CN106975078A - 一种包含多钨酸钆的纳米材料作为增敏剂的用途 - Google Patents
一种包含多钨酸钆的纳米材料作为增敏剂的用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106975078A CN106975078A CN201710210288.9A CN201710210288A CN106975078A CN 106975078 A CN106975078 A CN 106975078A CN 201710210288 A CN201710210288 A CN 201710210288A CN 106975078 A CN106975078 A CN 106975078A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gadolinium
- many
- tungstates
- chitosan
- many gadolinium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
- A61K41/0038—Radiosensitizing, i.e. administration of pharmaceutical agents that enhance the effect of radiotherapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
- A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
- A61K48/0033—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being non-polymeric
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
- A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/04—X-ray contrast preparations
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
- A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
- A61K49/10—Organic compounds
- A61K49/101—Organic compounds the carrier being a complex-forming compound able to form MRI-active complexes with paramagnetic metals
- A61K49/103—Organic compounds the carrier being a complex-forming compound able to form MRI-active complexes with paramagnetic metals the complex-forming compound being acyclic, e.g. DTPA
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C01—INORGANIC CHEMISTRY
- C01G—COMPOUNDS CONTAINING METALS NOT COVERED BY SUBCLASSES C01D OR C01F
- C01G41/00—Compounds of tungsten
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Composite Materials (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明提供一种包含多钨酸钆的纳米材料作为增敏剂的用途,所述包含多钨酸钆的纳米材料中的多钨酸钆能够与谷胱甘肽发生氧化还原反应,降低谷胱甘肽的含量,进而实现内在增敏。本发明还提供了一种由多钨酸钆、壳聚糖和小干扰RNA构成的多钨酸钆复合纳米材料,本发明的多钨酸钆复合纳米材料具有优良的放射增敏性能,可以吸收大量的X射线产生活性氧物质(ROS),也可以降低HIF‑1α在肿瘤部位的表达并抑制双链断裂的DNA自我修复;并且最重要的是多钨酸钆可以与体内的谷胱甘肽(GSH)发生氧化还原反应,降低体内谷胱甘肽含量,从而产生更多有效的活性氧物质,同时实现内在增敏和外在增敏的有效结合,达到理想的放射增敏效果。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料及放射增敏药物技术领域,涉及一种包含多钨酸钆的纳米材料用作增敏剂的用途,尤其涉及一种基于壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米材料用作增敏剂的用途。
背景技术
放射治疗(RT)作为临床上治疗癌症最为广泛的方法之一,其主要原理是利用穿透力非常强的高强度电离辐射(X射线或γ射线)来抑制肿瘤增殖。在放射治疗过程中,离子辐射与组织内部的水或氧气发生作用,产生大量的具有细胞毒性的活性氧物质(ROS)来诱导细胞DNA双链产生损伤。因此,为了在放射治疗期间增强电离辐射诱导的细胞损伤,足够活性氧物质的产生是很有必要的,通过与DNA双链发生反应而导致DNA双链损伤,从而极大地阻止双链已损坏的DNA自我修复。然而,放射治疗仍然面临不能有效根除乏氧肿瘤这一难题。其中关键的困难之一在于细胞内存在大量的还原型谷胱甘肽(GSH),显著降低了活性氧物质的有效产生并削弱了放射治疗效果。而另一个关键的限制条件是肿瘤在快速增值过程中氧气的耗尽导致肿瘤局部乏氧,从而导致乏氧细胞的放射依耐性,增加DNA自我修复的几率并显著降低了放射治疗作用。并且,在放射治疗过程中采用的是高能量电离辐射(X射线或γ射线),这些高能量辐射可能超过正常细胞的耐受性,从而导致对正常组织的不可避免的损伤作用。因此,为了有效地提高放射治疗效率并最大程度地增强肿瘤消除,开发一种可以同时在肿瘤局部集中吸收大量的辐射剂量和消耗谷胱甘肽,以及通过其他方式有效抑制DNA自我修复来共同增强乏氧肿瘤的放射治疗效果,这种通过多种增敏方式达到良好的治疗效果的理想的、新颖的放射增敏***是非常具有吸引力的。
近年来,大量的研究工作致力于开发基于传统的纳米药物的放射敏化剂作为外在的放射增敏方式,比如:基于金属的纳米颗粒、量子点、超顺磁氧化铁以及基于非金属的纳米颗粒等等。为了使辐射集中在肿瘤局部并有效地提高放射治疗的治疗效果,这些传统的纳米药物放射增敏剂可以在高能辐射下通过散射出X射线/光子,康普顿电子,正负电子对以及俄歇电子等,产生放射化学(自由基或电离)用于乏氧肿瘤的治疗。然而,这些传统放射增敏剂的肾清除率以及生物可降解性低,导致放射增敏剂在体内的长期积累,从而在生物体内产生潜在的不可避免的毒副作用。并且,这些放射增敏剂不能够消除细胞内的谷胱甘肽,从而导致ROS的产生大大减少。
除了致力于许多外在的敏化方式,近年来许多来自于生物本身性质的内在的增敏策略也已开展,用于增强乏氧肿瘤的放射治疗效果。根据以前的相关报道,乏氧诱导因子-1a(HIF-1a)作为乏氧细胞内关键的转录因子,在乏氧条件下能够与多聚聚合酶-1(PARP-1)相互作用,被认为是一种在肿瘤生长过程中对乏氧状态的主要适应性应激的强有力的调节剂。与此同时,以前的相关研究还证明:降低HIF-1a在乏氧细胞内的表达可以促进多聚聚合酶的降解,抑制已损伤的双链DNA(DSB)的自我重建,并且可以上调半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表达,从而促进了细胞的凋亡。因此,HIF-1a siRNA已被广泛应用于介导靶向乏氧肿瘤,用于下调乏氧细胞内HIF-1a的表达,从而克服乏氧肿瘤的放射依耐性并抑制在放射治疗过程中已断裂的双链DNA的自我修复。然而,迄今为止,很少有相关报道涉及纳米材料是否可以同时通过外在的增敏方式和内在的增敏方式协同配合使用,以同时达到改善放射增敏效果,因而这方面的研究具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题,本发明的目的在于提供一种包含多钨酸钆的纳米材料作为增敏剂的用途。本发明发现多钨酸钆在作为增敏剂的一个新的特性,从而实现外在增敏和内在增敏的协同配合,来改善实际应用中的放射增敏效果。
为达到此发明目的,本发明采用以下技术方案:
本发明提供一种包含多钨酸钆的纳米材料作为增敏剂的用途,所述纳米材料中的多钨酸钆与谷胱甘肽发生氧化还原反应,降低谷胱甘肽的含量。
本发明的包含多钨酸钆的纳米材料中的多钨酸钆不仅能够降低谷胱甘肽的水平,还可以很好的实现放射增敏效果。
本发明通过向老鼠肿瘤部位采取原位注入方式,然后对肿瘤进行局部X射线照射进行检测,结果发现肿瘤具有一定的抑制作用。
