CN110951748B

CN110951748B - 水稻抗褐飞虱基因Bph37、蛋白、载体、宿主细胞、分子标记、方法及应用

Info

Publication number: CN110951748B
Application number: CN201911291214.8A
Authority: CN
Inventors: 何光存; 周聪; 杜波; 陈荣智; 祝莉莉
Original assignee: Yuan Longping High Tech Agriculture Co ltd; Wuhan University WHU
Current assignee: YUAN LONGPING HIGH-TECH AGRICULTURE Co.,Ltd.; Wuhan University WHU
Priority date: 2019-12-16
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2039-12-16
Also published as: CN110951748A; WO2021121209A1

Abstract

本发明公开了一种水稻抗褐飞虱基因Bph37、蛋白、载体、宿主细胞、分子标记、方法及应用。所述水稻抗褐飞虱基因Bph37的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其cDNA序列如SEQ ID No.2所示。利用分子标记156‑35可筛选含有水稻抗褐飞虱基因Bph37的水稻。通过遗传转化，将Bph37基因转入普通水稻品种，能够提高水稻对褐飞虱的抗性，从而减轻褐飞虱产生的危害，达到增产和稳产的目的。

Description

水稻抗褐飞虱基因Bph37、蛋白、载体、宿主细胞、分子标记、方法及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种水稻抗褐飞虱基因Bph37、蛋白、载体、宿主细胞、分子标记、方法及应用。

背景技术

水稻是一种重要的粮食作物，世界上有超过一半的人以其为主食。由于水稻基因组精细遗传图和物理图谱已完成，其转基因技术相对容易，并且与其它禾本科作物基因组具有共线性，因而被视做模式植物。随着包括水稻在内的多种生物基因组测序的完成，人类开始进入后基因组时代。全面开展功能基因组研究已成为生命科学的前沿领域。因此水稻功能基因的研究对社会经济发展和生物学研究具有重大意义。

粮食安全问题，是全世界人民面临的挑战。50、60年代的矮化育种和70年代的杂交水稻培育两次科技革命使水稻产量大幅度提高。矮化高产水稻的推广导致飞虱为害开始严重起来。尤其是进入21世纪整个亚洲水稻产区飞虱爆发的频率和规模有逐渐扩大的趋势,目前已经成为了水稻生产上最大的威胁。我国每年褐飞虱发生面积3.87亿亩次，尽管全力防治，仍损失稻谷120万吨，人民币35.8亿元，约占水稻病虫害总损失的30％，是水稻生产中的头号害虫。

目前，褐飞虱已经成为我国水稻生产中的第一大虫害，对我国当前粮食安全已形成严重威胁。长期以来，褐飞虱的防治主要是依靠施用化学杀虫剂。由于褐飞虱爆发多发生在水稻成熟灌浆期，此时稻株长势旺盛，将杀虫剂施到稻株基部的操作非常困难。事实上由于化学杀虫剂的连年大量施用，褐飞虱抗药性成倍增加，使药剂防治的效果有限。同时使用化学杀虫剂防治褐飞虱，一方面增加了农民的生产成本，另一方面化学杀虫剂还造成对非目标生物的毒杀、对环境和粮食污染等环境和生态问题。

利用抗褐飞虱基因培育抗虫水稻品种是褐飞虱综合防治中最为经济有效的方法。国际水稻研究所(IRRI)的研究结果和东南亚的水稻生产实践证明，即使是只有中等抗性水平的水稻品种，也足以将褐飞虱的群体控制在造成危害的水平以下，不至于对水稻造成实际的危害和产量损失。因此，挖掘水稻抗褐飞虱基因并在水稻育种项目中应用是防治水稻褐飞虱的根本措施。

水稻抗褐飞虱基因的研究始于上世纪70年代初。至今已经在普通栽培稻和野生稻资源中鉴定和定位了三十多个水稻抗褐飞虱的主效抗虫基因(具体见Hu等，2018.Identification and fine mapping of Bph33,a new brown planthopperresistance gene in rice(Oryza sativa L.).Rice 2018,11:55)。8个基因(Bph14,Bph26,Bph3,Bph29,Bph9,Bph18,Bph32和Bph6)已经被克隆，这些基因都是利用图位克隆法得到(Du et al.,2009；Tamura et al.2014；Liu et al.2014；Wang et al.2015b；Zhao etal.2016；Ji et al.2016；Ren et al.2016；Guo et al.2018)。

