CN116482352A - MagLOCI复合微球及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种MagLOCI复合微球及其应用。本发明公开了一种基于光激化学发光的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括磁性复合微球，即MagLOCI复合微球；其中，所述磁性复合微球包括主体磁性微球和共价连接在所述主体磁性微球表面的客体纳米微球，所述客体纳米微球用于产生单线态氧或将单线态氧的能量转换为荧光。本发明能够弥补现有LOCI技术的不足，拓展LOCI的应用领域。相比于传统LOCI技术MagLOCI技术是一种更高性能、通用、灵活的光激化学发光检测平台。

Description

MagLOCI复合微球及其应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种MagLOCI复合微球及其应用。
背景技术
免疫诊断已取代生化诊断成为我国体外诊断行业中市场规模最大的细分领域。其中化学发光由于出色的灵敏度、动态范围、全自动操作流程以及高通量测试速度等优点，逐渐成为了目前免疫分析技术的主流。在欧美发达国家，化学发光免疫分析技术已经基本取代酶联免疫分析，占免疫诊断90％以上市场份额。2021年，我国化学发光占比约84％，市场规模达到284亿元。
根据免疫反应状态可将化学发光技术分为非均相化学发光免疫分析***以及均相化学发光免疫分析***。前者是目前的主流化学发光***，主要包括酶促化学发光技术、直接化学发光技术以及电化学发光技术。传统的非均相化学发光平台需要多次重复的洗涤步骤来彻底消除游离的标记分子对本底信号的影响，但多次洗涤会导致样品中的微球损失率不可控，多次洗涤不仅会增加检测时间，更会产生较大的结果误差，影响检测精密度。均相化学发光免疫分析***在检测过程中无需分离***，其代表技术为光激化学发光技术。光激化学发光技术又称发光氧通道免疫分析(Luminescent oxygen channelingimmunoassay,LOCI)技术，在1994由Ullman EF等人[Proc.Natl.Acad.Sci.U S A1994,91,5426.]发明，后由PerkinElmer公司以及西门子公司开发为商业产品。LOCI检测***由供体球(DB)和受体球(AB)组成。其中，DB球内掺杂光敏剂，受光激发后能产生单线态氧；AB球内掺杂二甲基噻吩和镧系金属配合物，二甲基噻吩将单线态氧的能量转换成360nm发射光，激发镧系金属配合物产生荧光。在受到680nm激光照射后，DB能激活周围环境中的氧转化为单线态氧，其生存时间仅为4微秒。短暂的生存时间决定了离子氧的传播直径很小(约为200nm)。当待测分子存在时，其与偶联捕获抗体的AB和偶联检测抗体的DB通过双抗夹心作用形成免疫复合物。此时AB与DB间距小于200nm，AB接受DB产生的单线态氧而被激发出615nm的光信号。而当没有待测分子存在时，AB与DB间距较远而无法激发出AB的光信号。
PerkinElmer公司推出了一项AlphaPlexTM***[公开(告)号：US8486719]，利用在AB球内掺杂不同发射波长(615nm、545nm、645nm)的镧系金属配合物用于检测不同的待测分子，实现多重检测。由于检测需要加入三种检测抗体，三种AB球，此外血清/血浆样本基质成分复杂，因此多重检测存在干扰的风险大大增加。同时在一个测试孔中优化三种指标的检测性能难度以及成本大大增加。
LOCI技术具有免洗、背景低、灵敏度高、重复性好且操作简单耗时短的优点。虽然近年来基于LOCI技的光激化学发光市场规模保持快速增长，但是其占整个化学发光市场比例很小。这可能是由于现有LOCI技术由于其无法洗涤的特点，导致其在一些特定的场合表现不佳(基质效应问题严重，间接法检测抗体指标性能较差，hook效应严重等情况)，进而限制了其更加广泛的应用。因此，光激化学发光市场的增长空间较大。
为了解决LOCI技术由于不能洗涤导致的基质影响问题，科美诊断的专利[专利号：CN109709317B]使用了亲和素修饰的磁珠来达到分离基质的效果。但是该方法是在磁珠和AB形成免疫复合物后，再加入DB在结合了免疫复合物和AB的亲和素微球剩余的位点上进行标记，其标记效率受空间位阻效应以及有限的生物素-亲和素位点的影响，效果不是很理想。
现有的LOCI技术仍然具有几个方面的缺点，将限制其临床应用范围，主要有以下几个方面：
1、检测性能受样本基质影响：1)间接法检测抗体的性能较差。通过免疫分析检测抗体的方式包含间接法、双抗原夹心法、竞争法、中和法等方法。双抗原夹心方法受空间位阻限制，所使用的抗原分子量不能过大，因此可检测的指标受限。竞争法适用于小分子或只有一个抗原表位的指标，其测试结果的可靠性受竞争抗体的特异性和亲和力大小的影响。双抗原夹心或竞争法对包被在固相载体上的抗原或竞争抗体的要求较高，且不能区分待检抗体免疫球蛋白的类别，如IgG和IgM的区分。经典间接法一般有两步反应，第一步将包被在固相载体上的已知抗原包与待检抗体结合，第二步标记抗抗体(第二抗体)与待检抗体结合。间接法可通过抗抗体区分待检抗体的免疫球蛋白类别，即可判断近期感染(IgM指标)，又可检测人群抗体(免疫力)水平(IgG指标)，对判断感染性疾病的病程有重要价值。