CN110960676B - 一种铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇及其制备方法和应用，属于纳米材料、放射治疗以及免疫治疗技术领域。解决了现有技术中纳米放射增敏剂在治疗后很难被生物降解或迅速从体内清除从而影响短期的放疗损伤以及纳米放射增敏剂长期的体内滞留而带来的毒副作用的问题。本申请的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇，结构式为：X₄[Fe₄(H₂O)₁₀(β‑SeW₉O₃₃)₂]·21H₂O，X为Na或K。上述铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇不仅具有尺寸小易代谢的优势，还具有肿瘤微环境响应的氧化还原性和催化活性，能够在肿瘤部位产生原位氧化应激，杀死原位瘤的同时激活全身免疫反应，且能够联合免疫检查点抑制剂实现转移瘤的抑制，可用于免疫放射治疗增敏剂。

Description

一种铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇及其制备方法和应用

技术领域

本申请涉及纳米材料、放射治疗以及免疫治疗技术领域，具体涉及一种铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇及其制备方法和应用。

背景技术

放射治疗(放疗)是一种有效的局部肿瘤治疗方法，在临床上已广泛应用于各种癌症的治疗。然而，作为一种经典的局部肿瘤治疗方法，放疗仍然不能有效地控制肿瘤的转移，甚至不能消除放射区域外的转移性肿瘤，而这往往是导致患者死亡的根本原因。近年来，免疫检查点治疗成为了治疗转移肿瘤的一种有效手段，它是结合免疫检查点抑制剂(例如：anti-CTLA4或anti-PD-L1)，激活机体自身的免疫反应来杀死肿瘤细胞。免疫放射治疗(免疫放疗)已成为治疗局部和转移肿瘤的一种新兴策略。它将具有空间定位的放射治疗和能够提高机体免疫力的免疫治疗相结合，在有效地消除局部实体瘤的同时，还能够达到抑制放疗区外转移瘤的效果，对提高患者的整体生存率具有重要意义。

尽管这样，免疫放射治疗在实际的临床应用中仍然存在着一定的问题。一方面，为了实现局部肿瘤的彻底消融，通常需要大剂量的X射线照射来抑制局部肿瘤的生长，但由于免疫治疗的有效性在很大程度上依赖于免疫***的功能，例如，免疫细胞在抗原呈递细胞(APC_S)的抗原呈递、T细胞在肿瘤中的扩增和浸润等过程中发挥着重要作用。而免疫***对X射线高度敏感，大剂量X射线照射后会被抑制，因此辐射诱导的免疫抑制可能会影响治疗的最终效果，从而导致全身免疫治疗失败。另一方面，肿瘤抗原不足导致的低免疫原性和肿瘤微环境的免疫抑制性(例如，细胞毒性T淋巴细胞在瘤内浸润不足)也影响了免疫治疗的效果。因此，如何以相对较低的辐射剂量选择性地抑制局部肿瘤，并有效地诱导机体产生强大的免疫应答，是免疫放疗中一个关键而具有挑战性的问题。