全基因组关联分析(Genome-wide association study，GWAS)最早应用于人类疾病的遗传分析。近年来，随着基因组技术的快速发展，特别是测序技术手段的提高，许多动植物的全基因组测序已经完成，GWAS成为研究作物复杂性状的有力工具。与传统的图位克隆发掘基因相比,关联分析法具有无需构建专门的作图群体、节省时间，可实现精细定位等优点。同时，GWAS突破了图位克隆法一般适合于较小基因组物种的局限，只需全基因组SNPs标记和表型性状即可。近几年，GWAS分析方法也得到较快的发展。我国科学家和国际同行的研究结果表明，GWAS方法在作物形态性状、生理性状和产量相关性状等方面均发掘到目的基因。例如，控制水稻抽穗天数的基因LOC_Os01g62780、控制水稻株高和穗长基因LOC_Os11g08410以及分蘖数基因NAL1(Yano等2016，Genome-wide association study usingwhole-genome sequencing rapidly identifies new genes influencing agronomictraits in rice.Nature Genetics,48:927-934)，控制水稻粒型基因OsSPL13(Si等2016，OsSPL13 controls grain size in cultivated rice.Nature Genetics,48:447-456)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻抗褐飞虱基因Bph37、蛋白、载体、分子标记、方法及应用。本发明利用GWAS的方法，鉴定到水稻抗褐飞虱基因Bph37。通过遗传转化Bph37基因，使感性水稻出现抗褐飞虱的表型，证实了该基因的功能。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种水稻抗褐飞虱基因Bph37，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因全长1279bp，具有1个内含子和2个外显子，其CDS分别为区段1-116bp和523-1279bp，cDNA全长873bp。

作为优选方案，所述基因的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，编码291个氨基酸。

第二方面，本发明提供一种如上述水稻抗褐飞虱基因Bph37编码的蛋白，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

应当理解，在不影响BPH37蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员可对SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。

此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的多核苷酸序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的多核苷酸序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码具有形同功能蛋白的核苷酸序列。

本发明提供的上述多核苷酸片段其与一个同源或异源启动子序列可操纵地连接。

第三方面，本发明提供一种含有上述水稻抗褐飞虱基因Bph37的载体。所述载体包括含有所述多核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体。

本发明方案还包括基于所述多核苷酸的正义序列或反义序列，包括含有所述多核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其片段的转化的植物细胞和转基因植物。

第四方面，本发明提供一种含有上述水稻抗褐飞虱基因Bph37的宿主细胞，其特征在：所述宿主细胞为含有所述核苷酸序列或其片段转化的植物细胞。

第五方面，本发明提供一种含有如上述含有水稻抗褐飞虱基因Bph37的核苷酸序列或其片段转化的转基因植物。

第六方面，本发明提供一种如上述水稻抗褐飞虱基因Bph37的分子标记，其特征在于：所述分子标记为156-35，用于扩增分子标记156-35的引物对如下：

正向引物156-35F：TTGCTCATGGGTGTGCAGAAG，其序列如SEQ ID NO.4所示；

反向引物156-35R：TTGGGGGTGTCAAAGCCTAC，其序列如SEQ ID NO.5所示。

第七方面，本发明提供一种如上述水稻抗褐飞虱基因Bph37的分子检测方法，其特征在于：通过上述引物对扩增待检水稻基因组DNA，并检测扩增产物：若利用引物156-35F和156-35R扩增出825bp的扩增片段，则标志着水稻抗褐飞虱基因Bph37的存在。

第八方面，本发明提供一种筛选抗褐飞虱水稻的方法，其特征在于：通过上述引物对扩增待检水稻基因组DNA，并检测扩增产物：若利用引物156-35F和156-35R扩增出825bp的扩增片段，则标志着水稻品种褐飞虱抗性的存在。