但是在间接法两步反应之间需洗涤去除非特异性抗体，否则非特异性抗体将会与第二抗体结合造成假阴性结果，或者非特异性吸附在固相载体表面，造成假阳性结果。因此现有LOCI技术不适合使用间接法简单、定量检测抗体。2)无法检测特殊样本、检测临床样本灵敏度不高。虽然LOCI技术中无需分离洗涤步骤，但是受基质效应的影响，血清和血浆样本中常常因含有内源性的干扰蛋白质导致免疫分析结果出现假阳性、假阴性的结果，例如补体、溶菌酶、纤维蛋白、自身抗体、类风湿因子，异嗜性抗体等产生干扰的物质。此外，LOCI技术也无法准确检测含有生物素的样本。生物素即维生素B7，正常人血浆中生物素的浓度约为0.12-0.36nmol/L，当人体摄入大剂量生物素后，血液中的游离生物素及其代谢产物浓度可达正常浓度数百至数千倍。含有生物素的血清/血浆样本会导致结合供体球表面的链霉亲和素，使检测信号降低产生假阴性结果。为了解决生物素的干扰，科美诊断申请的专利[专利号：CN111122844A]中使用表面修饰亲和素的多孔微球作为抗干扰剂，通过将微球与含生物素的样本共同孵育来达到消除生物素分子的功能。但是该抗干扰剂的制备过程繁琐，同时需要额外的孵育流程来消除生物素分子，可行性不高。
2、存在Hook效应
由于游离的待测抗原或者抗体一直存在于反应***中，LOCI的Hook效应严重，导致无法直接检测高浓度待测样本，线性范围窄。对此，博阳生物的一篇专利CN108204959B中，通过对比待测样本两次读取信号的差值的增幅来判断该样本是否存在Hook效应，但其未从根本上解决Hook效应的问题。
发明内容
本发明的所要解决的技术问题是为了克服现有LOCI技术由于其无法洗涤的特点，导致其在一些特定的场合表现不佳(基质效应问题严重、无法通过间接法检测抗体指标、hook效应严重等)的缺陷，提供一种MagLOCI复合微球及其应用。本发明通过引入受体微球和磁性微球复合物，使MagLOCI平台赋予LOCI技术洗涤的功能，能够弥补现有LOCI技术的不足，拓展LOCI的应用领域。相比于传统LOCI技术MagLOCI技术是一种更高性能、通用、灵活的光激化学发光检测平台。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明的第一方面提供一种基于光激化学发光的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括磁性复合微球；其中，所述磁性复合微球包括主体磁性微球和共价连接在所述主体磁性微球表面的客体纳米微球，所述客体纳米微球用于产生单线态氧或将单线态氧的能量转换为荧光。
在本发明一些实施方案中，所述主体磁性微球或客体纳米微球的表面具有含氨基、羧基或醛基的单体或其聚合物的修饰。
在本发明一些较佳实施方案中，所述主体磁性微球或客体纳米微球的表面具有含氨基或其聚合物的修饰，相应地所述客体纳米微球或主体磁性微球的表面具有含羧基或醛基的单体或其聚合物的修饰。
在本发明一些具体实施方案中，所述主体磁性微球的表面具有含氨基或其聚合物的修饰，所述客体纳米微球的表面具有含羧基或醛基的单体或其聚合物的修饰。
在本发明一些实施方案中，所述含氨基、羧基或醛基的单体或其聚合物的密度至少为100μmol/mg客体纳米微球或主体磁性微球。
本发明中，所述含氨基、羧基或醛基的单体或其聚合物可为本领域常规，所述含氨基的单体聚合物例如为聚乙烯亚胺。
在本发明一些实施方案中，所述磁性复合微球的磁含量为4～75wt.％，例如为4wt.％、8wt.％、12wt.％、16wt.％、20wt.％、24wt.％、28wt.％、32wt.％、36wt.％、40wt.％、44wt.％、48wt.％、52wt.％、56wt.％、60wt.％、64wt.％、68wt.％、72wt.％、75wt.％或任意两个上述磁含量之间的范围。
在本发明一些实施方案中，所述磁性复合微球的磁含量为5～50wt.％，例如为5wt.％、10wt.％、15wt.％、22wt.％、25wt.％、30wt.％、35wt.％、40wt.％、45wt.％、50wt.％或任意两个上述磁含量之间的范围。
在本发明一些实施方案中，所述磁性复合微球的磁含量为30～35wt.％，例如为31wt.％、32wt.％、33wt.％、34wt.％或35wt.％。
在本发明一些实施方案中，所述检测试剂盒中，所述客体纳米微球的表面还偶联生物捕获分子，所述生物捕获分子用于结合待测分子。
本发明中，所述生物捕获分子可为本领域常规，例如为抗体分子或抗原分子。
在本发明一些实施方案中，所述检测试剂盒还包括匹配微球，当所述客体纳米微球产生单线态氧时，所述匹配微球用于将单线态氧的能量转换为荧光；当所述客体纳米微球用于将单线态氧的能量转换为荧光时，所述匹配微球用于产生单线态氧。
在本发明一些实施方案中，所述检测试剂盒还包括生物检测分子，所述生物检测分子用于结合待测分子，并且所述生物检测分子和所述生物捕获分子结合所述待测分子的不同位点；其中，所述生物检测分子与所述匹配微球特异性结合。
本发明中，所述特异性结合是指例如酶-底物、抗原-抗体、配基-受体等配对分子的结合特点，为本领域技术人员根据需要可基于公知常识进行选择其表现形式。一个能够特异性结合的配基-受体的示例是生物素-亲和素***，例如生物素-链霉亲和素。
在本发明一些具体实施方案中，所述生物检测分子与所述匹配微球通过生物素-亲和素***特异性结合。
