻搅动底部沉淀,静置1min后,前30s沿管壁缓慢匀速加入无血清培养基1mL,后30s加入2mL,然后快速加入27mL终止融合过程,1100r/min离心5min,弃上清,用HAT选择性培养基重悬后加到已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中,37℃、体积分数5%的CO2条件下培养,7天后换成HT培养液,待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时,用间接ELISA法筛选,选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化,经3次以上的克隆培养和检测,均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备。
采用体内诱生腹水法生产抗利血平单克隆抗体。选4只昆明小鼠,腹腔注射液体石蜡油 0.5mL/只,7天后腹腔注射杂交瘤细胞3~5×106/只,10天后,待小鼠腹部明显膨大时收集腹水。用正辛酸-硫酸铵沉淀法初步纯化腹水后,再经protein-A进一步纯化,得到利血平单克隆抗体。
采用间接竞争ELISA法来确定利血平单克隆抗体的灵敏度。以利血平标准品浓度对横坐标,B/B0(加入利血平的微孔的OD450值/未加入利血平的微孔的OD450值)为纵坐标,建立利血平单克隆抗体的间接竞争标准曲线,见图2。从图2中可以看出,利血平单克隆抗体纯化前后的ELISA标准曲线呈S型,线性相关性较好,纯化后抗体的IC50值为2.51ng/ml,要比纯化前的灵敏度稍高,说明该抗体灵敏度较高可用于实际样品的检测。
实施例5 利血平胶体金层析检测装置的制备
5.1 胶体金溶液的制备
用双蒸去离子水将质量分数1%的氯金酸溶液稀释成0.01%(质量分数),取100ml0.01%的氯金酸溶液置于锥形瓶中,用恒温电磁搅拌器加热至沸腾,一次性迅速加入1.6 ml1%柠檬酸三钠溶液,继续匀速搅拌,加热至溶液呈透亮的红色时停止搅拌,颜色稳定后继续加热5min,冷却至室温后用去离子水恢复到原体积,得到胶体金溶液,4℃保存;
5.2 利血平单克隆抗体-胶体金标记物的制备
取100ml制备好的0.01%胶体金溶液,在磁力搅拌下,用0.1mol/L碳酸钾调胶体金溶液的pH值至8.5左右,按每毫升胶体金溶液中加入30~40 μg利血平单克隆抗体的标准,向胶体金溶液中加入实施例4制备得到的利血平单克隆抗体,搅拌均匀后于室温25℃下静置20min。加入1ml 10%牛血清白蛋白(BSA)溶液,使用磁力搅拌器搅拌(转速150e/min,30min),静置20min后,在4℃条件下,以12000rpm离心40min,弃上清液,余下沉淀使用20ml胶体金重悬液(2%蔗糖、1%BSA、0.3%吐温20,由0.01mol/L pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液配制)重悬,制备得到利血平单克隆抗体-胶体金标记物,置于4℃保存备用;
5.3利血平胶体金检测装置的制备
喷膜仪将金标抗体按照5μl/cm的量均匀喷涂在金标垫上,37℃下干燥2小时,依次将NC膜(上面喷有C线、T线)、金标垫、样品垫、吸水垫粘贴于PVC底板上,贴好后切成4mm宽的试纸条,装在特制的塑料制卡中并置于密封袋内,加干燥剂,密封,制备得到利血平胶体金层析检测卡,室温保存。
实施例6 一种保健品中利血平的快速检测方法
称取1.0g±0.01g研磨后的固体保健品至50mL聚苯乙稀离心管中,加入Tris-PBS缓冲溶液稀释10倍,盖上盖子,涡旋混合器混匀或手动上下振荡混匀30 s,静置5 min,吸取上清液为待测液。滴加3-5滴于实施例5制备的利血平胶体金层析检测卡的加样孔内,3-5min后,进行结果判读。
结果判定
通过对比控制线(C线)和检测线(T线)的颜色深浅进行结果判定。
阳性:当质控区(C)显示出条带,检测区(T)不显色,判为阳性,即该保健品中含有利血平,用“ + ”表示;
阴性:当质控区和检测区均显示出条带,判为阴性,即该保健品中没有利血平或保健品中的利血平含量低于检出限,用“-”表示;
无效:当质控区(C)不显示条带,试纸失效。
实施例7 一种保健品中利血平的快速检测方法
吸取1ml液体保健品至50mL聚苯乙稀离心管中,加入Tris-PBS缓冲溶液稀释10倍稀释20倍,吸取溶液,滴加3-5滴于实施例5制备的利血平胶体金层析检测卡的加样孔内,3-5min后,参照实施例6中“结果判定”标准,进行结果判读。
实施例8 利血平胶体金层析检测装置的灵敏度和假阴性率
设置一系列的利血平浓度梯度溶液,其中利血平浓度分别为0、25、50、100、200、400ng/mL,采用实施例7的检测方法以及实施例5制备利血平胶体金层析检测卡进行测试,肉眼比较检测线与质控线的颜色深浅。当利血平浓度为200 ng/mL时,检测线颜色深度为质控线的90%以下,因此,本发明的利血平胶体金层析检测装置的灵敏度为200ng/mL。
选取浓度为200ng/mL的利血平溶液进行平行实验5次,统计检测限颜色深度与质控线颜色深度的比例,其CV值小于15%。
实施例9 利血平胶体金层析检测装置的特异性
按照2.0μg/mL的量分别添加阿替洛尔、卡托普利、利血平、哌唑嗪、氢***、硝苯地平、盐酸可乐定、尼索地平、氨氯地平、尼群地平、尼莫地平、非洛地平、麻黄碱、芬氟拉明、酚酞、呋塞米到阴性的液体样品中,制备得到待测添加样品,采用实施例7的检测方法以及实施例5制备利血平胶体金层析检测卡,对上述待测添加样品进行检测,添加阿替洛尔、卡托普利、哌唑嗪、氢***、硝苯地平、盐酸可乐定、尼索地平、氨氯地平、尼群地平、尼莫地平、非洛地平、麻黄碱、芬氟拉明、酚酞、呋塞米的待测样品无法检出,添加利血平的待测样品检出阳性,说明本检测装置对利血平的特异性较好,对其它类型解热镇痛药物的交叉反应较少。
实施例10 利血平胶体金层析检测装置的保质期实验
用三批常规生产的利血平胶体金层析检测装置分别做保质期实验,放置于室内,室温环境保持,每隔1个月取12个装置,用质控样本按照实施例6或实施例7的方法进行检测,分别做阴性样品,利血平浓度25ng/mL,50g/mL和100ng/mL样品,重复三次,观察数据变化,考察保质期时间。阴性样品的显色从13个月开始下降,在1年时间内产品品质无明显变化,因此确定本发明的利血平胶体金层析检测装置的保质期为1年。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明创造构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
Claims (6)
3.根据权利要求2所述的制备权利要求1所述的利血平半抗原的方法,其特征在于,所述步骤S1中利血平、3-溴丙炔、氢化钠的摩尔比为1:(1~2):(3~4)。
4.根据权利要求2所述的制备权利要求1所述的利血平半抗原的方法,其特征在于,所述步骤S2中中间体1与叠氮乙酸的摩尔比为1:(2~3)。
5.利血平抗原,其特征在于,所述利血平抗原为权利要求1所述的利血平半抗原与载体蛋白的偶联物,所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。
6.权利要求1所述的利血平半抗原、权利要求5所述的利血平抗原在利血平的免疫学检测中的应用。
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