近年来，纳米生物技术的迅速发展为放射治疗和免疫放射治疗提供了机遇。通过各种基于纳米材料的抗肿瘤策略，放射治疗在提高放射治疗效果中受益匪浅。例如，许多具有高原子序数的纳米材料已经成为辐射剂量放大剂，能够有效地降低辐射剂量。另外，针对特定肿瘤微环境(TME)，一些调控TME的纳米材料(例如，降低细胞内GSH浓度，将低毒细胞内H₂O₂转化为高活性_.OH)也为纳米增敏剂的合理设计提供了新的参考。这些策略除了能够在相对较低的照射剂量下提高局部肿瘤的治疗效果外，还能够减少对全身免疫***的损伤，从而有效地激活抗肿瘤免疫应答，为转移瘤的治疗提供有效的手段。此外，这些纳米增敏剂通常被设计为用于增强肿瘤微环境中活性氧(ROS)的生成。而最近的研究表明，这些活性氧还可以通过诱导免疫原性细胞死亡(ICD)来刺激免疫反应。例如，许多纳米粒子介导的ROS，如O₂ ¹和_.OH，已经被证实会引起内质网应激，然后通过诱导钙质网蛋白暴露于细胞表面以引起肿瘤抗原的提呈和T淋巴细胞的活化，从而增加肿瘤免疫原性，达到消除原位肿瘤的效果和降低肿瘤转移的风险。这样，通过合理的纳米材料设计，这些纳米粒子不仅有可能通过提高ROS的产生来增强原发性肿瘤的治疗效果，而且有可能有效地激活免疫反应，从而通过免疫治疗杀死转移性肿瘤。从进一步临床转化来看，由于患者对辐射耐受性的限制，放射治疗通常采用分次方案，这就要求在下次治疗前将纳米放射增敏剂清除体外，以避免残留纳米放射增敏剂引起的副作用。然而，上述纳米放射增敏剂在治疗后很难被生物降解或迅速从体内清除，从而影响了短期的放疗损伤，且纳米放射增敏剂长期的体内滞留而带来的毒副作用。由于患者对辐射耐受性的限制，放射治疗通常采用分次方案，这就要求在下次治疗前将纳米放射增敏剂清除体外，以避免残留纳米放射增敏剂引起的副作用。因此，开发一种不仅能增强局部肿瘤的放射敏感性和抑制肿瘤转移的抗肿瘤免疫反应，而且还具有快速代谢的能力以最大限度地避免体内副作用的纳米增敏剂具有重要的意义。

发明内容

鉴于上述的分析，本申请旨在提供一种铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇及其制备方法和应用，解决了现有技术中纳米放射增敏剂在治疗后很难被生物降解或迅速从体内清除从而影响短期的放疗损伤以及纳米放射增敏剂长期的体内滞留而带来的毒副作用的问题。

本申请的目的主要是通过以下技术方案实现的：

本申请提供了一种铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇，纳米团簇的结构式为：X₄[Fe₄(H₂O)₁₀(β-SeW₉O₃₃)₂]·21H₂O，X为Na或K。

在一种可能的设计中，铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的粒径为3～10nm。

本申请还提供了一种铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的制备方法，用于制备上述铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇，制备方法包括如下步骤：

步骤1：将钨酸钠二水合物溶解在水中，搅拌加热至充分溶解，得到钨酸钠二水合物的水溶液；

步骤2：在搅拌的前提下，向钨酸钠二水合物的水溶液中加入六水三氯化铁和***钠，得到混合物溶液；

步骤3：将混合物溶液的pH调节至酸性，进行反应，得到反应溶液；

步骤4：采用第一主族金属元素氯化物使反应溶液中的铁取代的二聚硒钨酸阴离子结晶，得到铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇。

在一种可能的设计中，第一主族金属元素氯化物为氯化钠或氯化钾。

在一种可能的设计中，步骤3中，钨酸钠二水合物、六水三氯化铁和***钠的质量比为18～20：3～5：1。

在一种可能的设计中，步骤3中，反应温度控制在80～100℃，反应时间控制在1～2h。

在一种可能的设计中，步骤3中，采用盐酸将混合物溶液的pH调节至0～2.0。

在一种可能的设计中，步骤4中，采用第一主族金属元素氯化物使反应产物液体中的铁取代的二聚硒钨酸阴离子结晶之前还包括如下步骤：反应结束后将反应溶液冷却至室温，过滤去除反应溶液中的固体。

在一种可能的设计中，步骤4中，采用第一主族金属元素氯化物使反应产物液体中的铁取代的二聚硒钨酸阴离子结晶之后还包括如下步骤：冰水洗涤结晶后的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇。

本申请还提供了一种铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的应用，上述二聚硒钨酸纳米团簇用于免疫放射治疗增敏剂。

在一种可能的设计中，上述铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的应用方法包括如下步骤：

采用谷胱甘肽GSH和Fe₄Se₂W₁₈NCs反应，Fe₄Se₂W₁₈NCs通过氧化还原反应清除谷胱甘肽GSH，并且得到二价铁的Fe₄Se₂W₁₈NCs；

或者，上述铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的应用方法包括如下步骤：采用含有适量的谷胱甘肽GSH、H₂O₂和Fe₄Se₂W₁₈NCs的体系检测羟基自由基的产生，并利用一定剂量的X-ray实现光催化产生羟基自由基。