本发明创造性地发现多钨酸钆可以与谷胱甘肽(比如人体内的)发生氧化还原反应,降低谷胱甘肽的含量和水平,从而在作为增敏剂用于疾病治疗时,可以通过降低谷胱甘肽在细胞内的水平,从而减少了谷胱甘肽对活性氧物质的消耗,产生更多更有效的活性氧物质,使DNA双链损伤更为严重,产生内在增敏的效果。而且,还可以在X射线的作用下提高射线杀伤作用,达到外在增敏的效果,从而达到内在增敏和外在增敏的协同效果。
本发明所述“包含多钨酸钆的纳米材料”指:可以是多钨酸钆纳米材料,也可以是多钨酸钆复合纳米材料。
优选地,所述纳米材料为多钨酸钆纳米材料。
本发明中,多钨酸钆属于多金属氧酸盐中的一种晶体物质。
作为本发明所述包含多钨酸钆的纳米材料的优选技术方案,所述纳米材料为多钨酸钆复合纳米材料。
优选地,所述多钨酸钆复合纳米材料包括多钨酸钆以及修饰多钨酸钆的修饰物。
优选地,所述修饰物包括壳聚糖(Chitosan)、脂质体或水溶液带正电荷的高分子聚合物中的任意一种或至少两种的组合,但并不限于上述列举的修饰物,其他本领域常用的带正电的修饰物也可用于本发明。
优选地,所述多钨酸钆复合纳米材料包括多钨酸钆以及修改多钨酸钆的壳聚糖,而且,多钨酸钆作为内核,具有良好生物相容性和可降解性的生物高分子壳聚糖修饰在多钨酸钆的外层。
作为本发明所述多钨酸钆复合纳米材料的优选技术方案,所述多钨酸钆复合纳米材料中还包含带负电的物质,所述带负电的物质优选为小干扰RNA(Small interferingRNA,siRNA),进一步优选为乏氧诱导因子-1α(简称HIF-1α)表达的小干扰RNA。
本发明中,将乏氧诱导因子-1α表达的小干扰RNA简称为HIF-1αsiRNA。
本发明中的小干扰RNA是一种可以调节肿瘤细胞内某种蛋白的小干扰RNA。本发明中的HIF-1αsiRNA主要针对乏氧肿瘤细胞内乏氧诱导因子1α(HIF-1α)的调节,可下调HIF-1α在乏氧细胞中的表达。
优选地,所述小干扰RNA负载在修饰有壳聚糖的多钨酸钆的表面。
优选地,所述多钨酸钆复合纳米材料的粒径为30nm~40nm,例如30nm、33nm、35nm、36nm、38nm或40nm等。
优选地,所述多钨酸钆复合纳米材料的水合粒径为40nm~60nm,例如40nm、42nm、43nm、45nm、48nm、50nm、51nm、53nm、55nm、58nm或60nm等。
优选地,由多钨酸钆和壳聚糖构成的多钨酸钆复合纳米材料的水体系的电势为+30mV~+60mV,例如+30mV、+32mV、+34mV、+35mV、+37mV、+38mV、+39mV、+41mV、+43mV、+45mV、+47mV、+50mV、+53mV、+55mV、+58mV或+60mV等。
优选地,由多钨酸钆、壳聚糖和小干扰RNA构成的多钨酸钆复合纳米材料的水体系的电势为+10mV~+30mV,例如+10mV、+12mV、+14mV、+15mV、+17mV、+18mV、+20mV、+22mV、+23mV、+25mV、+27mV、+28mV或+30mV等。
优选地,所述壳聚糖的平均分子量为100KD~300KD(即100000-300000),例如100KD,120KD,150KD,180KD,200KD,210KD,220KD,250KD,255KD,260KD,270KD,280KD或300KD等,考虑壳聚糖与多钨酸钆晶体复合之后得到的复合材料纳米尺寸的问题,优选平均分子量为100KD-200KD,这样合成出来的复合的纳米材料尺寸不至于特别大而导致难以被细胞摄取的问题。
本发明进一步向复合材料中引入小干扰RNA后,再对老鼠肿瘤部位进行X射线照射,发现肿瘤的生长抑制得更为明显,而且肿瘤没有发生复发现象,说明与单一的放射治疗或者单一的基因治疗相比,引入RNA之后得到的复合材料作为放射增敏剂能够达到更加优良的放射治疗与基因治疗的协同治疗效果。
本发明还提供了如上所述的多钨酸钆复合纳米材料的制备方法,所述方法包括以下步骤:
(1)利用离子凝胶法,使多钨酸钆和壳聚糖反应,制备得到壳聚糖修饰的多钨酸钆,即由多钨酸钆和壳聚糖构成的多钨酸钆复合纳米材料。
本发明中,使用多钨酸钆和壳聚糖发生离子凝胶反应,实现复合,从而得到纳米级别的多钨酸钆复合纳米材料。
优选地,步骤(1)制备壳聚糖修饰的多钨酸钆的过程为:
(A)将壳聚糖溶解在醋酸中,得到壳聚糖的醋酸溶液;
(B)使用多钨酸钆晶体和水,配制多钨酸钆的水溶液;
(C)将多钨酸钆的水溶液与壳聚糖的醋酸溶液混合,形成悬浮液,除杂,得到壳聚糖修饰的多钨酸钆。
优选地,步骤(A)所述醋酸的质量浓度为0.1%~5%,例如0.1%、0.5%、0.8%、1.0%、1.3%、1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%、2.7%、3.0%、3.2%、3.5%、3.7%、3.9%、4.2%、4.4%、4.7%或5.0%等,为了使壳聚糖完全溶解并且不至于醋酸太过量,优选0.1%~3%。
优选地,步骤(C)所述壳聚糖的醋酸溶液中的壳聚糖与多钨酸钆的水溶液中的多钨酸钆的质量比为5~20,例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20等,为了为了使壳聚糖修饰的多钨酸钆能够形成形貌均一、尺寸大小合适的复合纳米材料,利于细胞的摄取,该质量比优选为7~15。
优选地,步骤(C)所述混合的过程为:将多钨酸钆的水溶液滴加到壳聚糖的醋酸溶液中。
优选地,步骤(C)所述混合的过程中伴有搅拌。
优选地,步骤(C)所述除杂的过程为:对悬浮液进行离心,然后将离心产物分散到超纯水中,于透析袋中进行透析。
优选地,所述离心的转速为12000rpm,离心的时间优选为30min。
优选地,所述透析袋的分子量为2.0Dka,透析的时间优选为1天。
作为本发明所述方法的优选技术方案,步骤(B)所述多钨酸钆晶体通过简单环保的重结晶法合成,更优选通过如下方法制备得到:
Ⅰ.将钨酸盐溶于超纯水中形成均匀透明的水溶液A;
Ⅱ.在搅拌的作用下,用酸性化合物调节上述水溶液A的PH值为6.50~8.50,得到溶液B;
Ⅲ.在搅拌作用下,将钆盐水溶液加入上述溶液B中形成水溶液C;
Ⅳ.对上述水溶液C加热,搅拌,直至得到均匀透明的水溶液D;
Ⅴ.最后冷却,待析出多钨酸钆晶体。
此优选技术方案中,步骤Ⅱ和步骤Ⅲ的搅拌独立地可以是磁力搅拌。
此优选技术方案中,步骤Ⅱ和步骤Ⅲ的搅拌都在室温(15℃~35)下进行。
本发明提供了采用经典的简单环保的重结晶方法合成多钨酸钆的方法,通过该方法制备得到的多钨酸钆溶液中不仅含有钨酸钠(Na2WO4·2H2O),还含有少量的NaCl,优选地,可以通过再一次重结晶方法获得更纯更大的多钨酸钆晶体。
优选地,步骤Ⅰ所述钨酸盐为钨酸钠。
优选地,所述钨酸钠的化学组成为Na2WO4·2H2O。
优选地,步骤Ⅰ所述水溶液A中的钨酸盐的浓度为300mg/mL~500mg/mL,例如:300mg/mL、310mg/mL、320mg/mL、330mg/mL、350mg/mL、370mg/mL、390mg/mL、410mg/mL、430mg/mL、450mg/mL、480mg/mL或500mg/mL等。
优选地,步骤Ⅱ所述酸性化合物包括盐酸、醋酸和硝酸等,优选为冰醋酸。
此优选技术方案中,步骤Ⅱ调节水溶液A的pH值为6.50-8.50,例如6.50、6.55、6.60、6.65、6.70、6.75、6.80、6.85、6.90、6.95、7.00、7.05、7.10、7.15、7.20、7.25、7.30、7.35、7.40、7.45、7.50、7.55、7.60、7.65、7.70、7.75、7.80、7.85、7.90、7.95、8.00、8.05、8.10、8.15、8.20、8.25、8.30、8.35、8.40、8.45或8.50等。
优选地,步骤Ⅲ所述钆盐水溶液中的钆盐为氯化钆。
优选地,所述氯化钆的化学组成为GdCl6·6H2O。
优选地,步骤Ⅲ所述钆盐水溶液中的钆盐的浓度为300g/mol~600g/mol,例如300g/mol、320g/mol、330g/mol、350g/mol、360g/mol、380g/mol、400g/mol、420g/mol、440g/mol、460g/mol、490g/mol、510g/mol、530g/mol、550g/mol、570g/mol、590g/mol或600g/mol等。
优选地,步骤Ⅳ所述加热的温度为70℃~90℃,例如70℃、72℃、75℃、77℃、79℃、80℃、82℃、84℃、85℃、87℃或90℃等。
作为本发明所述方法的优选技术方案,所述方法还包括在步骤(1)得到壳聚糖修饰的多钨酸钆之后,进行如下步骤(2):
利用正负电荷相互作用,将带负电的物质负载在壳聚糖修饰的多钨酸钆的表面,从而得到由多钨酸钆、壳聚糖和带负电的物质构成的多钨酸钆复合纳米材料。
作为本发明所述方法的优选技术方案,所述带负电的物质包括小干扰RNA,优选为乏氧诱导因子-1α表达的小干扰RNA。本发明中的小干扰RNA是一种可以调节肿瘤细胞内某种蛋白的小干扰RNA。本发明中的HIF-1αsiRNA主要针对乏氧肿瘤细胞内乏氧诱导因子1α(HIF-1α)的调节,可下调HIF-1α在乏氧细胞中的表达。