第九方面，本发明提供一种如上述水稻抗褐飞虱基因Bph37的分子标记在选育抗褐飞虱水稻中的应用。

同时，本发明的方案中还涵盖培育具有褐飞虱抗性的植物的方法，包括如下步骤：

1)用多核苷酸转化植物细胞；所述多核苷酸含有水稻抗褐飞虱Bph37基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；

2)将被转化的植物细胞再生为植物；

3)培养再生的植物并使上述多核苷酸得到表达。

本发明的方案中还涵盖产生具有褐飞虱抗性的植物的方法，所述方法包括将具有褐飞虱抗性基因Bph37的植物与其他植物杂交产生具有褐飞虱抗性的子代植物。其中所述植物是单子叶植物；优选地，所述植物是水稻。

本领域技术人员应能理解，根据本发明公开的序列来设计或产生分子标记可用于抗褐飞虱水稻的选育工作。

本发明通过如下步骤克隆得到Bph37基因：

(1)收集水稻自然群体。来自全球74个国家、12种类型的1520份水稻品种，作为水稻抗褐飞虱基因定位群体。

(2)抗褐飞虱鉴定。褐飞虱体重增加率鉴定定位群体的抗褐飞虱性能。每份材料大约8粒种子，播种在一个塑料杯(10×15cm)中。5叶期时，将一头刚羽化雌虫用万分之一电子天平称取初始体重，然后放入封口膜制作的蜡袋(2×2cm)中，并固定在叶鞘上，48h后称取褐飞虱体重，计算增重率，每份材料重复12次实验。去除体重增加率极值后的平均值作为每份水稻品种对褐飞虱的抗性值。

(3)水稻抗褐飞虱基因定位。应用EMMAX软件的混合线性模型，检测到第6号染色体0.81-1.57M存在显著关联位点。

(4)候选基因确定。根据日本晴参考基因组在0.81-1.57Mb区间内候选基因的基因功能注释，选定NBS-LRR基因，即LOC_Os06g03500作为候选基因。

(5)抗褐飞虱材料选择。根据关联区域的peak SNP，将1520份材料分成单倍型A和单倍型B。单倍型B的材料对褐飞虱抗性显著高于单倍型A的材料。选择单倍型B中的SE382作为扩增LOC_Os06g03500的材料。

(6)全长cDNA克隆。根据预测的cDNA序列设计引物，从抗褐飞虱水稻SE382的cDNA中扩得310bp片段，以该段序列设计引物，通过RACE(cDNA末端快速扩增技术)得到了cDNA的3’端和5’端序列，最终获得Bph37的全长cDNA。

然而，本领域技术人员应当理解，根据本发明公开的Bph37的核苷酸序列，通过设计恰当的PCR引物，即可从抗褐飞虱水稻基因组中扩增得到Bph37基因。

(7)遗传转化Bph37基因验证其功能。根据Bph37基因的ORF序列，用PCR的方法扩增出含有Bph37基因的ORF的873bp的片段经加A后连入经XcmI酶切的pCXUN载体内。测序验证无误后，所得载体即为Bph37基因遗传转化载体，将其转入农杆菌EHA105中。

采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将过表达载体导入正常粳稻品种Nipponbare中，最后获得Bph37阳性植株20株。先用T1代的植株进行了抗虫鉴定。苗期采用苗期集团法鉴定，对照水稻Nipponbare全部死亡，转基因阳性植株存活，抗虫级别为1-5级。证实Bph37基因具有抗褐飞虱的功能。因此，水稻抗褐飞虱基因Bph37可以在水稻中应用也可以在水稻种子中应用，培育具有抗褐飞虱性能的水稻品种。

本发明的优点和效果：

(1)本发明利用GWAS成功克隆了水稻抗褐飞虱基因Bph37。

(2)本发明克隆的Bph37基因具有明显的抗褐飞虱性能，这对全面理解水稻抗褐飞虱基因类型的多样性有重要意义。

(3)Bph37使水稻抗褐飞虱性能提高，通过遗传转化或杂交将Bph37应用于水稻育种中，可以改善水稻品种的抗褐飞虱性，从而减轻褐飞虱的为害，达到增产和稳产的目的。