在本发明一些实施方案中，所述生物检测分子或待测分子为生物素修饰的生物检测分子或待测分子，所述匹配微球为链霉亲和素修饰的匹配微球。
在本发明另一些实施方案中，所述生物检测分子或待测分子为链霉亲和素修饰的生物检测分子或待测分子，所述匹配微球为生物素修饰的匹配微球。
在本发明一些实施方案中，产生单线态氧的所述匹配微球或客体纳米微球包含光敏剂，所述光敏剂在接收到激发光后产生单线态氧；转换所述单线态氧的能量的客体纳米微球或匹配微球包含二甲基噻吩和镧系金属配合物，所述二甲基噻吩将单线态氧的能量转换为发射光，并通过镧系金属配合物产生荧光。
在本发明一些实施方案中，所述镧系金属配合物选自铕、铽和钐中的一种或多种。
本发明中，当所述镧系金属配合物为铕、铽和钐中的一种时，所述检测试剂盒可进行单一样品检测；当所述镧系金属配合物为选自铕、铽和钐中的两种或三种时，所述检测试剂盒可进行多重检测。
本发明的第二方面提供一种检测生物分子的方法，所述方法包括：
(1)在生物检测分子存在或不存在时，将磁性复合微球和包含待测分子的样本混合孵育，并去除基质反应液；
(2)将(1)中获得的微球加入含有匹配微球的溶液中，混合孵育，检测并收集发光信号；
其中，(1)中，当生物检测分子不存在时，(2)前还包括将(1)中获得的微球加入含有生物检测分子的溶液中，混合孵育，并去除基质反应液；
其中，所述磁性复合微球和所述生物检测分子和所述匹配微球如第一方面所述。
在本发明一些实施方案中，所述方法包括：
(1)将磁性复合微球、生物检测分子和包含待测分子的样本混合孵育，并去除基质反应液；
(2)将(1)中获得的微球加入含有匹配微球的溶液中，混合孵育，检测并收集发光信号。
在上述实施方案中，(1)中，所述去除基质反应液后可进行或不进行洗涤；
(2)中，所述混合孵育后可进行或不进行洗涤。
在本发明另一些实施方案中，所述方法包括：
(1)将磁性复合微球和包含待测分子的样本混合孵育，去除基质反应液；
(2)将(1)中获得的微球加入含有生物检测分子的溶液中，混合孵育，并去除游离的生物检测分子；
(3)将(2)中获得的微球加入匹配微球的溶液中，混合孵育，检测并收集发光信号。
在上述实施方案中，(1)中，所述去除基质反应液后可进行或不进行洗涤；
(2)中，所述混合孵育后可进行或不进行洗涤；
(3)中，所述混合孵育后可进行或不进行洗涤。
本发明中，所述去除基质反应液优选地通过磁吸附进行。
本发明中，术语“基质”是指反应体系中除缓冲液外的会干扰免疫反应的非靶分子和未结合的靶分子。例如，在PBS作为缓冲液的反应体系中，基质是指未结合的待测样本或抗体；在加入了人血清或血浆的反应体系中，基质还包括人血清/血浆中可能会干扰检测的组分，例如影响间接法的非特异的人的IgG抗体，影响生物素-亲和素反应***的生物素分子以及血清/血浆样本中例如补体、溶菌酶、纤维蛋白、自身抗体、类风湿因子、异嗜性抗体等物质。
本发明中，所述待测分子包括但不限于核酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、多肽、蛋白质、多糖、糖蛋白、脂肪酸及其衍生物和小分子化合物。
本发明中，所述样本可为本领域常规，例如血清或血浆，体液例如尿液、***、唾液、泪液等。
本发明中，所述混合孵育可在缓冲液中进行；所述缓冲液可为本领域常规，例如为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液。
在本发明一些具体实施方案中，所述缓冲液为含1％(v/v)BSA和0.05％(v/v)Tween-20的PBS缓冲液。
本发明中，所述磁性复合微球的投料量可为50-250μg/mL，例如为50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL或任意两个上述投料量之间的范围。
本发明一些实施方案中，所述洗涤使用的试剂为PBST缓冲液；所述洗涤的次数为1～3次。
本发明一些实施方案中，所述孵育的条件为37℃振荡15～30min。
本发明一些实施方案中，所述发光信号通过光电检测器或成像***采集。
本发明中，所述光电检测器可为本领域常规，例如为PMT、PD或APD，激发波长680nm，测定波长615nm。
本发明的第三方面提供一种制备磁性复合微球的方法，所述方法包括将主体磁性微球和客体纳米微球在液相条件下混合，避光反应使所述主体磁性微球和客体纳米微球共价连接即得；所述客体纳米微球用于产生单线态氧或将单线态氧的能量转换为荧光；所述主体磁性微球和客体纳米微球的投料比为(1～10):1。
本发明一些实施方案中，所述主体磁性微球和客体纳米微球的投料比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
本发明一些实施方案中，所述主体磁性微球和客体纳米微球的投料比为(2～5):1，例如为2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
本发明一些实施方案中，所述主体磁性微球或客体纳米微球的表面具有含氨基、羧基或醛基的单体或其聚合物的修饰。
本发明一些较佳实施方案中，所述主体磁性微球或客体纳米微球的表面具有含氨基或其聚合物的修饰，相应地所述客体纳米微球或主体磁性微球的表面具有含羧基或醛基的单体或其聚合物的修饰；所述含氨基的单体聚合物例如为聚乙烯亚胺。