优选地,步骤(2)所述负载的过程为:配制壳聚糖修饰的多钨酸钆的水溶液,然后与带负电的物质混合,震荡,然后静置。
本发明的壳聚糖修饰的多钨酸钆的表面能够负载大量带负电的物质(比如带负电的小干扰RNA),所述壳聚糖修饰的多钨酸钆的水溶液中的壳聚糖修饰的多钨酸钆与带负电的物质的质量比优选为0.1~500,例如0.1、1、10、30、50、80、100、120、150、180、210、230、240、260、280、300、310、330、350、370、390、400、420、450、460、480、490或500等。
优选地,所述壳聚糖修饰的多钨酸钆的水溶液中的壳聚糖修饰的多钨酸钆与小干扰RNA的质量比优选为0.1~500,为了使带负电荷的小干扰RNA能够全部载上,并成功释放,该质量比优选为0.1~300,进一步优选为1~210。
优选地,壳聚糖修饰的多钨酸钆的水溶液与带负电的物质混合的过程在无核酸酶水溶液中进行。
作为本发明所述方法的更进一步优选技术方案,所述方法包括以下步骤:
(1)制备多钨酸钆晶体:
Ⅰ.将Na2WO4·2H2O溶于超纯水中形成均匀透明的水溶液A;
Ⅱ.在15℃~35℃磁力搅拌的作用下,用冰醋酸调节上述水溶液A的PH值为6.50-8.50,得到溶液B;
Ⅲ.在15℃~35℃磁力搅拌作用下,将GdCl6·6H2O水溶液加入上述溶液B中形成水溶液C;
Ⅴ.最后冷却,待析出多钨酸钆晶体;
(2)制备壳聚糖修饰的多钨酸钆:
(A)将壳聚糖溶解在冰醋酸中,得到壳聚糖的冰醋酸溶液;
(B)使用步骤(1)得到的多钨酸钆晶体和水,配制多钨酸钆的水溶液;
(C)将多钨酸钆的水溶液与壳聚糖的冰醋酸溶液混合,形成悬浮液,然后将悬浮液在12000rpm的转速下离心30min,再将离心产物置于分子量为2.0Dka的透析袋中透析1天,得到壳聚糖修饰的多钨酸钆;
(3)将小干扰RNA与壳聚糖修饰的多钨酸钆的水溶液在无核酸酶水溶液中混合均匀,震荡,然后在15℃~35℃的温度下静置30min,得到多钨酸钆复合纳米材料。
本发明还提供了如上所述的包含多钨酸钆的纳米材料作为载体的用途。
本发明还提供了如上所述的包含多钨酸钆的纳米材料用于肿瘤治疗的用途。
更进一步,本发明还提供了如上所述的多钨酸钆复合纳米材料作为放射增敏剂在肿瘤放射治疗与基因治疗的协同治疗中的应用。
本发明的多钨酸钆复合纳米材料具有肿瘤多模式成像(MRI/CT)及作为放射增敏剂的放射治疗、基因治疗的功能,并且这些功能能够实现协同治疗效果。
本发明所述的“增敏剂”,又称为放射增敏剂或放射增敏药物。
与现存的放射增敏剂相比,本发明具有如下有益效果:
(1)在本发明中,包含多钨酸钆的纳米材料中,一方面,多钨酸钆能够吸收大量的高能量X射线产生俄歇电子或康普顿电子,利用这些电子可以与有机体环境(如生物体细胞)中的水或氧气反应,产生大量活性氧物质(ROS),从而对细胞DNA双链产生损伤作用,达到放射治疗的效果;另一方面,多钨酸钆还能够和细胞内的谷胱甘肽发生氧化还原反应,降低谷胱甘肽在细胞内的含量水平,从而减少了谷胱甘肽对活性氧物质的消耗,产生更多更有效的活性氧物质,使DNA双链损伤更为严重,达到增强的放射治疗效果。
(2)本发明进一步采用壳聚糖对多钨酸钆进行修饰,并负载小干扰RNA,可以通过介导小干扰RNA进入肿瘤部位,使乏氧肿瘤细胞内HIF-1α的表达降低,因此阻止了双链损伤的DNA的自我修复,最终达到多钨酸钆放射治疗效果、多钨酸钆基因治疗效果以及降低细胞内HIF-1α表达这三方面作用协同治疗的作用,实现了内在增敏和外在增敏的同时增敏作用,达到非常好的放射治疗效果。
(3)在本发明中,利用高分子化合物壳聚糖修饰在多钨酸钆晶体表面,一方面可以形成形貌均一的基于多钨酸钆复合纳米材料同时提高材料的生物相容性,另一方面使用壳聚糖修饰多钨酸钆形成的复合纳米载体的表面带有非常多的正电荷,有利于带负电荷的小干扰RNA的负载,成功实现小干扰RNA在乏氧肿瘤细胞内的转染和释放。
(4)在本发明中,所采用的高分子化合物壳聚糖是一种高分子化合物,具有很好的生物可降解性,可以在体内发生降解,减少对生物体的毒副作用,并且降解之后剩余的多钨酸钆晶体尺寸非常小,可以很快通过肾脏排出体外,从而减少了纳米材料长期蓄积在生物体内所带来的潜在的毒副作用。
附图说明
图1为实施例1的放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料的结构示意图;
图2为实施例1步骤2)的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体的扫描电镜图;
图3为实施例1步骤2)的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体的透射电镜图;
图4为实施例1步骤2)的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体的X射线能谱图;
图5为实施例1步骤2)的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体的红外光谱图,其中GdW10@CS表示壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体;
图6为实施例1的壳聚糖、多钨酸钆晶体以及壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体的热重分析图,其中,CS代表壳聚糖;GdW10代表多钨酸钆晶体;GdW10@CS代表壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体;
图7为实施例1制备得到的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体负载小干扰RNA前后的琼脂糖凝胶电泳图,其中,siRNA代表小干扰RNA;GdW10@CS-siRNA代表负载之后的产品,且复合纳米载体与小干扰RNA的质量比分别为1:5、1:10、1:20、1:40、1:50和1:100;
图8为空白、X射线、多钨酸钆GdW10、多钨酸钆加X射线、多钨酸钆加X射线和谷胱甘肽在X射线照射下的荧光增强图对比图,其中GSH代表谷胱甘肽,GdW10代表多钨酸钆晶体;
图9为单纯过氧化氢、单纯多钨酸钆、单纯X射线、多钨酸钆加X射线对谷胱甘肽含量的影响图,其中GSH代表谷胱甘肽,GdW10代表多钨酸钆晶体;
图10为不同浓度的实施例1制备得到的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体对乏氧条件下人源肝癌细胞BEL-7402细胞活力的影响图,浓度分别为0,6.25μ
g/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL;
图11A为不加入放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料的对照组的乏氧BEL-7402细胞的杀伤效果图;图11B为加入实施例1的放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料联合放疗、基因治疗处理组对乏氧BEL-7402细胞的杀伤效果图;
图12A-图12F为对带有BEL-7402肿瘤的裸鼠瘤内注入不同种处理后联合放疗和基因治疗的抑瘤情况结果图,其中图12A-图12F依次分别代表i-vi组,且i对应PBS缓冲溶液;ii对应壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体;iii对应X射线;iv对应放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料;v对应壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体加X射线;vi对应放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料加X射线;
图13A和图13B为不加入放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料的对照组的老鼠肝脏在不同倍率的病理切片图,图13A中的两个箭头表示转移至肝脏的癌细胞,图13B中的标注虚线圈表示转移至肺部的癌细胞;
图13C和图13D为采取实施例1的放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料与放疗处理之后的老鼠的肝脏在不同倍率的病理切片图;
图14为使用不同浓度的实施例1中得到的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体进行测试得到的磁共振成像和计算机断层扫描双模式成像图,浓度分别为0,6.25mg/mL,12.5mg/mL,25mg/mL和50mg/mL。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
本发明中测定所述的壳聚糖修饰的多钨酸钆负载小干扰RNA的能力,所采用的测定方法为大家熟知的琼脂糖凝胶电泳法。