(4)刺吸式昆虫是农业生产中的一大类虫害，Bph37基因克隆和抗褐飞虱功能证实，对于其他植物的抗刺吸式昆虫研究具有重要参考作用。

附图说明

图1为1520份水稻品种地理分布。

图中：图示为1520份水稻品种在世界范围74个国家的分布；饼图的大小正比于来自这个国家的水稻品种的个数；每个饼图中，不同颜色扇形的面积正比于不同类型的水稻品种个数。

图2为1520份水稻品种抗褐飞虱鉴定结果。

图中：图示为褐飞虱取食1520水稻品种48h的体重增加率直方图；图中横坐标WGR表示褐飞虱体重增加率，纵坐标表示水稻品种个数；虫源为褐飞虱生物型I。

图3为GWAS结果。

图中：图示为全基因组关联分析的曼哈顿图；每个点代表一个SNP标记与褐飞虱抗性的关联程度，p值越小(-log10(p)越大)，与褐飞虱抗性关联程度越高；-log₁₀(p)超过阈值 8的位点认为是显著关联位点；第6号染色体0.8-1.57Mb是全基因组关联程度最高的区域，- log₁₀(p)远超过阈值8；所用模型为EMMAX软件的混合线性模型。

图4为单倍型A和B对褐飞虱抗性结果。

图中：根据peakSNP的不同形式，1520份水稻材料分为两种单倍型，单倍型A的褐飞虱增重率(WGR)显著高于单倍型B，即单倍型B更抗褐飞虱。

图5为转基因水稻抗褐飞虱的鉴定结果。

图中：转基因植株放虫后7天的结果；TN1为台中本地1号，对褐飞虱呈感性，156-13 为Bph37转基因阴性植株，156-17、156-15、156-32为Bph37转基因阳性植株。Bph37基因的转基因阳性株系均对褐飞虱有明显抗性。

图6为根据Bph37基因组序列开发的功能性分子标记156-35示例，其扩增片段长度为825bp。

图中：SE382为携带水稻抗褐飞虱基因Bph37的抗虫亲本，扬稻6号(93-11)为感虫水稻，F2-1至F2-11为SE382与扬稻6号杂交构建的F₂群体中的感虫水稻，F2-12至F2-22为 SE382与扬稻6号杂交构建的F₂群体中的抗虫水稻。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步地详细阐述。

实施例1 Bph37基因的克隆及分子标记开发

1.GWAS

从中国农业科学院作物科学研究所取得1520份水稻品种，涵盖12种类型，位于世界范围的74个国家(图1)。对1520个水稻品种进行了褐飞虱抗性测定，测定的方法是测定褐飞虱雌成虫取食前和取食后的体重。每个试验水稻品种的8颗种子被播种并生长在一个塑料杯(9×15厘米)中。对五叶期水稻植株进行了抗性试验。收集刚羽化的褐飞虱生物型I雌性成虫，用电子天平称重(岛津；类型:AUW120D)。选择初始体重为1.80～2.70mg的褐飞虱进行实验。每一只褐飞虱被放入一个2×2厘米、封口膜制作的薄膜袋中，然后被固定在离土壤1厘米的水稻植株上。褐飞虱取食叶鞘48小时，然后再次测量体重以获得48小时的体重，进而获得褐飞虱的体重增加率(WGR)。对每个水稻品种，用12只褐飞虱的体重增加率来指示抗性水平。1520份水稻品种对褐飞虱的抗性水平呈现左偏态分布(图2)，即感虫品种远多于抗虫品种。3K水稻基因组数据已经公布(Li,Z.等,2014The 3,000rice genomesproject.GigaScience 3,7)。用plink软件提取出次要等位基因频率大于0.01、缺失率小于0.2的全基因组SNPs数据。由于种群结构比较明显，所以采用前7个主成分(Q)作为固定效应，每个个体间的balding-Nichols亲缘矩阵(K)作为随机效应进行种群结构修正。利用EMMAX软件中的混合线性模型进行GWAS分析。用公式P＝0.05/N(N为SNPs数目)评价全基因组显著性阈值。显著性p值阈值约为1.0×10^-8。