本发明一些实施方案中，所述液相条件为MEST溶液。
本发明一些具体实施方案中，所述混合为主体磁性微球MEST溶液滴入所述客体纳米微球MEST溶液中。
本发明的第四方面提供一种如第一方面所述的检测试剂盒在检测生物分子中的应用。
本发明一些实施方案中，所述生物分子为蛋白分子。
由于MagLOCI本身含有LOCI技术的特点，MagLOCI的“洗涤”仅需去除大部分产生干扰的物质，因此相较传统非均相化学发光技术，MagLOCI只需简单的一次洗涤或者分离反应液就可以大幅提升原有LOCI技术的性能。
同时本发明的MagLOCI技术作为一种新型的化学发光平台，其通用性强，灵活多变，通过调整其反应步骤，洗涤次数以及洗涤时间来匹配不同的应用场景。采用两步法不洗涤的反应模式，可以完成对检测灵敏度需求不高，但是需要快速出结果的检测项目；采用两步法洗涤的反应模式，可以完成对检测灵敏度要求更高的临床样本的检测以及一些受基质中特定成分(例如生物素、异嗜性抗体)干扰严重的项目，同时可根据干扰物浓度相应调整洗涤次数；采用三步法洗涤的反应模式，可以完成消除hook效应以及通过间接法检测抗体的功能。
通过MagLOCI三步法洗涤的方式可以大大降低多重检测中干扰的风险，能够简单快速地开发检测性能和单重检测一致的多重检测试剂。
本发明将LOCI受体球组装在磁性微球表面，得到主客体结构的MagLOCI复合微球。通过引入磁球使原有无法洗涤的LOCI技术可以实现磁分离洗涤干扰物质的功能，检测性能优于传统LOCI技术。
通过对MagLOCI复合微球的尺寸、数量、磁含量参数的调节，得到优化的检测性能。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的MagLOCI复合微球将LOCI受体球均匀组装在磁性微球表面得到主客体结构，实现磁分离洗涤干扰物质的功能，提升检测性能。本发明的检测试剂盒通用性强，可根据需要调节用量和洗涤次数，适应多平台的检测需要。
附图说明
图1为MagLOCI的检测流程和适应场景示意图。
图2A为不同磁含量微球对检测信号的影响(信号值)示意图。
图2B为不同磁含量微球对检测信号的影响(P/N值)示意图。
图3A为不同微球加入量对检测信号的影响(信号值)示意图。
图3B为不同微球加入量对检测信号的影响(P/N值)示意图。
图4A为MagLOCI与Multi-LOCI检测性能对比(信号值)示意图。
图4B为MagLOCI与Multi-LOCI检测性能对比(P/N值)示意图。
图5A为采用MagLOCI洗涤、不洗涤以及LOCI方法通过间接法检测新型冠状病毒IgG标准曲线示意图。
图5B为采用MagLOCI洗涤、不洗涤以及LOCI方法通过间接法检测新型冠状病毒IgG的阳性信号/阴性信号(P/N)比值示意图。
图6A为采用MagLOCI洗涤、不洗涤以及LOCI方法检测PCT临床样本的结果(信号值)示意图。
图6B为采用MagLOCI洗涤、不洗涤以及LOCI方法检测PCT临床样本的结果(P/N值)示意图。
图7为采用MagLOCI洗涤消除hook效应的结果示意图。
图8为MagLOCI技术联合检测PCT/IL-6/IFN-γ的结果示意图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1主客体结构MagLOCI微球的制备方法
所用主体微球为具有超顺磁性的磁球，其尺寸在0.6～10μm，为表面具有10k～750k PEI修饰的氨基微球，磁含量在20～75wt.％。客体纳米球为内部掺杂二甲基噻吩和镧系金属配合物的纳米球，采购自PerkinElmer公司，其粒径为200nm，表面基团为羧基或醛基。主体磁性微球表面的氨基与AB球表面的羧基或醛基进行共价偶联，得到主客体结构的MagLOCI复合微球。所述AB球能够与单线态氧反应生成可检测信号。
实施例1-1(磁球与表面羧基AB球的组装)：
步骤1：采用直径为5.5μm的磁性微球作为核心基质，将1.3mg磁性微球磁分离去上清液，用400μL MEST(100mM MES，0.05％Tween 20，pH 5.0)洗涤三次，最后分散于150μLMEST溶液中得到磁性微球分散液。取0.6mg 200nm AB球，离心去上清液后超声分散于150μLMEST溶液中，得到客体AB球分散液。
步骤2：将步骤1中的磁性微球分散液在超声的条件下逐滴加入到客体AB球分散液中，超声混合均匀后，置于混合仪上混合30min。配制50mg/mL碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，然后将EDC/NHS溶液加入到磁性微球和AB球的混合溶液中，涡旋混合均匀，避光旋转反应3h。反应结束后，用2.5mM的氢氧化钠(NaOH)清洗三次，再用超纯水清洗三次，最后分散于150μL的超纯水溶液中，即得到主客体MagLOCI微球。
当采用不同直径、不同磁含量的磁性微球时，磁性微球与客体AB球的组装方法与上述方法基本相同，仅需根据微球的表面积变化对客体AB球用量和相关反应物用量稍作调节。
实施例1-2(磁球与表面醛基AB球的组装)：
步骤1：采用直径为1.7μm的磁性微球作为核心基质，将0.56mg磁性微球磁分离去上清液，用400μL MEST洗涤三次，最后分散于150μL MEST溶液中得到磁性微球分散液。取0.6mg的200nm AB球，离心去上清液后超声分散于150μL MEST溶液中，得到客体AB球分散液，并加入15μL的NaCNBH3(25mg/mL)。