与现有技术相比，本申请至少可实现如下有益效果之一：

a)本申请提供的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇为可溶性的盐类，其在水溶液中具有更好的溶解性，不仅能增强局部肿瘤的放射敏感性和抑制肿瘤转移的抗肿瘤免疫反应，而且还具有快速代谢的能力，能够最大限度地避免体内副作用。同时，上述铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇，不仅能够拓宽现有Fenton试剂的pH使用范围，需要说明的是，Fenton试剂现有的pH使用范围为2～4，使用铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇后，使该Fenton试剂肿瘤微环境中(pH 6.50-6.90)能够有效发生反应，还能够在X-ray的照射下具有更好的羟基自由基产生效果，适用于作为放射治疗增敏剂，降低辐射剂量。

b)本申请提供的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的尺寸较小，其粒径在3～10nm范围内，有利于充分代谢出体外，从而能够满足临床上分次放疗的需求，通过多次治疗产生更多抗原的同时保护免疫***不受损伤，结合免疫检查点抑制剂(anti-PD-L1)，其在X-ray的照射下不仅具有良好的原位肿瘤选择性杀伤效果，还能够激起全身免疫反应，抑制远端肿瘤的生长，实现安全有效的免疫放射治疗。

c)本申请铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的制备方法首次制备溶解度较高的铁取代的二聚硒钨酸，采用氯化钠将铁取代的二聚硒钨酸阴离子结晶出来，相对于用铯盐结晶得到的晶体具有更高的溶解度，有利于后续高效地催化双氧水产生羟基自由基，打破传统铁Fenton试剂的pH依赖性。此外，上述制备方法具有简单易行、低成本、高产量和绿色环保的特点，更有利于促进工业化生产。

d)本申请提供的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的应用方法，三价铁取代的二聚硒钨酸其能够与肿瘤微环境(TME)内的谷胱甘肽(GSH)反应，生成二价铁取代二聚硒钨酸，和TME中的H₂O₂发生Fenton反应，产生大量的高活性羟基自由基，助力肿瘤免疫放射放疗；同时，本申请采用X-ray作为外界光源，利用的不仅是Fe₄Se₂W₁₈ NCs中大量钨原子增强X-ray的沉积，还能够基于铁离子实现光Fenton反应，加速整个Fenton反应产生羟基自由基的速率，从而达到局部选择性放射治疗的效果。

本申请的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分的从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的目的和其他优点可通过在所写的说明书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

附图仅用于示出具体实施例的目的，而并不认为是对本申请的限制，在整个附图中，相同的参考符号表示相同的部件。

图1为本申请铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的阴离子结构示意图；

图2为本申请实施例1的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的透射电镜图；

图3a为本申请实施例1的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的X射线光电子能谱图(元素分析总谱图)；

图3b为本申请实施例1的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的X射线光电子能谱图(铁元素的价态分析)；

图3c为本申请实施例1的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的X射线光电子能谱图(钨元素的价态分析)；

图3d为本申请实施例1的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的X射线光电子能谱图(硒元素的价态分析)；

图4为本申请实施例3的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的谷胱甘肽清除效果图；

图5为本申请实施例4的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的羟基自由基产生效果图；

图6为本申请实施例5铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的细胞自由基产生效果图；

图7a为本申请实施例6铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的活体体内代谢清除效果图(无X射线照射)；

图7b为本申请实施例6铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的活体体内代谢清除效果图(X射线照射)；

图8a为本申请实施例8铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的免疫放射治疗活体治疗效果图(原位瘤)；

图8b为本申请实施例7铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的免疫放射治疗活体治疗效果图(远端瘤)。

具体实施方式

下面结合附图来具体描述本申请的优选实施例，其中，附图构成本申请一部分，并与本申请的实施例一起用于阐释本申请的原理。

本申请提供了一种铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇，参见图1，纳米团簇的结构式为：X₄[Fe₄(H₂O)₁₀(β-SeW₉O₃₃)₂]·21H₂O，X为Na或K。