实施例1
本实施例提供一种多钨酸钆复合纳米材料,所述多钨酸钆复合纳米材料由多钨酸钆、壳聚糖以及小干扰RNA构成。
制备方法:
1)多钨酸钆晶体(命名为GdW10)的合成
在一个典型的实验过程中,首先称取8.3g Na2WO4·2H2O溶于20mL超纯水中形成均匀透明的水溶液,随后在磁力搅拌的作用下,将乙酸慢慢滴入上述溶液中,将上述溶液PH值调节至7.40-7.50。然后在室温和磁力搅拌的作用下,将2mL浓度为477.95g mol-1的GdCl6·6H2O逐滴加入上述溶液,然后将整个溶液体系置于加热台上加热至85℃,待溶液彻底变为澄清透明之后,使之冷却至室温,随后晶体析出。为了使得到的多钨酸钆晶体纯度更大,采取再一次重结晶方法,弃去上清液,将析出的晶体重新溶解在等体积的超纯水中,加热至完全溶解,形成澄清透明的水溶液,然后使之冷却至室温,待晶体再一次析出。
2)高分子化合物壳聚糖修饰的多钨酸钆的制备
首先,将壳聚糖(Chitosan,简称为CS)溶解在1wt%的醋酸溶液中以形成质量浓度为1%的壳聚糖的醋酸溶液,随后称取上述制备得到的多钨酸钆晶体10mg溶解在10mL超纯水中,形成浓度为1mg/mL的多钨酸钆水溶液。然后在室温持续的磁力搅拌作用下,将多钨酸钆水溶液逐滴加入至壳聚糖的醋酸溶液中,以形成稳定的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体(命名为GdW10@CS)悬浮液。其中,加入壳聚糖与多钨酸钆的物质的量之比为10。随后,为了获得纯度更高的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体,将形成的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体以转速为12000rpm离心30min,以除去未反应的游离的壳聚糖水溶液。最后将得到的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体重新分散在超纯水中,置于分子量为2.0Dka的透析袋在超纯水中透析1天,以除去杂质离子,最后置于4℃冰箱中待后续实验使用。
制备得到的高分子化合物壳聚糖修饰的多钨酸钆可以作为载体。
得到的高分子化合物壳聚糖修饰的多钨酸钆也可以称作“壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体”。
3)多钨酸钆复合纳米材料的制备
为了得到由多钨酸钆、壳聚糖和小干扰RNA构成的多钨酸钆复合纳米材料(命名为GdW10@CSsiRNA),首先按照预先设计好的HIF-1αsiRNA量和不同浓度的GdW10水溶液在无核酸酶水溶液中混合均匀,充分震荡之后,在室温下静置30分钟形成放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料。
得到的多钨酸钆复合纳米材料由多钨酸钆、壳聚糖和小干扰RNA构成。
得到的多钨酸钆复合纳米材料可以作为放射增敏剂。
得到的多钨酸钆复合纳米材料也可以称作“放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料”。
本实施例中得到的放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料的结构示意图如图1所示,包括多钨酸钆和壳聚糖,以及壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米材料表面负载的小干扰RNA。
利用扫描电子显微镜(Hitachi High_technologies,Japan,S-4800)对本实施例步骤2)得到的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体进行表征,结果如图2所示,从图中可以看出壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体是形貌均一呈球形的纳米颗粒。
利用透射电子显微镜(FEI Tecnai G2F20)对本实施例步骤2)得到的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体进行表征,结果如图3所示,从图中可以看出壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体形貌均一且粒径处在30-40nm之间。
利用X射线能谱(Hitachi High_technologies,Japan,S-4800)对本实施例步骤2)得到的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体进行表征,结果如图4所示,从图中可以看出壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体中含有大量的C、N、W、O、Gd元素,说明壳聚糖成功修饰在多钨酸钆化合物上。
利用红外谱仪(Nicolet iN10,Thermo Fisher)对本实施例步骤2)得到的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体进行表征,结果如图5所示,1639cm-1和1423cm-1是壳聚糖的特征吸收峰;1076cm-1、931cm-1、842cm-1和783cm-1是多钨酸钆的特征吸收峰,可以看出壳聚糖和多钨酸钆的特征峰都出现在壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体红外谱图中。
由此可以得出,制备的高分子化合物壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体包括高分子化合物壳聚糖和多钨酸钆晶体。
利用热重分析仪(Perkin,Elmer,Diamond TG/DTA)对本实施例的壳聚糖、多钨酸钆晶体以及步骤2)得到的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体进行表征,结果如图6所示,高分子化合物壳聚糖占整个壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体的质量分数为14.3%,多钨酸钆占整个壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体的质量分数为85.7%。
壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体的负载小干扰RNA能力评价:
本实施例步骤3)可以说明高分子化合物壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体可以通过正负电荷相互作用成功负载小干扰RNA,通过琼脂糖凝胶电泳实验可以判断复合纳米载体负载小干扰RNA的负载能力。
更具体地说明,为了负载小干扰RNA,将实施例1中得到的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体与小干扰RNA复合(其中两者的质量比为100,50,40,20,10,5),得到的放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料在振荡器上轻轻震荡均匀,在室温下静置15分钟。为了评估小干扰RNA从放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料上释放下来的能力,加入肝素与放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料在室温下共孵育20分钟,其中肝素与小干扰RNA的物质的量之比为5:1。此外,为了测定壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体对小干扰RNA的保护作用,加入2μL RNA酶(RNase,1μg/μL)与放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料在37℃下孵育1小时,以降解掉1μg的小干扰RNA。其中,游离的小干扰RNA作为空白对照。最后,小干扰RNA负载量、释放量以及壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体对小干扰RNA的保护能力均是通过1%琼脂糖凝胶电泳在120V电压下进行15分钟检测出来。
利用琼脂糖凝胶电泳仪(C300,USA,azure biosystems)对实施例1得到的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体负载小干扰RNA的能力进行表征,结果如图7所示,当复合纳米载体与小干扰RNA的质量比为50:1时,小干扰RNA全部成功负载在复合纳米载体上,达到很好的负载效果。
增敏效果评价:
本实施例说明多钨酸钆在X射线照射下可以产生放射增敏效果,并且谷胱甘肽可以清除活性氧物质。
具体检测过程为:首先,0.5mL溶于DMSO的DCFH-DA与2.0mL浓度为0.01M的NaOH在室温下避光发生水解反应,最终生成探针DCFH。待反应30分钟之后,10mL PBS(25mM,pH7.2)加入上述反应体系中,以终止反应继续进行。随后在形成的DCFH水溶液外侧覆盖一层锡箔纸并置于冰块上用于后续的检测实验。紧接着,在没有或有GSH(1mM)存在的条件下,将实施例1中得到的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体(0.10mg/mL)与上述生成的DCFH水溶液(10μM)混合,然后立即用X-ray照射10分钟。待照射完之后,立即将溶液置于荧光光谱仪下测定样品的荧光光谱,用于检测各个样品ROS产生。
利用荧光光谱仪(Jobin Yvon FluoroLog3,Horiba,Japan)对本实施例中各个样品(空白、X射线、多钨酸钆GdW10、多钨酸钆加X射线、多钨酸钆加X射线和谷胱甘肽)在探针530nm特征吸收峰处的荧光强度的测定,如图8所示,空白对照或探针在X射线照射下荧光强度很低,但是多钨酸钆在X射线照射下荧光强度迅速上升到很大值,一旦加入谷胱甘肽之后(GSH),荧光强度又降低,说明多钨酸钆在X射线照射下可以产生活性氧物质,达到放射增敏效果,并且谷胱甘肽具有清除活性氧物质的能力。
本实施例说明多钨酸钆可以与谷胱甘肽发生氧化还原反应,降低谷胱甘肽的水平,从而实现更多有效的活性氧物质的产生。
将壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体溶解在碳酸盐缓冲溶液中(PBS,PH 8.6,50mM),配成浓度为100μg/mL,然后将此浓度的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体溶液与谷胱甘肽水溶液(0.8mM)按体积比为1:1置于离心管中进行氧化反应,同时在离心管外壁覆盖一层锡箔纸,阻止外界可见光对反应的干扰。随后,将此混合体系置于摇床上,在室温下以150rpm的转速摇4小时。待反应结束之后,分别向反应体系中加入785μL Tris-HCl(0.05M)和15μL DTNB(100mM),继续以相同速度摇5分钟。最后,将反应产物置于酶标仪下,测定412nm处样品的紫外吸收。其中,PBS(PH 8.6,50mM)和纯H2O2(1.0mM)分别作为整个实验的阴性对照和阳性对照。
利用荧光倒置显微镜(Olympus,IX71,JAPAN)在探针的412nm特征吸收峰处测定样品的紫外吸收,检测单纯过氧化氢、单纯多钨酸钆、单纯X射线、多钨酸钆加X射线对谷胱甘肽含量的影响图,如图9所示,阴性对照纯谷胱甘肽在412nm处具有很强的吸收,阳性对照过氧化氢将谷胱甘肽全部反应掉,在412nm处几乎无吸收,但是谷胱甘肽在加入多钨酸钆之后,测定结果显示谷胱甘肽的含量就降低,说明多钨酸钆可以与谷胱甘肽发生氧化还原反应,降低谷胱甘肽的水平,从而减少谷胱甘肽清除活性氧物质的机会。
对乏氧条件下人源肝癌细胞BEL-7402细胞活力影响的评价:
以下实例用于说明实施例1中得到的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体对乏氧条件下人源肝癌细胞BEL-7402细胞活力的影响。
(1)BEL-7402乏氧细胞的培养
首先,将BEL-7402细胞培养在含10%胎牛血清的新鲜培养基DMEM中,放置在37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育。
(2)细胞活力的测定
待细胞生长至一定数量之后,将细胞转移至96孔板中继续孵育24小时,其中细胞密度为4×103/孔。待细胞基本铺满整个孔板之后,将含有不同浓度的从实施例1中得到的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体(6.25,12.5,25.0,50.0,100μg/mL)的分散在含有100μM模拟乏氧环境的CoCl2新鲜培养基中。待共孵育24小时后,10μL新鲜的CCK-8加入每个孔继续共孵育1小时,最后将96孔板置于酶标仪下,在450nm处测定每个孔细胞的吸光度,根据细胞存活率计算公式计算出不同浓度条件下细胞的存活率。
利用酶标仪(Thermo scientific,MULTISCAN MNK3)测定不同浓度的实施例1中得到的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体对乏氧条件下人源肝癌细胞BEL-7402细胞活力的影响,如图10所示,当复合纳米载体浓度高达100μg/mL时,细胞的存活率还大于90%,说明得到的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体对乏氧条件下人源肝癌细胞BEL-7402不会产生明显的细胞毒性,可以进一步应用于抗肿瘤效果的评估。
对乏氧肿瘤细胞中具有放射治疗和基因治疗的协同治疗效果的评价:
以下实例用于说明实施例1中放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料在乏氧肿瘤细胞中具有放射治疗和基因治疗的协同治疗效果。
(1)BEL-7402乏氧细胞的培养
首先,将BEL-7402细胞培养在含10%胎牛血清的新鲜培养基DMEM中,放置在37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育。
(2)协同治疗效果的评估
为了克隆实验,将细胞数目为2000的BEL-7402细胞分散在含有100μM模拟乏氧环境的CoCl2培养基中,然后将悬浮细胞在24孔板中孵育48小时。待贴壁之后,对细胞用放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料与X射线同时处理。其中,空白对照组其他条件一样,只是不加入放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料,待两种方法处理完之后,将细胞继续孵育10天,然后用吉姆萨染液进行染色,最后通过对形成的细胞数进行测定,评估两种方法各自对细胞活力的抑制作用。如图11A和图11B所示,当采用放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料与X射线同时处理细胞之后,细胞的存活率(图11B图)远远小于对照组(图11A图),说明放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料对乏氧条件下人源肝癌细胞BEL-7402会产生明显的放射治疗与基因治疗的协同治疗效果。
对在活体肿瘤模型中具有放射治疗和基因治疗的协同治疗效果的评价:
本实例用于说明实施例1中的放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料在活体肿瘤模型中具有放射治疗和基因治疗的协同治疗效果。
(1)肿瘤模型的构建
首先,从北京维通利华实验动物技术有限公司购买30只BALB/c裸鼠,然后在老鼠皮下植入100μL含有细胞密度为1.0×106的BEL-7402细胞悬液。10天之后,待老鼠的肿瘤体积大小达到约100mm3时,将这些老鼠按实验设计方案进行随机分配。
(2)在活体肿瘤模型中评估协同治疗效果
将带有肿瘤的裸鼠随机分配为6个小组:其中,(i)PBS缓冲溶液组(PBS);(ii)单独壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体(GdW10@CS);(iii)单独X射线组(X-ray);(iv)放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料(GdW10@CSsiRNA);(v)复合纳米材料与X射线组(GdW10@CS+RT);(vi)放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料与X射线组(GdW10@CSsiRNA+RT)。分别对i组带有BEL-7402肿瘤的荷瘤鼠,向瘤内注入20μL PBS溶液;对于ii和v组老鼠,向瘤内注入20μL壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体水溶液;对于iv和vi组老鼠,向瘤内注入20μL放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料水溶液。注入之后,对i,v和vi组的带有BEL-7402肿瘤的荷瘤鼠,采用X-ray(10Gy)照射10分钟。同时,为了保证HIF-1αsiRNA在肿瘤内部的活性,以确保达到更高的治疗效果,每隔2-3天向老鼠体内重新注入新鲜准备的放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料水溶液。随后,分别采用游标卡尺或相机对老鼠肿瘤体积的变化进行测量和拍照。并且采用老鼠肿瘤体积的计算公式如下:肿瘤体积V=ab2/2,其中,a=肿瘤长度;b=肿瘤宽度。