步骤2：将步骤1中的磁性微球溶液在超声条件下逐滴加入到步骤1中的客体AB球溶液中。滴加完毕后，涡旋振荡，并置于37℃恒温箱中在旋转混合仪上避光旋转48h。反应后磁分离去上清液，用2.5mM的NaOH清洗三次，用超纯水清洗三次，分散于150μL的超纯水溶液中，即得到主客体MagLOCI微球。
当采用不同直径，不同磁含量的磁性微球时，磁性微球与客体AB球的组装方法与上述方法基本相同，仅需根据微球的表面积变化对客体AB球用量和相关反应物用量稍作调节。
实施例2MagLOCI复合微球表面的生物偶联
实施例2-1(表面羧基AB球偶联捕获抗体分子)：
步骤1：取1mg直径为5.9μm的主客体结构磁性微球于2mL离心管中，磁分离去上清，用400μL的10mM MEST溶液洗涤三遍。加入250μL配制浓度为50mg/mL的EDC和NHS溶液，将磁球分散均匀后在旋转混合仪上室温反应20min。
步骤2：加400μL 0.25mg/mL的捕获抗体(Anti-PCT McAb，采购自上海领潮生物科技有限公司，货号：L3C00901)溶液，混合均匀后置于37℃恒温箱中在旋转反应2h。
步骤3：反应结束后微球加封闭液(含0.3％甘氨酸和0.5％BSA的PBS缓冲液)洗3次，再加400μL的封闭液在4℃冰箱中封闭过夜；
步骤4：磁珠封闭完后，用储存液(含0.1％BSA的PBST缓冲液)洗涤三遍，之后加入25μL储存液储存微球，得到偶联抗体分子的磁球。
实施例2-2(表面羧基AB球偶联抗原分子)：
步骤1：取1.25mg直径为5.9μm的主客体结构磁性微球于2mL离心管中，磁分离去上清，用400μL 10mM MEST溶液洗涤三遍。加入100μL浓度为2mg/mL的EDC和4mg/mL NHS溶液，将磁球分散均匀后在旋转混合仪上室温反应20min。
步骤2：加12μg的新型冠状病毒抗原N蛋白(SARS-CoV-2NP-His，采购自隆基生物有限公司，货号：AI04504)，混合均匀后置于37℃恒温箱中旋转反应2h。
步骤3：反应结束后微球加封闭液洗3次，再加400μL的封闭液在4℃冰箱中封闭过夜；
步骤4：磁珠封闭完后，用储存液洗涤三遍，之后加入25μL储存液储存微球，得到偶联抗原分子的磁球。
MagLOCI的检测流程和适应场景如图1所示。
实施例3MagLOCI复合微球的物理特性对检测性能的影响
实施例3-1(双抗体夹心方法的MagLOCI检测流程)
本实施例所述的MagLOCI技术采用双抗体夹心法，通过两步法洗涤的模式检测抗原样本，需要使用以下试剂：
(a)偶联抗体分子的MagLOCI复合微球；微球制备方法同实施例2-1，区别在于各实施例采用了不同粒径和或磁含量的氨基主体微球。
(b)生物素修饰的检测抗体(Ab2)溶液，其可通过免疫反应与MagLOCI复合微球表面的捕获抗体形成双抗体夹心免疫复合物。
(c)链霉亲和素标记的供体微球(DB-SA)溶液，所述DB-SA溶液能够在激发状态产生单线态氧。
具体的，采用MagLOCI技术检测降钙素原(PCT)抗原样本的流程如下：
反应在含1％BSA和0.05％Tween-20的PBS缓冲液中进行；
步骤1：取96孔板分别加入10μL偶联PCT捕获抗体分子(Anti-PCT McAb，采购自上海领潮生物科技有限公司，货号：L3C00901)的MagLOCI复合微球溶液；10μL Ab2(Anti-PCTMcAb，采购自上海领潮生物科技有限公司，货号：L3C00904)溶液；16μL梯度稀释的PCT重组抗原待测样本(采购自上海领潮生物科技有限公司，货号：L4C00901)，混合均匀后，在37℃下振荡孵育30min。
步骤2：使用磁吸附板充分吸附MagLOCI复合微球，去除含有基质的反应液体，加入200μL PBST缓冲液对微球进行洗涤，洗涤的溶液通过磁吸附板吸附MagLOCI复合微球来去除。微球的洗涤次数根据基质中干扰物质的含量来决定。干扰物质的含量越多，需要洗涤的次数越多。
步骤3：清洗后的微球加入180μL 20μg/mL DB-SA溶液，在37℃下振荡孵育15min。
步骤4：将溶液直接置于仪器上读取溶液的化学发光信号值(激发波长680nm，测定波长615nm)。
实施例3-2(微球磁含量对检测结果的影响)
MagLOCI复合微球磁含量越高，微球磁响应速度越快，洗涤造成的误差越小，但是磁含量越高微球对LOCI荧光信号吸收作用越强。本实施例对比了不同磁含量微球对检测结果的影响，操作流程同实施例3-1，分别加入磁含量为20wt.％、32wt.％、55wt.％、75wt.％的MagLOCI微球检测梯度稀释的PCT重组抗原，步骤2和步骤3之间洗涤一次。测试的结果如图2A和图2B所示。
由图可知，磁含量越高的微球，在检测高浓度的样本对检测信号的吸收作用越强，信号降低越明显，对低浓度的样本检测信号影响不明显。综合考虑检测性能以及微球洗涤损失率，微球磁含量优选10～30wt.％。
实施例3-3(微球投料量对检测结果的影响)
加入的MagLOCI复合微球的投料量影响反应溶液中AB球的数量，AB球越多产生越多的荧光信号。本实施例对比了不同磁球数量对检测结果的影响，操作流程同实施例3-1，分别加入10、50、250、1250μg/mL 5.9μm的MagLOCI微球检测梯度稀释的PCT重组抗原，步骤2和步骤3之间洗涤一次。测试的结果如图3A和图3B所示。