2.确定候选基因

第6号染色体0.8-1.57Mb存在一个显著关联SNPs簇(图3)，说明该区域含有水稻抗褐飞虱基因，作为候选区域。根据日本晴参考基因组基因功能注释信息(http://rice.plantbiology.msu.edu/)，候选区域内的NBS-LRR基因，LOC_Os06g03500作为候选基因。根据关联区域的peak SNP，将1520份材料分成单倍型A和单倍型B。单倍型B的材料对褐飞虱抗性显著高于单倍型A的材料。选择单倍型B中的SE382作为扩增LOC_Os06g03500的材料。

3.RACE获得Bph37全长cDNA

以抗褐飞虱亲本SE382叶鞘总RNA反转录产物为模板，根据基因预测结果设计引物，扩增出候选基因的一段cDNA序列。通过该序列设计引物，使用TaKaRa公司5’与3’FullRACE试剂盒，获得了该候选基因5’末端及3’末端序列，确定了候选基因的转录起始位点及终止位点，并拼接出该基因的全长cDNA序列。根据全长cDNA序列重新合成引物，扩增获得Bph37的全长cDNA，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

4.水稻抗褐飞虱基因Bph37分子标记

相比感性材料，Bph37内含子区域存在474bp缺失。在抗性亲本中，标记156-35扩增片段长度为825bp；在感性亲本中，标记156-35扩增片段长度为1299bp。因此，分子标记即是用：

156-35标记引物：

正向引物序列TTGCTCATGGGTGTGCAGAAG，如SEQ ID NO.4所示；

反向引物序列TTGGGGGTGTCAAAGCCTAC，如SEQ ID NO.5所示；

扩增水稻抗褐飞虱品种或者育种材料DNA，如果用引物156-35能够扩增出825bp的扩增片段，标志着水稻抗褐飞虱基因Bph37的存在。因此，利用本发明提供的上述分子标记方法来鉴定Bph37抗性基因的存在具有非常高的效率，可以预测水稻植株的褐飞虱抗性，加快抗褐飞虱水稻品种育种进程。

实施例2 Bph37基因的功能验证和应用

1.遗传转化载体的构建

Bph37基因过表达载体的构建。所用载体为pCXUN(由美国Ohio State University的王国梁教授提供)，采用XcmI酶切pCXUN载体，将外源片段加A后可以直接连入。

根据RACE的结果，采用PCR的方法直接扩增ORF，经加A后连入载体。测序验证无误后，所得载体即为Bph37基因过表达载体，将其转入农杆菌EHA105中。挑取单克隆扩大培养，进行PCR验证无误后，加等体积的50％甘油混匀，-70℃保存备用。

2.遗传转化

采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei等，1994，Efficienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA.PlantJournal 6:271-282)将上述Bph37基因过表达载体导入褐飞虱感性的普通水稻品种Nipponbare。

3.Bph37基因转基因功能验证

Bph37基因过表达转化载体获得阳性转基因植株20株。收获种子后，用T₁代Bph37转基因植株，采用苗期集团法进行了抗虫鉴定。如图6所示，对转基因阴性株系156-13和转基因阳性株系156-17、156-15和156-32进行了抗褐飞虱鉴定。鉴定结果如图6所示，接入褐飞虱7天后，感虫对照品种TN1整株全部死亡,转基因阴性植株枯萎，转基因阳性植株生长健康，无叶片受害，抗虫级别为2-4级，证实Bph37基因具有抗褐飞虱的功能。因此，水稻抗褐飞虱基因Bph37可以在水稻中应用也可以在水稻种子中应用，培育具有抗褐飞虱性能的水稻品种。

实施例3分子标记的验证

1、材料和方法

1.1材料：抗褐飞虱亲本SE382(含水稻抗褐飞虱基因Bph37)、褐飞虱感性水稻品种扬稻6号(93-11)及SE382与扬稻6号杂交构建的F₂株系。

分子标记引物：156-35，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.4-5所示。

1.2方法

CTAB抽提法提取水稻样品基因组DNA。用引物156-35扩增样品DNA。10μl体系。10μl反应体系包括：2×Es Taq MasterMix(Dye)，5.0μl；ddH₂O，3.7μl；10μM引物，0.4μl；和50ngDNA模板。扩增反应在BioerPCR仪上进行：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，30个循环；72℃5min。156-35的扩增产物用1％的琼脂糖胶分离，电泳后可以直接分析。