与现有技术相比，本申请提供的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇为可溶性的盐类，其在水溶液中具有更好的溶解性，不仅能增强局部肿瘤的放射敏感性和抑制肿瘤转移的抗肿瘤免疫反应，而且还具有快速代谢的能力，能够最大限度地避免体内副作用。同时，上述铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇，不仅能够拓宽现有Fenton试剂的pH使用范围，需要说明的是，Fenton试剂现有的pH使用范围为2～4，使用铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇后，使将该Fenton试剂肿瘤微环境中(pH 6.50-6.90)能够有效发生反应，还能够在X-ray的照射下具有更好的羟基自由基产生效果，适用于作为放射治疗增敏剂，降低辐射剂量。

此外，上述铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的尺寸较小，其粒径在3～10nm(例如，5nm)范围内，有利于充分代谢出体外，从而能够满足临床上分次放疗的需求，通过多次治疗产生更多抗原的同时保护免疫***不受损伤，结合免疫检查点抑制剂(anti-PD-L1)，其在X-ray的照射下不仅具有良好的原位肿瘤选择性杀伤效果，还能够激起全身免疫反应，抑制远端肿瘤的生长，实现安全有效的免疫放射治疗。

本申请还提供了一种铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的制备方法，用于制备上述铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇，该制备方法包括如下步骤：

步骤1：将钨酸钠二水合物溶解在水中，搅拌加热至45～60℃充分溶解，得到钨酸钠二水合物的水溶液；

步骤2：在搅拌的前提下，向钨酸钠二水合物的水溶液中加入六水三氯化铁(固体)和***钠(粉末)，得到混合物溶液；

步骤3：采用盐酸将混合物溶液的pH调节至0～2.0(例如，1.0)，进行反应，得到反应溶液，反应溶液中含有铁取代的二聚硒钨酸阴离子；

步骤4：采用第一主族金属元素氯化物粉末(例如，氯化钠或氯化钾)使反应溶液中的铁取代的二聚硒钨酸阴离子结晶，得到铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇。

与现有技术相比，本申请铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的制备方法首次制备溶解度较高的铁取代的二聚硒钨酸，采用氯化钠将铁取代的二聚硒钨酸阴离子结晶出来，相对于用铯盐结晶得到的晶体具有更高的溶解度，有利于后续高效地催化双氧水产生羟基自由基，打破传统铁Fenton的试剂的pH依赖性。此外，上述制备方法具有简单易行、低成本、高产量和绿色环保的特点，更有利于促进工业化生产。

为了促进钨酸钠二水合物、六水三氯化铁和***钠的反应，上述步骤3中，钨酸钠二水合物、六水三氯化铁和***钠的质量比控制在18～20：3～5：1(例如，18.9：3.5：1)之内，保证反应能够充分进行并且所剩的副产物不影响后续分离产物。

为了进一步促进钨酸钠二水合物、六水三氯化铁和***钠的反应，上述步骤3中，反应温度控制在80～100℃，反应时间控制在1～2h，示例性地，将混合物溶液置于80～100℃的水浴中进行加热反应。其中，将反应温度控制在80～100℃范围内，能够有效控制反应物之间的反应速率，将反应时间控制在1～2h范围内，能够保证反应产物的产率。

为了提高上述制备方法制得的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的纯度，上述步骤4中，采用第一主族金属元素氯化物(粉末，例如，氯化钠或氯化钾)使反应产物液体中的铁取代的二聚硒钨酸阴离子结晶之前还包括如下步骤：反应结束后将反应溶液冷却至室温，过滤去除反应溶液中的固体，过滤离心转速为10000～13000rpm，过滤离心时间为15～40min，这样，通过将反应溶液冷却，能够促进未反应的反应物从反应溶液中析出，进而提高上述制备方法制得的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的纯度。

为了进一步提高上述制备方法制得的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的纯度，上述步骤4中，采用第一主族金属元素氯化物(粉末，例如，氯化钠或氯化钾)使反应产物液体中的铁取代的二聚硒钨酸阴离子结晶之后还包括如下步骤：冰水洗涤结晶后的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇。对结晶后的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇进行洗涤，能够去除结晶后的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇上附着的反应物，从而进一步提高上述制备方法制得的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的纯度，同时，采用温度较低的冰水，能够降低结晶后的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇在水中的溶解性，防止结晶后的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇重新溶解到水中，从而提高铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的产率。