实验结束之后,利用相机对本实施例中各种处理方式的老鼠肿瘤进行拍照,如图12A-图12F所示,说明放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料在活体肿瘤模型中也会产生明显的放射治疗与基因治疗的协同治疗效果,与其他组相比,协同治疗组的肿瘤生长得到最大限度的抑制。
以下实例用于说明实施例1中放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料对活体也不会产生明显的毒性。
(1)肿瘤模型的构建
首先,从北京维通利华实验动物技术有限公司购买30只BALB/c裸鼠,然后在老鼠皮下植入100μL含有细胞密度为1.0×106的BEL-7402细胞悬液。10天之后,待老鼠的肿瘤体积大小达到约100mm3时,将这些老鼠按实验设计方案进行随机分配。
(2)放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料对活体产生的毒性评估
在实验结束之后,对每组老鼠采用眼球取血方式,将搜集到的全血置于1.5mL离心管中,室温下静置2-3小时,然后采用离心机以转速为1500rpm离心5min,以获得血清用于血生化指标的检测,用于判断各组老鼠肝功能和肾功能是否正常。
利用血生化分析仪测定本实施例中取得的各组老鼠血生化指标,如肝功能指标的含量和肾功能指标的含量等,结果见表1,各组老鼠血生化指标:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酐(CREA)和尿素(UREA)。肝功能指标与肾功能指标均在正常范围内,没有出现明显的异常现象,说明放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料对活体不会产生明显的毒性。
表格1
本实例用于说明实施例1中放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料对老鼠肿瘤转移具有一定的抑制作用。
(1)肿瘤模型的构建
首先,从北京维通利华实验动物技术有限公司购买30只BALB/c裸鼠,然后在老鼠皮下植入100μL含有细胞密度为1.0×106的BEL-7402细胞悬液。10天之后,待老鼠的肿瘤体积大小达到约100mm3时,将这些老鼠按实验设计方案进行随机分配。
(2)对老鼠肿瘤转移抑制效果的评价
待实验结束之后,处死老鼠之后,搜集每只老鼠的心,肝、脾、肺和肾,将取得的老鼠脏器用4%的多聚甲醛进行固定两天,随后进行石蜡切片及使用苏木精和伊红(H&E)染色。最后,用荧光倒置显微镜对每个组织切片进行病理学分析。
利用荧光倒置显微镜(Olympus,IX71,JAPAN)对实施例中搜集到的病例切片进行分析,如图13A、图13B、图13C和图13D所示,与对照组相比,使用放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料和X射线处理的老鼠肿瘤没有发生任何转移(图13C和图13D),而对照组老鼠的肿瘤在肝脏和肺部都发现有明显的转移(图13A和图13B),说明放射增敏剂多钨酸钆复合纳米材料对老鼠肿瘤具有明显的抑制作用,并且还可以抑制肿瘤的转移。
以下实例用于说明壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体也可以用于多模式成像。
首先,将不同浓度的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体(0,6.25,12.5,25.0,50mg/mL)溶解在超纯水中,然后将样品置于磁共振成像仪下,用于测定样品的磁共振信号强度(MRI)的检测。同样,为了测定不同浓度条件下的CT的信号强度,不同浓度的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体(0,6.25,12.5,25.0,50mg/mL)溶解在0.5%的琼脂糖水溶液中,然后将样品置于1.5mL离心管中,用于测定样品的CT信号强度。为了对比,相同浓度的商用CT造影剂碘普罗胺(Iopromide)用作对照组实验。最后,将每个样品置于计算机断层扫描仪下进行CT成像。
分别采用磁共振成像仪(Biospec;Bruker;Ettlingen;Germany)和计算机断层扫描仪(MSOT invision 128,iTheramedical,Germany)测定不同浓度的壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体的成像效果,如图14所示,随着浓度的增加,磁共振信号强度和CT信号强度都大大增加,说明壳聚糖修饰的多钨酸钆复合纳米载体也可以用于多模式(MR/CT)成像。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种包含多钨酸钆的纳米材料作为增敏剂的用途,其特征在于,所述纳米材料中的多钨酸钆与谷胱甘肽发生氧化还原反应,降低谷胱甘肽的含量,进而实现内在增敏。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述纳米材料为多钨酸钆纳米材料;
优选地,所述纳米材料为多钨酸钆复合纳米材料;
优选地,所述多钨酸钆复合纳米材料包括多钨酸钆以及修饰多钨酸钆的修饰物;
优选地,所述修饰物包括壳聚糖、脂质体或水溶液中带正电荷的高分子聚合物的任意一种或至少两种的组合,优选为壳聚糖。
3.根据权利要求2所述的用途,其特征在于,所述多钨酸钆复合纳米材料中还包含带负电的物质,所述带负电的物质优选为小干扰RNA,进一步优选为乏氧诱导因子-1α表达的小干扰RNA;
优选地,所述小干扰RNA负载在修饰有壳聚糖的多钨酸钆的表面。
4.根据权利要求2或3所述的用途,其特征在于,所述多钨酸钆复合纳米材料的粒径为30nm~40nm;
优选地,所述多钨酸钆复合纳米材料的水合粒径为40nm~60nm;
优选地,由多钨酸钆和壳聚糖构成的多钨酸钆复合纳米材料的水体系的电势为+30mV~+60mV;
优选地,由多钨酸钆、壳聚糖和小干扰RNA构成的多钨酸钆复合纳米材料的水体系的电势为+10mV~+30mV;
优选地,所述壳聚糖的平均分子量为100KD~300KD,优选为100KD-200KD。
5.根据权利要求2-4任一项所述的用途,其特征在于,所述多钨酸钆复合纳米材料通过以下方法制备得到:
(1)利用离子凝胶法,使多钨酸钆和壳聚糖反应,制备得到壳聚糖修饰的多钨酸钆,即由多钨酸钆和壳聚糖构成的多钨酸钆复合纳米材料。
6.根据权利要求5所述的用途,其特征在于,制备多钨酸钆复合纳米材料的方法中,步骤(1)制备壳聚糖修饰的多钨酸钆的过程为:
(A)将壳聚糖溶解在醋酸中,得到壳聚糖的醋酸溶液;
(B)使用多钨酸钆晶体和水,配制多钨酸钆的水溶液;
(C)将多钨酸钆的水溶液与壳聚糖的醋酸溶液混合,形成悬浮液,除杂,得到壳聚糖修饰的多钨酸钆;
优选地,步骤(A)所述醋酸的质量浓度为0.1%~5%,优选为0.1%~3%;
优选地,步骤(C)所述壳聚糖的醋酸溶液中的壳聚糖与多钨酸钆的水溶液中的多钨酸钆的质量比为5~20,优选为7~15;
优选地,步骤(C)所述混合的过程为:将多钨酸钆的水溶液滴加到壳聚糖的醋酸溶液中;
优选地,步骤(C)所述混合的过程中伴有搅拌;
优选地,步骤(C)所述除杂的过程为:对悬浮液进行离心,然后将离心产物分散到超纯水中,于透析袋中进行透析;
优选地,所述离心的转速为12000rpm,离心的时间优选为30min;
优选地,所述透析袋的分子量为2.0Dka,透析的时间优选为1天。
7.根据权利要求6所述的用途,其特征在于,步骤(B)所述多钨酸钆晶体通过如下方法制备得到:
Ⅰ.将钨酸盐溶于超纯水中形成均匀透明的水溶液A;
Ⅱ.在搅拌的作用下,用酸性化合物调节上述水溶液A的PH值为6.50-8.50,得到溶液B;
Ⅲ.在搅拌作用下,将钆盐水溶液加入上述溶液B中形成水溶液C;
Ⅳ.对上述水溶液C加热,搅拌,直至得到均匀透明的水溶液D;
Ⅴ.最后冷却,待析出多钨酸钆晶体;
优选地,步骤Ⅰ所述钨酸盐为钨酸钠;
优选地,所述钨酸钠的化学组成为Na2WO4·2H2O;
优选地,步骤Ⅰ所述水溶液A中的钨酸盐的浓度为300mg/mL~500mg/mL;
优选地,步骤Ⅱ所述酸性化合物包括盐酸、醋酸和硝酸等,优选为冰醋酸;
优选地,步骤Ⅲ所述钆盐水溶液中的钆盐为氯化钆;
优选地,所述氯化钆的化学组成为GdCl6·6H2O;
优选地,步骤Ⅲ所述钆盐水溶液中的钆盐的浓度为300g/mol~600g/mol;
优选地,步骤Ⅳ所述加热的温度为70℃~90℃。
8.根据权利要求5-7任一项所述的用途,其特征在于,所述方法还包括在步骤(1)得到壳聚糖修饰的多钨酸钆之后,进行如下步骤(2):
利用正负电荷相互作用,将带负电的物质负载在壳聚糖修饰的多钨酸钆的表面,从而得到由多钨酸钆、壳聚糖和带负电的物质构成的多钨酸钆复合纳米材料;