图中，可以看到随着MagLOCI复合微球数量的增加，AB球的数量增加，所以检测信号值也增加。但是加入的磁球数量越多，背景信号越高，在抗原浓度较低时，加入磁球数量越多P/N值越低。综合考虑高浓度和低浓度的检测信号，磁球投料量优选50-250μg/mL。
对比例1
本发明通过读取微球溶液整体荧光信号的方式，其检测性能优于CN113376146A中提出的multi-LOCI技术，其采用荧光显微镜采集单个微球上的光信号。
使用相同的反应条件(同实施例3-1)两种方法(区别在于不同的检测方法)的检测结果如图4A和图4B所示。本发明MagLOCI技术的检测限为3.3pg/mL，远低于Multi-LOCI技术的101.3pg/mL的检测限，说明灵敏度得到了显著的提升。此外，本发明MagLOCI技术的动态范围为4个数量级，明显高于Multi-LOCI技术的2个数量级。
实施例4磁分离抗基质干扰功能
本发明提出的MagLOCI技术，通过磁性微球的引入，将光激化学发光技术(LOCI)中的受体微球以主客体结构的模式固定在磁性微球表面，赋予LOCI技术以洗涤的功能，进而满足某些因基质干扰需要进行洗涤的临床检测场景，例如间接法检测抗体，检测含有生物素的样本以及高敏度要求的临床样本检测。具体示例如下。
实施例4-1(间接法检测新冠IgG抗体)
均相的光激化学发光技术由于免洗的特点，无法去除血清和血浆样本中大量存在的非特异性抗体以及游离的抗体，从而导致其通过间接法检测抗体的性能较差，也不能区分待检抗体免疫球蛋白的类型。本发明通过磁分离的功能，去除了样本中的干扰抗体，从而实现了间接法检测抗体的功能。本发明以检测新冠IgG抗体为例，展示了采用间接法、三步法洗涤的模式检测抗体的功能，具体地，操作流程如下：
反应在含1％BSA和0.05％Tween-20的PBS缓冲液中进行；
步骤1：使用PBS缓冲液将健康人阴性血清稀释50倍作为检测的阴性样本，使用稀释的阴性血清梯度稀释新冠IgG抗体强阳质控品作为检测的阳性样本。
步骤2：取96孔板加入2.5μg 5.9μm偶联抗原分子的MagLOCI复合微球溶液(微球制备方法同实施例2-1)，再加入100μL梯度稀释的新冠IgG抗体强阳质控品，在37℃下振荡孵育30min。
步骤3：使用磁吸附板充分吸附MagLOCI复合微球，去除含有干扰抗体的反应液体，加入200μL PBST缓冲液对微球进行一次洗涤，再通过磁吸附板吸附MagLOCI复合微球去除洗涤溶液。
步骤4：清洗后的微球加入190μL 4μg/mL生物素标记的第二抗体(Mouse anti-human IgG，采购自隆基生物有限公司，货号：MS00601)，在37℃下振荡孵育30min。
步骤5：使用磁吸附板充分吸附MagLOCI复合微球，去除游离的第二抗体，加入200μL PBST缓冲液对微球进行一次洗涤，再通过磁吸附板吸附MagLOCI复合微球去除洗涤溶液。
步骤6：清洗后的微球加入200μL 20μg/mL DB-SA溶液，在37℃下振荡孵育15min。
步骤7：将溶液直接置于仪器上读取溶液的化学发光信号值(激发波长680nm，测定波长615nm)。
测试梯度稀释的含测试新冠IgG抗体的质控品的阳性信号值(Positive)，以及阴性血清的阴性信号值(Negative)。根据不同稀释倍数的阳性样本信号值与阴性样本信号值的比值P/N可以判断不同IgG抗体浓度下检测信号的区分度，测试结果见图5A和图5B。
由图5A和图5B可知，本发明采用中MagLOCI间接法采用洗涤的方式检测新型冠状病毒IgG抗体呈现较好的线性范围，可以准确检测出血清中的待检新型冠状病毒IgG抗体，而采用MagLOCI不洗涤的方式以及采用光激化学发光方法使用间接法测定抗体的性能较差。
实施例4-2(检测含有生物素的样本)
含有生物素的血清/血浆样本会干扰生物素-亲和素的结合，进而产生假阴性结果。MagLOCI通过磁分离去除样本中游离的生物素，从而消除生物素对供体球结合Ab2的影响。本申请展示了通过双抗体夹心方法检测含有生物素的降钙素原(PCT)样本的结果，操作流程同实施例3-1，使用PBS缓冲液梯度配制0.1-10μg/mL的生物素(Biotin，采购自sigma，货号：V900418-1G)溶液，使用生物素溶液稀释1ng/mL的PCT重组抗原以及梯度稀释的生物素稀释液作为待测样本。为保证生物素被充分洗涤，步骤二中微球的洗涤次数设置为三次。MagLOCI技术测试结果见表1，作为对照同时对比了LOCI技术，测试结果见表2。可以看到免洗的LOCI技术在生物素溶液浓度分别为0.1、1、10μg/mL时，其检测信号被大大抑制，信背比较不加生物素的样本下降了79.5％。而MagLOCI技术通过洗涤，在生物素溶液浓度分别为0.1、1、10μg/mL时，检测信号下降幅度显著降低，信背比较不加生物素的样本分别下降了18.7％、27.1％以及30.7％。
表1
生物素浓度μg/mL 10 1 0.1 0
1ng/mL PCT样本信号值 2221 1979 2605 3099
0ng/mL PCT样本信号值 193 163 193 187
信背比 11.5 12.1 13.5 16.6
表2
生物素浓度μg/mL 10 1 0.1 0
1ng/mL PCT样本信号值 4554 4477 6190 12063
0ng/mL PCT样本信号值 5480 4780 7663 3058
信背比 0.8 0.9 0.8 3.9
实施例4-3(检测临床样本)
血清和血浆样本中常常因含有内源性的干扰蛋白质常常会导致免疫分析结果出现假阳性、假阴性的结果，例如补体、溶菌酶、纤维蛋白、自身抗体、类风湿因子、异嗜性抗体等产生干扰的物质。通过磁分离去除临床样本基质，可以消除基质中的干扰物质，能够提高样本检测灵敏度以及准确度。本发明展示了通过双抗夹心方法检测PCT临床样本的结果，操作流程同实施例3-1，步骤二中微球的洗涤次数设置为一次。根据不同稀释倍数的阳性样本信号值与阴性样本信号值的比值P/N可以判断不同PCT临床样本浓度下检测信号的区分度，测试结果见图6A和图6B。
由图6A和6B可知，本发明采用双抗夹心检测PCT临床样本呈现较好线性，可以准确定量血清中的待检PCT抗原分子，而采用不洗涤的方式的光激化学发光方法其由于受到基质的干扰检测灵敏度较差。
实施例5磁分离消除hook效应
实施例5-1(磁分离消除hook效应)
在免疫检测的过程中，当待测分子的浓度过高时，会导致免疫复合物形成的数量降低，从而导致测试信号值偏低，产生假阴性的检测结果，即hook效应。本发明以双抗体夹心法检测PCT重组抗原为例，通过可磁分离的功能，采用三步法的反应流程，在抗原分子与检测抗体反应后洗涤游离的抗原分子，从而到达消除hook效应的效果。具体地，操作流程如下：
反应在含1％BSA和0.05％Tween-20的PBS缓冲液中进行；
步骤1：使用PBS缓冲液梯度稀释PCT重组抗原。
步骤2：取96孔板加入2.5μg 5.9μm偶联PCT捕获抗体的MagLOCI复合微球溶液(微球制备方法同实施例2-1)，再加入16μL梯度稀释的PCT重组抗原，在37℃下振荡孵育30min。
步骤3：使用磁吸附板充分吸附MagLOCI复合微球，去除含有干扰抗体的反应液体，加入200μL PBST缓冲液对微球进行一次洗涤，再通过磁吸附板吸附MagLOCI复合微球去除洗涤溶液。
步骤4：清洗后的微球加入200μL 0.2μg/mL生物素标记的检测抗体，在37℃下振荡孵育30min。
步骤5：使用磁吸附板充分吸附MagLOCI复合微球，去除游离的第二抗体，加入200μL PBST缓冲液对微球进行一次洗涤，再通过磁吸附板吸附MagLOCI复合微球去除洗涤溶液。
步骤6：清洗后的微球加入200μL 20μg/mL DB-SA溶液，在37℃下振荡孵育15min。
步骤7：将溶液直接置于仪器上读取溶液的化学发光信号值(激发波长680nm，测定波长615nm)。测试结果见图7。
由图7可知，不洗涤的微球在高抗原浓度下(>100ng/mL)出现了较严重的hook效应现象。而MagLOCI技术采用三步反应，其中前两步洗涤微球后可以达到消除hook效应的效果。
实施例6多重检测的标准曲线(检测PCT/IL-6/IFN-γ的三重标曲)
通过MagLOCI三步法洗涤的方式可以大大降低多重检测中干扰的风险，能够简单快速地开发检测性能和单重检测一致的多重检测试剂。具体地，操作流程如下：
反应在含1％BSA和0.05％Tween-20的PBS缓冲液中进行；
步骤1.制备偶联PCT、IL-6、IFN-γ捕获抗体(IL-6捕获抗体，采购自R&D，货号：MAB206-500；IFN-γ捕获抗体，采购自Biolegend，货号：507502)的MagLOCI复合微球溶液，微球制备方法同实施例2-1，其中PCT/IL-6/IFN-γ指标分别使用铕(615nm发射)、铽(545nm发射)、钐(645nm发射)金属配合物掺杂的AB球作为客体纳米球。
步骤2.制备生物素修饰的检测抗体(Ab2)溶液：将生物素修饰的PCT、IL-6、IFN-γ检测抗体(IL-6检测抗体，采购自R&D，货号：BAF206；IFN-γ检测抗体，采购自Biolegend，货号：502503)分别稀释至0.6ug/mL的浓度并混合；
步骤3.使用PBS缓冲液将梯度稀释PCT、IL-6、IFN-γ抗原标准品(IL-6重组抗原，采购自R&D，货号：206-IL-010；IFN-γ重组抗原，采购自Biolegend，货号：570209)至300、30、3、0.3、0.03、0ng/mL，并将相同浓度的每种标准品混合。
步骤4.取96孔板加入2.5μg 5.9μm，再加入16μL梯度稀释的PCT、IL-6、IFN-γ重组抗原，在37℃下振荡孵育30min。
步骤5.使用磁吸附板充分吸附MagLOCI复合微球，去除含有干扰抗体的反应液体，加入200μL PBST缓冲液对微球进行一次洗涤，再通过磁吸附板吸附MagLOCI复合微球去除洗涤溶液。
步骤6.清洗后的微球加入200μL生物素标记的检测抗体的混合溶液，在37℃下振荡孵育30min。
步骤7.使用磁吸附板充分吸附MagLOCI复合微球，去除游离的第二抗体，加入200μL PBST缓冲液对微球进行一次洗涤，再通过磁吸附板吸附MagLOCI复合微球去除洗涤溶液。
步骤8.清洗后的微球加入200μL 20μg/mL DB-SA溶液，在37℃下振荡孵育15min。
步骤9.将溶液直接置于仪器上，采用实施例7所述的多重检测方式读取溶液中三种AB球来源的信号值。测试结果见图8。
从图8结果可知，MagLOCI技术采用三步法洗涤微球后，同时检测PCT/IL-6/IFN-γ指标可行。