2、结果：用上述方法，分别对水稻品种SE382、扬稻6号、SE382与扬稻6号杂交构建的22份F₂株系进行扩增。结果表明，利用156-35分子标记引物能扩增出相应的825bp片段的株系对褐飞虱均表现出抗虫性。而不能扩出上述特异性片段的株系对褐飞虱均表现出感虫性(图6)。

由此说明，本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有水稻抗褐飞虱基因Bph37，从而大大提高育种效率。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 水稻抗褐飞虱基因Bph37、蛋白、载体、宿主细胞、分子标记、方法及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1279

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

atggcggaga cggtgctgag catggcgagg tccatgctgg ggagcgccat cagcgcggcg 60

gcggcggccg ccggcgaaga gatgagcttg ctcatgggtg tgcagaagga gatatggtgc 120

gtgcgtgtgt ctacccactc cccaattaat ttgtactagt ttcttctact tccttctgtt 180

taattacgct tcgtttagtt ccaaaataat ttttcaaact tccaactttt tcatcccatc 240

aaaattttca tacacacaca aactttcaat ttttccgtca catcgtttca atttcaatca 300

aacttacaat tttggtatga actaaacaca gccttagcag gagaggtagc taggacctag 360

ctaggcatgt agaggtagaa aagtacgccg agtcacaata cccttaataa ttcttctaat 420

ctgaattagt aaaataagaa tttagacttc cagagcaaaa tcagttattc catatgctca 480

agagtgctaa attttgtttt acctctgttt tttttttggc aggttcatga atgatgagct 540

aaaaacaatg caagcgttcc taatagctgc tgaaacattg aagaagaagg acctgctgct 600

gaaggtgtgg gctgagcaag taaggagctt gtcctacgac attgaagatt gtcttgaaga 660

gttcatggtc catgtgagaa accaaagcct cttgcagcaa ctgatgaatc tcaaagatcg 720

ccaccgaatt gctgtcaaga ttcgcaacct caaatcaaga cttgaagaag tgagcagcag 780

aaacacacgt tacaactcga tcaagatgga ggcgaacaac accttcgatg agatcgagtc 840

catggaggat gttcggaatc attctcgtag caacatcgac gaagcaaagc ttgtaggctt 900

tgacaccccc aaaaaggagt tacttgacaa gataaacatg gatgccaatg atgatgacca 960

ctgtcgggtg ctttgtgtgg ttggcatggg aggattgggt aagactactc tggtaaggaa 1020

gatctttgaa agtaaggaag acatcataaa taattttcca catcgtgctt ggatcgttgt 1080

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<210> 2

<211> 873

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

atggcggaga cggtgctgag catggcgagg tccatgctgg ggagcgccat cagcgcggcg 60

gcggcggccg ccggcgaaga gatgagcttg ctcatgggtg tgcagaagga gatatggttc 120

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aaggacctgc tgctgaaggt gtgggctgag caagtaagga gcttgtccta cgacattgaa 240

gattgtcttg aagagttcat ggtccatgtg agaaaccaaa gcctcttgca gcaactgatg 300

aatctcaaag atcgccaccg aattgctgtc aagattcgca acctcaaatc aagacttgaa 360

gaagtgagca gcagaaacac acgttacaac tcgatcaaga tggaggcgaa caacaccttc 420

gatgagatcg agtccatgga ggatgttcgg aatcattctc gtagcaacat cgacgaagca 480

aagcttgtag gctttgacac ccccaaaaag gagttacttg acaagataaa catggatgcc 540

aatgatgatg accactgtcg ggtgctttgt gtggttggca tgggaggatt gggtaagact 600

actctggtaa ggaagatctt tgaaagtaag gaagacatca taaataattt tccacatcgt 660

gcttggatcg ttgtgtcaca gtcattttcg atgatagaga tgctcaaaga tatgattagc 720

caacttctag gtcatgaatc attgaaaaga tttgaaggga agccgatccg agcacacgac 780

cttggtacgc acctacgaga tggactgaaa gaattgaggt actttgttgt ttttgatgac 840

tttgtggaac acagatcact gggaatggat tag 873

<210> 3

<211> 290

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

Met Ala Glu Thr Val Leu Ser Met Ala Arg Ser Met Leu Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ile Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Glu Glu Met Ser Leu Leu Met

20 25 30

Gly Val Gln Lys Glu Ile Trp Phe Met Asn Asp Glu Leu Lys Thr Met

35 40 45

Gln Ala Phe Leu Ile Ala Ala Glu Thr Leu Lys Lys Lys Asp Leu Leu

50 55 60

Leu Lys Val Trp Ala Glu Gln Val Arg Ser Leu Ser Tyr Asp Ile Glu

65 70 75 80

Asp Cys Leu Glu Glu Phe Met Val His Val Arg Asn Gln Ser Leu Leu

85 90 95

Gln Gln Leu Met Asn Leu Lys Asp Arg His Arg Ile Ala Val Lys Ile

100 105 110

Arg Asn Leu Lys Ser Arg Leu Glu Glu Val Ser Ser Arg Asn Thr Arg

115 120 125

Tyr Asn Ser Ile Lys Met Glu Ala Asn Asn Thr Phe Asp Glu Ile Glu

130 135 140

Ser Met Glu Asp Val Arg Asn His Ser Arg Ser Asn Ile Asp Glu Ala

145 150 155 160

Lys Leu Val Gly Phe Asp Thr Pro Lys Lys Glu Leu Leu Asp Lys Ile

165 170 175

Asn Met Asp Ala Asn Asp Asp Asp His Cys Arg Val Leu Cys Val Val

180 185 190

Gly Met Gly Gly Leu Gly Lys Thr Thr Leu Val Arg Lys Ile Phe Glu

195 200 205

Ser Lys Glu Asp Ile Ile Asn Asn Phe Pro His Arg Ala Trp Ile Val

210 215 220

Val Ser Gln Ser Phe Ser Met Ile Glu Met Leu Lys Asp Met Ile Ser

225 230 235 240

Gln Leu Leu Gly His Glu Ser Leu Lys Arg Phe Glu Gly Lys Pro Ile

245 250 255

Arg Ala His Asp Leu Gly Thr His Leu Arg Asp Gly Leu Lys Glu Leu

260 265 270

Arg Tyr Phe Val Val Phe Asp Asp Phe Val Glu His Arg Ser Leu Gly

275 280 285

Met Asp

290

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

ttgctcatgg gtgtgcagaa g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

ttgggggtgt caaagcctac 20

Claims

1.一种水稻抗褐飞虱基因Bph37，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述基因的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种如权利要求1所述水稻抗褐飞虱基因Bph37编码的蛋白，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种含有权利要求1所述水稻抗褐飞虱基因Bph37的载体，其特征在于：所述载体包括含有所述多核苷酸序列的克隆载体或表达载体。

4.一种检测如权利要求1所述的水稻抗褐飞虱基因Bph37的分子标记的引物，其特征在于：用于扩增分子标记的引物对如下：

正向引物156-35F，其序列如SEQ ID NO.4所示；

反向引物156-35R，其序列如SEQ ID NO.5所示。

5.一种如权利要求1所述水稻抗褐飞虱基因Bph37的分子检测方法，其特征在于：通过权利要求4中所述引物对扩增待检水稻基因组DNA，并检测扩增产物：若利用引物156-35F和156-35R扩增出825bp的扩增片段，则标志着水稻抗褐飞虱基因Bph37的存在。

6.一种筛选抗褐飞虱水稻的方法，其特征在于：通过权利要求4中所述引物对扩增待检水稻基因组DNA，并检测扩增产物：若利用引物156-35F和156-35R扩增出825bp的扩增片段，则标志着水稻品种褐飞虱抗性的存在。

7.一种如权利要求4中所述水稻抗褐飞虱基因Bph37的分子标记在选育抗褐飞虱水稻中的应用。