优选地,步骤(2)所述带负电的物质包括小干扰RNA,优选为乏氧诱导因子-1α表达的小干扰RNA;
优选地,步骤(2)所述负载的过程为:配制壳聚糖修饰的多钨酸钆的水溶液,然后与带负电的物质混合,震荡,然后静置;
优选地,所述壳聚糖修饰的多钨酸钆的水溶液中的壳聚糖修饰的多钨酸钆与带负电的物质的质量比为0.1~500;
优选地,所述壳聚糖修饰的多钨酸钆的水溶液中的壳聚糖修饰的多钨酸钆与小干扰RNA的质量比为0.1~500,优选为0.1~300,进一步优选为1~210;
优选地,壳聚糖修饰的多钨酸钆的水溶液与带负电的物质混合的过程在无核酸酶水溶液中进行。
9.根据权利要求5-8任一项所述的用途,其特征在于,所述多钨酸钆复合纳米材料通过以下方法制备得到:
(1)制备多钨酸钆晶体:
Ⅰ.将Na2WO4·2H2O溶于超纯水中形成均匀透明的水溶液A;
Ⅱ.在15℃~35℃磁力搅拌的作用下,用冰醋酸调节上述水溶液A的PH值为6.50-8.50,得到溶液B;
Ⅲ.在15℃~35℃磁力搅拌作用下,将GdCl6·6H2O水溶液加入上述溶液B中形成水溶液C;
Ⅴ.最后冷却,待析出多钨酸钆晶体;
(2)制备壳聚糖修饰的多钨酸钆:
(A)将壳聚糖溶解在冰醋酸中,得到壳聚糖的冰醋酸溶液;
(B)使用步骤(1)得到的多钨酸钆晶体和水,配制多钨酸钆的水溶液;
(C)将多钨酸钆的水溶液与壳聚糖的冰醋酸溶液混合,形成悬浮液,然后将悬浮液在12000rpm的转速下离心30min,再将离心产物置于分子量为2.0Dka的透析袋中透析1天,得到壳聚糖修饰的多钨酸钆;
(3)将小干扰RNA与壳聚糖修饰的多钨酸钆的水溶液在无核酸酶水溶液中混合均匀,震荡,然后在15℃~35℃的温度下静置30min,得到多钨酸钆复合纳米材料。
10.如权利要求1-9任一项所述的用途,其特征在于,所述包含多钨酸钆的纳米材料还用作载体;
优选地,所述包含多钨酸钆的纳米材料用于肿瘤治疗。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710210288.9A CN106975078B (zh) | 2017-03-31 | 2017-03-31 | 一种包含多钨酸钆的纳米材料作为增敏剂的用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710210288.9A CN106975078B (zh) | 2017-03-31 | 2017-03-31 | 一种包含多钨酸钆的纳米材料作为增敏剂的用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106975078A true CN106975078A (zh) | 2017-07-25 |
CN106975078B CN106975078B (zh) | 2020-11-10 |
Family
ID=59343639
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710210288.9A Active CN106975078B (zh) | 2017-03-31 | 2017-03-31 | 一种包含多钨酸钆的纳米材料作为增敏剂的用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106975078B (zh) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110327463A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-10-15 | 西南民族大学 | 一种包含多钨酸钆的纳米材料及其制备方法和用途 |
CN110669937A (zh) * | 2019-11-07 | 2020-01-10 | 华东理工大学 | 一种利用谷胱甘肽提高废弃锂电池中金属生物浸出率的方法 |
CN110960676A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-04-07 | 国家纳米科学中心 | 一种铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇及其制备方法和应用 |
CN113679839A (zh) * | 2021-08-26 | 2021-11-23 | 中国医学科学院生物医学工程研究所 | 一种钨氧化聚合的聚吡咯纳米材料及其制备方法与应用 |
CN113769090A (zh) * | 2021-09-08 | 2021-12-10 | 上海市质子重离子临床技术研发中心 | 一种基于钨基多金属氧簇化合物在制备放射动力学肿瘤治疗药物的应用 |
CN114804207A (zh) * | 2022-04-28 | 2022-07-29 | 淮北师范大学 | 一种用于肿瘤放疗材料的合成方法 |
CN115737932A (zh) * | 2022-11-23 | 2023-03-07 | 国纳之星(上海)纳米科技发展有限公司 | 负载x射线诱导光动力治疗/放疗协同诊疗一体化探针的骨水泥的制备及产品和应用 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030165426A1 (en) * | 2001-06-06 | 2003-09-04 | Michiko Miura | Use of novel metalloporphyrins as imageable tumor-targeting agents for radiation therapy |
CN101031319A (zh) * | 2003-12-11 | 2007-09-05 | 舍林股份公司 | 改善放射性标记药物的功效的放射增敏剂缀合物 |
CN102552936A (zh) * | 2011-12-01 | 2012-07-11 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 一种用于基因靶向传递的siRNA载体复合物及其制备方法 |
CN102657880A (zh) * | 2012-05-08 | 2012-09-12 | 浙江大学 | 一种季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子及其制备方法 |
CN104131033A (zh) * | 2014-05-29 | 2014-11-05 | 上海市普陀区中心医院 | 一种含amiRNA-HIF-1α序列的重组质粒 |
CN104415348A (zh) * | 2013-08-27 | 2015-03-18 | 汪步海 | 一种放疗增敏剂及其制备方法 |
CN104758952A (zh) * | 2015-03-10 | 2015-07-08 | 中国药科大学 | 共递送药物和基因的纳米载体及其制备方法和用途 |
-
2017
- 2017-03-31 CN CN201710210288.9A patent/CN106975078B/zh active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030165426A1 (en) * | 2001-06-06 | 2003-09-04 | Michiko Miura | Use of novel metalloporphyrins as imageable tumor-targeting agents for radiation therapy |
CN101031319A (zh) * | 2003-12-11 | 2007-09-05 | 舍林股份公司 | 改善放射性标记药物的功效的放射增敏剂缀合物 |
CN102552936A (zh) * | 2011-12-01 | 2012-07-11 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 一种用于基因靶向传递的siRNA载体复合物及其制备方法 |
CN102657880A (zh) * | 2012-05-08 | 2012-09-12 | 浙江大学 | 一种季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子及其制备方法 |
CN104415348A (zh) * | 2013-08-27 | 2015-03-18 | 汪步海 | 一种放疗增敏剂及其制备方法 |
CN104131033A (zh) * | 2014-05-29 | 2014-11-05 | 上海市普陀区中心医院 | 一种含amiRNA-HIF-1α序列的重组质粒 |
CN104758952A (zh) * | 2015-03-10 | 2015-07-08 | 中国药科大学 | 共递送药物和基因的纳米载体及其制备方法和用途 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