Claims (10)

1.一种基于光激化学发光的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括磁性复合微球；其中，所述磁性复合微球包括主体磁性微球和共价连接在所述主体磁性微球表面的客体纳米微球，所述客体纳米微球用于产生单线态氧或将单线态氧的能量转换为荧光。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述主体磁性微球或客体纳米微球的表面具有含氨基、羧基或醛基的单体或其聚合物的修饰；和/或，所述磁性复合微球的磁含量为4～75wt.％；
较佳地，所述主体磁性微球或客体纳米微球的表面具有含氨基或其聚合物的修饰，相应地所述客体纳米微球或主体磁性微球的表面具有含羧基或醛基的单体或其聚合物的修饰；和/或，所述含氨基、羧基或醛基的单体或其聚合物的密度至少为100μmol/mg客体纳米微球或主体磁性微球；和/或，所述磁性复合微球的磁含量为5～50wt.％；
更佳地，所述主体磁性微球的表面具有含氨基或其聚合物的修饰，所述客体纳米微球的表面具有含羧基或醛基的单体或其聚合物的修饰；和/或，所述含氨基的聚合物为聚乙烯亚胺；和/或，所述磁性复合微球的磁含量为10～30wt.％。
3.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述客体纳米微球的表面偶联生物捕获分子，所述生物捕获分子用于结合待测分子；
较佳地，所述生物捕获分子为抗体分子或抗原分子。
4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括匹配微球，当所述客体纳米微球产生单线态氧时，所述匹配微球用于将单线态氧的能量转换为荧光；当所述客体纳米微球用于将单线态氧的能量转换为荧光时，所述匹配微球用于产生单线态氧；
较佳地，所述检测试剂盒还包括生物检测分子，所述生物检测分子用于结合待测分子，并且所述生物检测分子和所述生物捕获分子结合所述待测分子的不同位点；其中，所述生物检测分子与所述匹配微球特异性结合。
5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，产生单线态氧的所述匹配微球或客体纳米微球包含光敏剂，所述光敏剂在接收到激发光后产生单线态氧；转换所述单线态氧的能量的客体纳米微球或匹配微球包含二甲基噻吩和镧系金属配合物，所述二甲基噻吩将单线态氧的能量转换为发射光，并通过镧系金属配合物产生荧光；和/或，所述生物检测分子与所述匹配微球通过生物素-亲和素***特异性结合；
较佳地，所述生物检测分子或待测分子为生物素修饰的生物检测分子或待测分子，所述匹配微球为链霉亲和素修饰的匹配微球；和/或，所述镧系金属配合物选自铕、铽和钐中的一种或多种。
6.一种检测生物分子的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)在生物检测分子存在或不存在时，将磁性复合微球和包含待测分子的样本混合孵育，并去除基质反应液；
(2)将(1)中获得的微球加入含有匹配微球的溶液中，混合孵育，检测并收集发光信号；
其中，(1)中，当生物检测分子不存在时，(2)前还包括将(1)中获得的微球加入含有生物检测分子的溶液中，混合孵育，并去除基质反应液的步骤；
其中，所述磁性复合微球如权利要求1～3任一项所定义，所述生物检测分子和所述匹配微球如权利要求4所定义。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述去除基质反应液通过磁吸附进行；
和/或，(1)中，所述去除基质反应液后可选地还包括洗涤的步骤；
和/或，(2)中，所述混合孵育后可选地还包括洗涤的步骤；
较佳地，(1)中，所述去除基质反应液后还包括洗涤的步骤；和/或，(2)中，所述混合孵育后还包括洗涤的步骤。
8.如权利要求6～7任一项所述的方法，其特征在于，所述混合孵育在缓冲液中进行；和/或，所述磁性复合微球的投料量为50-250μg/mL；和/或，所述发光信号通过光电检测器或成像***采集；
较佳地，所述光电检测器为PMT、PD或APD，激发波长680nm，测定波长615nm。
9.一种制备磁性复合微球的方法，其特征在于，所述方法包括将主体磁性微球和客体纳米微球在液相条件下混合，避光反应使所述主体磁性微球和客体纳米微球共价连接即得；所述客体纳米微球用于产生单线态氧或将单线态氧的能量转换为荧光；所述主体磁性微球和客体纳米微球的投料比为(1～10):1；
较佳地，所述主体磁性微球或客体纳米微球的表面具有含氨基、羧基或醛基的单体或其聚合物的修饰；和/或，所述主体磁性微球和客体纳米微球的投料比为(2～5):1；和/或，所述液相条件为MEST溶液；
更佳地，所述主体磁性微球或客体纳米微球的表面具有含氨基或其聚合物的修饰，相应地所述客体纳米微球或主体磁性微球的表面具有含羧基或醛基的单体或其聚合物的修饰；所述含氨基的单体聚合物优选地为聚乙烯亚胺；和/或，所述混合为主体磁性微球MEST溶液滴入所述客体纳米微球MEST溶液中。
10.一种如权利要求1～5任一项所述的检测试剂盒在检测生物分子中的应用；
较佳地，所述生物分子为蛋白分子。
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