本申请还提供了一种铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的应用，上述铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇用于免疫放射治疗增敏剂。

上述铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的应用方法包括如下步骤：

采用谷胱甘肽GSH和Fe₄Se₂W₁₈NCs反应，Fe₄Se₂W₁₈NCs通过氧化还原反应清除谷胱甘肽GSH，并且得到二价铁的Fe₄Se₂W₁₈NCs；

或者，上述铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的应用方法包括如下步骤：采用含有适量的谷胱甘肽GSH、H₂O₂和Fe₄Se₂W₁₈NCs的体系检测羟基自由基的产生，并利用一定剂量的X-ray实现光催化产生羟基自由基。

与现有技术相比，本申请提供的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的应用方法，三价铁取代的二聚硒钨酸其能够与肿瘤微环境(TME)内的谷胱甘肽(GSH)反应，生成二价铁取代二聚硒钨酸，和TME中的H₂O₂发生Fenton反应，产生大量的高活性羟基自由基，助力肿瘤免疫放射放疗；同时，本申请采用X-ray作为外界光源，利用的不仅是Fe₄Se₂W₁₈ NCs中大量钨原子增强X-ray的沉积，还能够基于铁离子实现光Fenton反应，加速整个Fenton反应产生羟基自由基的速率，从而达到局部选择性放射治疗的效果。将该材料通过原位注射的方式注入适量于瘤子内，然后用一定剂量的X-ray进行多次照射，期间腹腔注射一定量的anti-PD-L1抗体，后续观察并记录小鼠体重和瘤子体积。

实施例1：铁取代的二聚硒钨酸钠盐的合成

将6.60g钨酸钠二水合物溶解在水中，然后边搅拌边加热至50℃充分溶解。在搅拌的前提下加入1.23g六水三氯化铁固体和0.35g***钠粉末；用4M的盐酸调节溶液pH1.0；接着，在水浴中加热溶液至90℃，保持1h；反应结束后，冷却，通过离心除去多余的反应固体(12000rpm，30min)，用6g氯化钠粉末使铁取代的二聚硒钨酸阴离子结晶出来，冰水洗涤，得到铁取代的二聚硒钨酸钠盐。

利用透射电子显微镜对本实施例得到的铁取代的二聚硒钨酸钠盐进行形貌表征，结果参见图2，从图2中可以看出铁取代的二聚硒钨酸钠盐的粒径约5nm。

利用不同溶液(水溶液、磷酸盐缓冲液、细胞培养基、胎牛血清)对本实施例得到的铁取代的二聚硒钨酸钠盐进行分散，结果表明，铁取代的二聚硒钨酸钠盐可以完全溶解于不同种类的溶液中。

利用X射线光电子能谱对本实施例得到的铁取代的二聚硒钨酸钠盐进行元素及价态表征，结果如图3a至3d所示，从图3a至3d中可以看出铁取代的二聚硒钨酸钠盐中的钨元素为六价，硒元素为四价，铁元素为三价。

实施例2：铁取代的二聚硒钨酸钾盐的合成

将6.60g钨酸钠二水合物溶解在水中，然后边搅拌边加热至60℃充分溶解。在搅拌的前提下加入1.23g六水三氯化铁固体和0.35g***钠粉末；用4M的盐酸调节溶液pH1.0；接着，在水浴中加热溶液至90℃，保持1h；反应结束后，冷却，通过离心除去多余的反应固体(10000rpm，30min)，用6g氯化钾粉末使铁取代的二聚硒钨酸阴离子结晶出来，冰水洗涤，得到铁取代的二聚硒钨酸钾盐。

实施例3：铁取代的二聚硒钨酸的谷胱甘肽清除效果的研究

Ellman’s试剂(DTNB)是一种经典检测巯基的试剂，它可以和GSH中的巯基反应生成黄色产物TNB，该产物在412nm处有特征吸收峰，可以通过检测产物的吸光度判断GSH的消耗程度。基于此方法评价Fe₄Se₂W₁₈NCs和GSH的反应程度。

参见图4，Fe₄Se₂W₁₈ NCs能够在短时间内降低GSH的含量，达到良好的清除GSH的效果。其中Fe₄Se₂W₁₈NCs和GSH的使用浓度分别为100μg/mL和1.0mM。

实施例4：铁取代的二聚硒钨酸的羟基自由基产生能力评价

对苯二酸钠盐(TA)可以与羟基自由基发生反应，生成一种能产生强荧光特性的产物(TAOH)。根据反应后荧光的强弱(λ_ex：315nm，λ_em：435nm)判断羟基自由基的相对浓度。

参见图5，Fe₄Se₂W₁₈NCs在GSH的存在下可以先生成二价铁取代的Fe₄Se₂W₁₈NCs，然后催化H₂O₂产生羟基自由基，并且该反应在X-ray的照射下，产生羟基自由基的量大大增加，由此可以说明Fe₄Se₂W₁₈NCs用作增敏剂的可行性。

实施例5：铁取代的二聚硒钨酸在细胞上产生活性氧自由基的效果研究

DCFH-DA：是一种经典的检测细胞活性氧产生的试剂。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜进入内后被细胞内的酯酶水解，生成的产物可以和活性氧反应产生有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可知道细胞内活性氧水平。

参见图6，Fe₄Se₂W₁₈NCs可以引起细胞内活性氧水平的升高，并具有浓度依赖性，在X-ray的照射下，ROS产生的水平进一步提高，说明Fe₄Se₂W₁₈NCs能够在细胞水平上产生大量ROS。

实施例6：铁取代的二聚硒钨酸在活体上的代谢情况研究

为了评价铁取代的二聚硒钨酸的体内代谢情况：采用BALB/c雌鼠，将其分为对照组，纳米材料组和纳米材料加X射线组。对于对照组，每只小鼠注射50μL PBS；对于治疗组，每只小鼠注射50μL Fe₄Se₂W₁₈ NCs；对于纳米材料加X射线组，每只小鼠注射50μL Fe₄Se₂W₁₈NCs并用X-ray射线照射(3Gy)。最后，在不同时间点，处死小鼠，取出小鼠的血液及脏器(心、肝、脾、肺、肾、肿瘤)进行钨元素的定量分析(电感耦合等离子体质谱)。

参见图7a至7b，根据定量结果，大部分Fe₄Se₂W₁₈NCs可以在24小时后被代谢出体外，尤其是主要脏器几乎没有材料残余；经过X-ray照射的肿瘤代谢速度要快于未照射的，这和X-ray破坏肿瘤间质有关，进一步加速Fe₄Se₂W₁₈ NCs在肿瘤内的代谢。

实施例7：铁取代的二聚硒钨酸在活体上进行免疫放射治疗的效果评价

由于铁取代的二聚硒钨酸具有产生活性氧自由基的能力，因此能够作为免疫放疗增敏剂，联合免疫检查点抑制剂，增强原位肿瘤杀伤效果的同时，激活机体免疫能力抑制远端肿瘤的生长。

为了评价铁取代的二聚硒钨酸的免疫放射治疗效果，我们采用BALB/c雌鼠，将其分为对照组，Fe₄Se₂W_18:NCs组，单独X射线组，Fe₄Se₂W₁₈NCs+X射线组，单独X射线+anti-PD-L1抗体组，Fe₄Se₂W₁₈ NCs+X射线+anti-PD-L1抗体组。4T1细胞作为原发肿瘤接种在每只小鼠的右后肢。三天后，第二个肿瘤，作为模拟的转移肿瘤，接种在同一只小鼠的左后肢，当原发肿瘤体积达到100-150mm³时，小鼠在肿瘤内注射Fe₄Se₂W₁₈NCs，并接受分割的低剂量X射线辐射(3Gy/次，每天一次，共4次)。在第1天、第3天、第5天和第7天，在anti-PD-L1+X射线和Fe₄Se₂W₁₈ NCs+X射线+anti-PD-L1中的小鼠腹腔注射75μg/小鼠的anti-PD-L1抗体。Fe₄Se₂W₁₈ NCs采用瘤内注射的方式给药(10mg/mL，50μL/只)，anti-PD-L1抗体采用腹腔注射的方式给药(75μg/只)，X-ray剂量(160kV，25mA，0.30mm Cu)。治疗后观察并测量两侧肿瘤大小。

参见图8a至8b，基于铁取代的二聚硒钨酸的免疫放射治疗对于小鼠4T1乳腺癌皮下肿瘤的原位肿瘤和远端肿瘤的具有一定的抑制效果。对于原位肿瘤，Fe₄Se₂W₁₈ NCs和单独X射线治疗均较对照组有一定的抑瘤作用，而Fe₄Se₂W₁₈ NCs加X射线对这种尺寸的肿瘤有明显的抑制作用。对于远端肿瘤，用X射线治疗的原发性肿瘤小鼠仍然表现出快速的生长，说明单独放疗引起远端的效果并不好。而用Fe₄Se₂W₁₈ NCs治疗的小鼠则表现出生长速度降低，这表明局部治疗可以在一定程度上激活免疫反应。Fe₄Se₂W₁₈ NCs与X射线结合后，可明显抑制小鼠远端肿瘤的生长。进一步，anti-PD-L1+X射线组小鼠肿瘤的生长速度较单纯X射线有所下降，反映了anti-PD-L1抑制细胞毒性T淋巴细胞耗竭的作用，增强了T细胞在肿瘤部位的浸润和杀伤。与预期的一样，Fe₄Se₂W₁₈NCs加X射线联合anti-PD-L1治疗不仅能杀伤远端4T1肿瘤，而且能抑制远端肿瘤的生长，说明基于铁取代的二聚硒钨酸的免疫放射治疗明显优于Fe₄Se₂W₁₈ NCs或单独anti-PD-L1加X射线治疗。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇，其特征在于，所述纳米团簇的结构式为：X₄[Fe₄(H₂O)₁₀(β-SeW₉O₃₃)₂]·21H₂O，X为Na或K；

所述铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的粒径为3～10nm；

所述铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的制备方法包括如下步骤：

步骤1：将钨酸钠二水合物溶解在水中，搅拌加热至充分溶解，得到钨酸钠二水合物的水溶液；

步骤2：在搅拌的前提下，向钨酸钠二水合物的水溶液中加入六水三氯化铁和***钠，得到混合物溶液；

步骤3：将混合物溶液的pH调节至酸性，进行反应，得到反应溶液；

步骤4：采用第一主族金属元素氯化物使反应溶液中的铁取代的二聚硒钨酸阴离子结晶，得到铁取代的二聚硒钨酸盐纳米团簇；

所述第一主族金属元素氯化物为氯化钠或氯化钾。

2.一种铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的制备方法，其特征在于，用于制备如权利要求1所述的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇，所述制备方法包括如下步骤：

步骤1：将钨酸钠二水合物溶解在水中，搅拌加热至充分溶解，得到钨酸钠二水合物的水溶液；

步骤2：在搅拌的前提下，向钨酸钠二水合物的水溶液中加入六水三氯化铁和***钠，得到混合物溶液；

步骤3：将混合物溶液的pH调节至酸性，进行反应，得到反应溶液；

步骤4：采用第一主族金属元素氯化物使反应溶液中的铁取代的二聚硒钨酸阴离子结晶，得到铁取代的二聚硒钨酸盐纳米团簇。

3.根据权利要求2所述的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的制备方法，其特征在于，所述第一主族金属元素氯化物为氯化钠或氯化钾。

4.根据权利要求2所述的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，钨酸钠二水合物、六水三氯化铁和***钠的质量比为18～20：3～5：1。

5.根据权利要求2所述的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，反应温度控制在80～100℃，反应时间控制在1～2h。

6.根据权利要求2所述的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，采用盐酸将混合物溶液的pH调节至0～2.0。

7.根据权利要求2至6任一项所述的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，采用第一主族金属元素氯化物使反应产物液体中的铁取代的二聚硒钨酸阴离子结晶之前还包括如下步骤：反应结束后将反应溶液冷却至室温，过滤去除反应溶液中的固体。

8.根据权利要求2至6任一项所述的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，采用第一主族金属元素氯化物使反应产物液体中的铁取代的二聚硒钨酸阴离子结晶之后还包括如下步骤：冰水洗涤结晶后的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇。

9.一种铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇的应用，其特征在于，如权利要求1所述的铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇用于制备免疫放射治疗增敏剂。

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