DEEPTHY MENON ET AL: ""A novel chitosan/polyoxometalate nano-complex for anti-cancer applications"", 《CARBOHYDRATE POLYMERS》 * |
YUAN YONG ET AL: ""Gadolinium polytungstate nanoclusters: a new theranostic with ultrasmall size and versatile properties for dual-modal MR/CT imaging and photothermal therapy/radiotherapy of cancer"", 《NPG ASIA MATERIALS》 * |
朱婉萍: "《甲壳素及其衍生物的研究与应用》", 30 November 2014, 浙江大学出版社 * |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110327463A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-10-15 | 西南民族大学 | 一种包含多钨酸钆的纳米材料及其制备方法和用途 |
CN110327463B (zh) * | 2019-06-10 | 2021-11-16 | 西南民族大学 | 一种包含多钨酸钆的纳米材料及其制备方法 |
CN110669937A (zh) * | 2019-11-07 | 2020-01-10 | 华东理工大学 | 一种利用谷胱甘肽提高废弃锂电池中金属生物浸出率的方法 |
CN110960676A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-04-07 | 国家纳米科学中心 | 一种铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇及其制备方法和应用 |
CN110960676B (zh) * | 2019-12-27 | 2022-03-08 | 国家纳米科学中心 | 一种铁取代的二聚硒钨酸纳米团簇及其制备方法和应用 |
CN113679839A (zh) * | 2021-08-26 | 2021-11-23 | 中国医学科学院生物医学工程研究所 | 一种钨氧化聚合的聚吡咯纳米材料及其制备方法与应用 |
CN113769090A (zh) * | 2021-09-08 | 2021-12-10 | 上海市质子重离子临床技术研发中心 | 一种基于钨基多金属氧簇化合物在制备放射动力学肿瘤治疗药物的应用 |
CN114804207A (zh) * | 2022-04-28 | 2022-07-29 | 淮北师范大学 | 一种用于肿瘤放疗材料的合成方法 |
CN114804207B (zh) * | 2022-04-28 | 2023-04-25 | 淮北师范大学 | 一种用于肿瘤放疗材料的合成方法 |
CN115737932A (zh) * | 2022-11-23 | 2023-03-07 | 国纳之星(上海)纳米科技发展有限公司 | 负载x射线诱导光动力治疗/放疗协同诊疗一体化探针的骨水泥的制备及产品和应用 |
CN115737932B (zh) * | 2022-11-23 | 2024-04-26 | 国纳之星(上海)纳米科技发展有限公司 | 负载x射线诱导光动力治疗/放疗协同诊疗一体化探针的骨水泥的制备及产品和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN106975078B (zh) | 2020-11-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106975078A (zh) | 一种包含多钨酸钆的纳米材料作为增敏剂的用途 | |
Gulzar et al. | Upconversion processes: versatile biological applications and biosafety | |
Ding et al. | A multimodal Metal-Organic framework based on unsaturated metal site for enhancing antitumor cytotoxicity through Chemo-Photodynamic therapy | |
Yang et al. | Rod-shape MSN@ MoS2 nanoplatform for FL/MSOT/CT imaging-guided photothermal and photodynamic therapy | |
Wang et al. | A triple-synergistic strategy for combinational photo/radiotherapy and multi-modality imaging based on hyaluronic acid-hybridized polyaniline-coated WS 2 nanodots | |
CN108354901A (zh) | 用于肿瘤化疗与光热联合治疗的pH/还原双重敏感多功能纳米胶束及其应用 | |
Yuan et al. | On-demand manipulation of tumorigenic microenvironments by nano-modulator for synergistic tumor therapy | |
Zhou et al. | Oxygenated theranostic nanoplatforms with intracellular agglomeration behavior for improving the treatment efficacy of hypoxic tumors | |
CN105012272B (zh) | 一种可用于治疗骨转移癌的氧化还原敏感骨靶向胶束 | |
CN114377149B (zh) | 一种Mn基可降解MOF纳米反应器及其制备方法和应用 | |
CN106177955A (zh) | Bcl‑xL抑制剂和溶瘤病毒在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
CN108559091A (zh) | 具有聚集诱导发光及双重敏感性的聚合物药物载体、载药胶束及其制备方法 | |
CN107913289A (zh) | 水溶性富勒烯结构在制备***的药物中的应用 | |
CN107737348A (zh) | 一种肺癌靶向自组装纳米粒的制备方法 | |
CN107982217B (zh) | 一种包载疏水性药物的具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物、其制备方法及其应用 | |
CN113599518A (zh) | 一种复合声敏剂及其制备方法 | |
CN108853515A (zh) | 短肽水凝胶的制备方法及应用、药物组合物 | |
Bai et al. | CXCR4 and CD44 dual-targeted Prussian blue nanosystem with daunorubicin loaded for acute myeloid leukemia therapy | |
CN108653747A (zh) | 一种基因与疏水药物共输送的可降解纳米载体及其制法和应用 | |
CN104984341B (zh) | 一种近红外激光触发的复合纳米制剂的制备方法 | |
Wu et al. | A transformable gold nanocluster aggregate-based synergistic strategy for potentiated radiation/gene cancer therapy | |
Zhang et al. | An oxygen-economical nano-photosensitizer with a high photodynamic therapeutic outcome via simultaneous reduction of the cellular respiration and oxygen depletion of PDT | |
CN112741903B (zh) | 一种dna/纳米复合物及其制备方法与应用 | |
Ge et al. | Precise manipulation of circadian clock using MnO2 nanocapsules to amplify photodynamic therapy for osteosarcoma | |
CN113456614A (zh) | 一种基于plga的粒径可变型抗肿瘤仿生纳米制剂及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |