CN109762929B - 一种水稻抗褐飞虱基因Bph9的功能分子标记、鉴定方法及应用 - Google Patents
一种水稻抗褐飞虱基因Bph9的功能分子标记、鉴定方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及水稻抗性育种和分子遗传学技术领域，具体公开了一种水稻抗褐飞虱基因Bph9的功能分子标记、鉴定方法及应用。所述分子标记为Bph9‑M，其核苷酸序列如序列表SIPOSequenceListing 1.0所示；所述的Bph9‑M引物为：正向引物TCATTAGGAACAGGCTATGCA，反向引物TTCTTGTTGACACCGCTCAC。该分子标记Bph9‑M在水稻抗褐飞虱选育中的应用，包括以下步骤：提取水稻基因组DNA；PCR扩增检测进行基因型鉴定；抗褐飞虱表型鉴定。该分子标记可以有效区分Bph9与其它等位基因Bph1、Bph2、Bph7、Bph10、Bph18、Bph21等，是目前针对Bph9基因设计的PCR类型的基因内功能分子标记，可简便、快速、高通量地进行水稻育种实践。
Description
技术领域
本发明属于水稻抗性育种和分子遗传学领域，具体涉及一种水稻抗褐飞虱基因Bph9的功能分子标记、鉴定方法及应用。
背景技术
褐飞虱是危害水稻产量最为严重的虫害之一。此外褐飞虱取食同时传播水稻病害，如草状丛矮病、齿叶矮缩病等，间接加重了对水稻的危害。目前对褐飞虱的防治主要以化学农药为主，杀虫剂的广泛使用一定程度上缓解了褐飞虱的危害，但过量的杀虫剂的使用造成了环境污染、农药残留、生态平衡的破坏以及耐药性等一系列的问题。诸多实践表明，利用水稻自身抗性培育具有褐飞虱抗性的水稻品种是防治褐飞虱是最高效、对环境最友好的防控方法之一。
国际水稻所自1973年以来，利用常规育种手段，先后培育出一系列带有Bph1、Bph2和Bph3等带有抗褐飞虱基因的水稻品种，但随着褐飞虱新生物型的产生，这些品种的抗性逐渐丧失，因此利用新的抗褐飞虱基因或聚合多个抗性基因，成为了下一步抗褐飞虱育种的主要方向。水稻对褐飞虱抗性表型鉴定较为复杂繁琐，利用抗性基因的分子标记进行辅助选择可以加快育种进程，提高育种效率。
目前已有多个抗飞虱基因被克隆，其中Bph9是来自抗性亲本Pokkali中的一个水稻抗褐飞虱基因，对于褐飞虱生态型I、II、III都表现出良好的抗性。但目前在育种中Bph9使用的均为连锁标记，而基因内功能标记未见报道。并且水稻在该基因位点上存在多个等位基因Bph1、Bph2、Bph7、Bph10、Bph18、Bph21等，连锁标记难以区分这些基因。这些都影响了分子标记辅助育种的选择效率和准确度，限制了Bph9基因在水稻抗褐飞虱育种过程中的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术中采用连锁标记难以准确区分出水稻抗褐飞虱基因，影响了分子标记辅助育种的选择效率和准确度，限制了Bph9基因在水稻抗褐飞虱育种过程中的应用等缺陷与不足，提供一种水稻抗褐飞虱基因Bph9的功能分子标记、鉴定方法及应用。该功能分子标记可以有效区分Bph9与其它等位基因Bph1、Bph2、Bph7、Bph10、Bph18、Bph21等，是目前唯一针对Bph9基因设计的PCR类型的基因内功能分子标记，可简便、快速、高通量地进行水稻育种实践。
本发明采用如下技术方案，来实现发明目的。
首先，本发明提供一种水稻抗褐飞虱基因Bph9的功能分子标记，所述分子标记为Bph9-M，所述Bph9-M的核苷酸序列如序列表SIPOSequenceListing 1.0所示。Bph9-M核苷酸序列包括1950个核苷酸，具体为：
GTATTTAAGGAGTCAGTAAATTTGGATCAACAAGATCTTGAATTGATCAAAGAAGCGAAACCGATTCTAAAGAAGTGCAATGGACTTCCCCTTGCAATTGTCACCATAGGTGGTTTCTTGGCAAGCCGCCCCAAAACTACTTTGGAGTGGAGAAAATTGAATGAGCATATTAGTGCAGAGTTGGAGACAAACCCAGGGCTTGAGGCCATCAGAGCTGTCCTTAATATAAGCTACGACGGATTACCTTATCACCTCAAGTCTTGCTTCTTGTATCTGTCCATCTTTCCTGAAGATGGCAAGATTAGCAGAAAACGTTTGGTGCGTCGATGGTGTGCAGAGGGTTACTCAAGGGAGCTATGGGACAAATCTGCAGAGGAAATAGCAAACAACTACTTCTTTGAACTCATAGACAGAAGCATGATCCTACCAACTCAAAATTCAACTTACAGCAGTAGAGGGGCTGATTCTTGCCAGATCCATGATATCATGCGTGAGATAGCCATCTTGAAGTCAAAGGAGGAAAACCTTGTTCTTAGACTCGAAGGGGGTCCCAGGCTATACAATCATGACACAGTTCGGCATATTTCCATTACAAACATCAGCGAGGACTGGGAGACAGATGTCGATGAATTGAAGACAACAGTAGATATGTCCCGAATAAGATCATTAACAGTATTTGGGATGTGGAGACCTTTTTTTATTTCTGACAAGATGCAGTTACTACAAGTGCTAGACTTGGAAGACACAAAAGGTGTATATGATCATCATATTAAGCAAATTGGGAAGCTCCTTCACCTTAGATACCTTTCTCTAAGAGGATGTGGGAACATTACTTACCTGCCTGATTCCTTAGGTAACCTAAGGCAACTGGAGACACTAGATGTCAGAGGTACGTGCATACTCAGGTTGCAAAAGACCATCATTAATCTTCGCAAGCTAAAGTATCTCCGTGCTGTCCCAGAGTTATCTGACCCGTATGAAGACATAGCAGAGAAACTACCAGAGCTCATTAGGAACAGGCTATGCATTTCTGCGACTGCGTTGCTGGCGCTTTGCGTGTTATGCTCACCAAGTGATCAAGGGATTAGTACCCGTGACCTCTGCACCTTGTGTTGCTGCAGTATTCTCCCTGCCATTGCCATGCGCCTCGACGGGAATGGTGTAGTAGCACCGAGAGGGCTGAGGAGACTGACAGCCCTGCACACGCTAGGTGTGGTGGACATTTCATGGCAGCCATCAATTTTACAAGATATCAAGAGGCTCATCCAGCTGCGCAAACTGGGAGTGAGCGGTGTCAACAAGAAAAACAGCAAAAAGTTTTTATCTGCCCTTGTCGCTCTCAGCCGCCTGGAATCATTGTCACTGATCTCGAAGGGGAAGCCAGGTCTCTGGGGCTGTCTGGATGCTGATGAAAAGTTTTCGCCACCTAAGAATCTCAAGACTCTGAAGCTTCAAGGCAACCTGGTTGAGTTGCCAAAATGGATCGGGCAGCTCAACAATCTCGTGAAGCTGAAGCTATCAGAAACCGGGCTCAAGGATCATGATGCTGCTATACAAGTCCTTGGTAAGCTACGAAACCTGACCATCCTATGCCTGCTGGGCAAGTCATTTCACTCGCTTGAGGGTGGTGAACTCAATTTCTCGGAGGGATCTTTCAAAAGCCTGGTGGTTCTCGAGCTTGACTTCAGTGGGAGCAAATGCGTCAAGTTTCAACAAGGAGCATTCCACAATCTTGAGCTACTGGAGCTTCATTGTGAGCTACTGGAGCTTTCTGGTCATATTGAAGAAGTCGAAACTAAGTTCTCTGGGCTAGAATTTCTCCCAAGAATCAAGGAAGTCCGGCTCCAGGGTTATTTTTACGGATTTTATGACACACGAAAATTGATGGAGGACTTGCTGGCACAGCTTTCCGAGAACCCAAAGAAACCAATCCTGAAGCCTAGCGGGTGA
进一步地，所述的Bph9-M引物为：正向引物：TCATTAGGAACAGGCTATGCA；反向引物：TTCTTGTTGACACCGCTCAC。
其次，本发明提供一种水稻抗褐飞虱基因功能分子标记Bph9-M的鉴定方法，该鉴定方法包括以下步骤：
(1)RIGW查找籼稻中的位点基因序列，MSU查找粳稻中的位点基因序列，获得基因序列Bph9(ID号KU216221)及其等位基因序列Bph1(ID号KX681949)、Bph7(ID号KU221258)、Bph10(ID号KX681950)、Bph21(ID号KX681951)；
(2)多条序列一起比较后，选用第3个外显子的存在的Indel序列，利用在线引物设计软件Primer1进行分子标记设计，命名为Bph9-M；正向引物：TCATTAGGAACAGGCTATGCA；反向引物：TTCTTGTTGACACCGCTCAC。
进一步地，所述的籼稻包括珍汕97(OsZS_12T0336600)和明恢63(OsMH_12T0305200)；所述的粳稻包括日本晴(LOC_Os12g37290)。
最后，本发明还提供了一种基因功能分子标记Bph9-M在水稻抗褐飞虱选育中的应用。该选育应用包括以下步骤：(1)提取水稻基因组DNA；(2)基因型鉴定，所述的基因型鉴定以水稻基因组DNA作为模板进行PCR扩增检测；(3)抗褐飞虱表型鉴定。
进一步地，步骤(1)所述的提取水稻基因组DNA，采用简单CTAB法。
更进一步地，所述的简单CTAB法，具体步骤为：将0.5g左右叶片剪碎后装入2ml的离心管中，然后把一粒钢珠放入管内，盖好管盖，加入600μl CTAB提取液至离心管中，固定在打样机上以23～26转/S的速度振动60s左右；65℃水浴30min，其间震荡混匀2次；打开离心管，加入600μl氯仿充分摇匀后静置5min，于12000rpm离心8min；吸取400μl上清液至事先准备好的1.5ml离心管中，加入事先在-20℃冰箱中预冷的无水乙醇1mL，摇匀后，-20℃冰箱静置20min后离心(12000rpm、10min)；将上层无水乙醇倒入废水缸中，风干后加入200μlddH2O，-20℃保存备用。
进一步地，步骤(2)所述的PCR扩增检测，其中的PCR反应体系为(以20μl计)：10xPCR反应缓冲液2ul，5pM引物F和R各1ul，10mM dNTP0.5ul，DNA样2ul，TaqDNA聚合酶0.5ul，加ddH2O补足至20ul。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s、35次循环；72℃延伸10min；4℃保温。PCR反应的产物通过2％琼脂糖电泳进行分离，经溴化已锭染色后在凝胶成像***下成像。
进一步地，步骤(3)所述的抗褐飞虱表型鉴定，采用标准苗期集团筛选法。
更进一步地，所述的标准苗期集团筛选法，具体步骤为：将供试水稻品种催芽后分别播种在塑料盆内，每个品种栽8棵，设3个重复，当稻苗长到2叶1心时，用纱网罩住整个塑料盆，接入褐飞虱2-3龄若虫每株水稻12头，进行抗性表型观察。
有益效果：
(1)本发明所公开的水稻抗褐飞虱基因Bph9的功能分子标记Bph9-M，该分子标记Bph9-M位于水稻抗褐飞虱基因Bph9的基因内部的分子标记，与该基因不会发生交换分离，能够较好区分该基因位点上不同的等位基因，不受环境条件的影响。克服了现有技术中采用连锁标记难以准确区分出水稻抗褐飞虱基因，影响了分子标记辅助育种的选择效率和准确度，限制了Bph9基因在水稻抗褐飞虱育种过程中的应用等缺陷与不足。
(2)本发明所公开的水稻抗褐飞虱基因Bph9的功能分子标记Bph9-M的鉴定方法，其鉴定操作方法简单，耗费较低，为Bph9基因在水稻褐飞虱抗性育种的分子标记辅助选择工作打下了坚实的基础，可简便、快速、高通量地进行水稻育种实践。
附图说明
图1为Bph9的功能分子标记Bph9-M在标记序列中的位置。
其中：下划线表示前后引物的位置，虚线表示缺失的核苷酸序列；
OsZS_12T0336600为来自RIGW网站的珍汕97；
OsMH_12T0305200为来自RIGW网站的明恢63；
Nip_Os12g37280为来自MSU网站的日本晴；
Bph9为NCBI Genbank中基因序列(ID号KU216221)；
Bph1为NCBI Genbank中等位基因序列(ID号KX681949)；
Bph7为NCBI Genbank中等位基因序列(ID号KU221258)；
Bph10为NCBI Genbank中等位基因序列(ID号KX681950)；
Bph21为NCBI Genbank中等位基因序列(ID号KX681951)。
图2为标记Bph9-M对多个不同水稻品种的检测结果。
其中1-26依次为：珞珈9号、IR64(含Bph1)、IR36(含Bph2)、IR50(含Bph2)、珞珈18(含Bph18)、辽粳454、龙粳9号、南粳46、晴光、福锦、Tetep、Kasalath、KDM105、象牙香占、镇恢084、R644、中组14、T7954、五山丝苗、华占、明恢63、93-11、成恢727、中早39、内香10B和珍汕97B。
图3为珞珈9号/赣香B的F2群体中Bph9-M的检测结果。
其中：1为珞珈9号，2为赣香B，其余c-y为珞珈9号/赣香B的F2群体中的不同株系。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一：水稻抗褐飞虱基因Bph9的分子标记Bph9-M的鉴定方法
水稻抗褐飞虱基因Bph9的分子标记Bph9-M的鉴定方法，该鉴定方法包括以下步骤：
RIGW查找籼稻中的该位点基因序列，所述籼稻为珍汕97(OsZS_12T0336600)和/或明恢63(OsMH_12T0305200)；MSU查找粳稻中的该位点基因序列，所述粳稻为日本晴(LOC_Os12g37280)；NCBI Genbank中获得基因序列Bph9(ID号KU216221)及其等位基因序列Bph1(ID号KX681949)、Bph7(ID号KU221258)、Bph10(ID号KX681950)、Bph21(ID号KX681951)。
多条序列一起比较后，选用第3个外显子的存在的Indel序列。利用在线引物设计软件Primer1进行分子标记设计，命名为Bph9-M，正向引物：TCATTAGGAACAGGCTATGCA；反向引物：TTCTTGTTGACACCGCTCAC。
水稻抗褐飞虱基因Bph9的分子标记Bph9-M序列在基因中的位置，见附图1。其中：
下划线表示前后引物的位置，Primer F为正向引物所在位置,PrimerR为反向引物的位置，虚线表示缺失的核苷酸序列；
OsZS_12T0336600为来自RIGW网站的珍汕97；
OsMH_12T0305200为来自RIGW网站的明恢63；
Nip_Os12g37280为来自MSU网站的日本晴；
Bph9为NCBI Genbank中基因序列(ID号KU216221)；
Bph1为NCBI Genbank中等位基因序列(ID号KX681949)；
Bph7为NCBI Genbank中等位基因序列(ID号KU221258)；
Bph10为NCBI Genbank中等位基因序列(ID号KX681950)；
Bph21为NCBI Genbank中等位基因序列(ID号KX681951)。
从附图1可知,具有抗性功能的Bph9可以扩增出298bp大小的条带，而其它未携带Bph9的材料中会扩增出313bp或319bp条带。
实施例二:标记Bph9-M对多个不同水稻品种的检测
1、供试材料
2、提取DNA
本实验采用CTAB简易法提取水稻样品基因组DNA，具体步骤如下：
(1)将0.5g左右叶片剪碎后装入2ml的离心管中，然后把一粒钢珠放入管内，盖好管盖，加入600μl CTAB提取液至离心管中，固定在打样机上以23～26转/S的速度振动60s左右。
(2)65℃水浴30min，其间震荡混匀2次。
(3)打开离心管，加入600μl氯仿充分摇匀后静置5min，于12000rpm离心8min。
(4)吸取400μl上清液至事先准备好的1.5ml离心管中，加入事先在-20℃冰箱中预冷的无水乙醇1mL，摇匀后，-20℃冰箱静置20min后离心(12000rpm、10min)。
(5)将上层无水乙醇倒入废水缸中，风干后加入200μl ddH2O，-20℃保存备用。
3、基因型鉴定
取2μl DNA作为模板进行PCR扩增检测。PCR反应体系以20μl计为：10xPCR反应缓冲液2ul，5pM引物F和R各1ul，10mM dNTP0.5ul，DNA样2ul，TaqDNA聚合酶0.5ul，加ddH2O补足至20ul。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s、35次循环；72℃延伸10min；4℃保温。PCR反应的产物通过2％琼脂糖电泳进行分离，经溴化已锭染色后在凝胶成像***下成像。检测结果见附图2。
从附图2中可知：含有Bph9的材料珞珈9号可以扩增出预期的298bp条带，在其它未携带Bph9材料中扩增出313bp或319bp条带，电泳条带特异清晰，表明该基因标记可以很好地区分水稻材料是否带有抗飞虱基因Bph9，可以有效地用于水稻抗褐飞虱的标记辅助育种。
实施例三:珞珈9号/赣香B及其F2群体中Bph9-M的检测
1、供试材料
珞珈9号、赣香B，以及与珞珈9号/赣香B配制F2分离群体(c-y)用于标记Bph9-M的验证。
2、提取DNA
本实验采用CTAB简易法提取水稻样品基因组DNA，具体步骤如下：
(1)将0.5g左右叶片剪碎后装入2ml的离心管中，然后把一粒钢珠放入管内，盖好管盖，加入600μl CTAB提取液至离心管中，固定在打样机上以23～26转/S的速度振动60s左右。
(2)65℃水浴30min，其间震荡混匀2次。
(3)打开离心管，加入600μl氯仿充分摇匀后静置5min，于12000rpm离心8min。
(4)吸取400μl上清液至事先准备好的1.5ml离心管中，加入事先在-20℃冰箱中预冷的无水乙醇1mL，摇匀后，-20℃冰箱静置20min后离心(12000rpm、10min)。
(5)将上层无水乙醇倒入废水缸中，风干后加入200μl ddH2O，-20℃保存备用。
3、基因型鉴定
取2μl DNA作为模板进行PCR扩增检测。PCR反应体系以20μl计为：10xPCR反应缓冲液2ul，5pM引物F和R各1ul，10mM dNTP0.5ul，DNA样2ul，TaqDNA聚合酶0.5ul，加ddH2O补足至20ul。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s、35次循环；72℃延伸10min；4℃冷却10min。PCR反应的产物通过6％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，硝酸银和氢氧化钠染色后，在凝胶成像***下成像。参考双亲的扩增条带，对后代单株的带型进行判别记录。检测结果见附图3。
从附图3可知，基因型标记Bph9-M可明显分辨出群体中的基因型。珞珈9号/赣香B的F2分离群体的不同株系中，株系(e、f、i、q、s、t、w、x、y)含有与珞珈9号一致的电泳条带，携带有纯合型的Bph9基因；株系(c、d、j、n、o、p、r)含有与赣香B一致的标记，不携带有Bph9基因；株系(g、h、k、l、m、u、v)同时携带有两个亲本的条带，携带有杂合型的Bph9基因。
4、抗褐飞虱表型鉴定
随机取F2群体中带有Bph9和未带有Bph9的不同株系，进行褐飞虱抗性鉴定。
采用标准苗期集团筛选法进行，将供试水稻品种催芽后分别播种在塑料盆内，每个品种栽8棵，设3个重复。当稻苗长到2叶1心时，用纱网罩住整个塑料盆，接入褐飞虱2-3龄若虫每株水稻12头，进行抗性表型观察，观察结果为：水稻珞珈9号后代不同株系因带有Bph9株系表现为抗褐飞虱，稻株照常生长；而水稻赣香B后代不同株系因不带Bph9株系表现为不能抗褐飞虱，稻株全部枯萎死亡。
说明带有Bph9基因株系抗褐飞虱能力明显强于不带Bph9株系。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都涵盖在本发明范围内。
水稻抗褐飞虱基因Bph9-M的核苷酸序列表
序列表
<110> 江西省农业科学院水稻研究所
<120> 一种水稻抗褐飞虱基因Bph9的功能分子标记、鉴定方法及应用
<140> 2019102349683
<141> 2019-03-27
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
tcattaggaa caggctatgc a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
ttcttgttga caccgctcac 20
<210> 3
<211> 1950
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
gtatttaagg agtcagtaaa tttggatcaa caagatcttg aattgatcaa agaagcgaaa 60
ccgattctaa agaagtgcaa tggacttccc cttgcaattg tcaccatagg tggtttcttg 120
gcaagccgcc ccaaaactac tttggagtgg agaaaattga atgagcatat tagtgcagag 180
ttggagacaa acccagggct tgaggccatc agagctgtcc ttaatataag ctacgacgga 240
ttaccttatc acctcaagtc ttgcttcttg tatctgtcca tctttcctga agatggcaag 300
attagcagaa aacgtttggt gcgtcgatgg tgtgcagagg gttactcaag ggagctatgg 360
gacaaatctg cagaggaaat agcaaacaac tacttctttg aactcataga cagaagcatg 420
atcctaccaa ctcaaaattc aacttacagc agtagagggg ctgattcttg ccagatccat 480
gatatcatgc gtgagatagc catcttgaag tcaaaggagg aaaaccttgt tcttagactc 540
gaagggggtc ccaggctata caatcatgac acagttcggc atatttccat tacaaacatc 600
agcgaggact gggagacaga tgtcgatgaa ttgaagacaa cagtagatat gtcccgaata 660
agatcattaa cagtatttgg gatgtggaga ccttttttta tttctgacaa gatgcagtta 720
ctacaagtgc tagacttgga agacacaaaa ggtgtatatg atcatcatat taagcaaatt 780
gggaagctcc ttcaccttag atacctttct ctaagaggat gtgggaacat tacttacctg 840
cctgattcct taggtaacct aaggcaactg gagacactag atgtcagagg tacgtgcata 900
ctcaggttgc aaaagaccat cattaatctt cgcaagctaa agtatctccg tgctgtccca 960
gagttatctg acccgtatga agacatagca gagaaactac cagagctcat taggaacagg 1020
ctatgcattt ctgcgactgc gttgctggcg ctttgcgtgt tatgctcacc aagtgatcaa 1080
gggattagta cccgtgacct ctgcaccttg tgttgctgca gtattctccc tgccattgcc 1140
atgcgcctcg acgggaatgg tgtagtagca ccgagagggc tgaggagact gacagccctg 1200
cacacgctag gtgtggtgga catttcatgg cagccatcaa ttttacaaga tatcaagagg 1260
ctcatccagc tgcgcaaact gggagtgagc ggtgtcaaca agaaaaacag caaaaagttt 1320
ttatctgccc ttgtcgctct cagccgcctg gaatcattgt cactgatctc gaaggggaag 1380
ccaggtctct ggggctgtct ggatgctgat gaaaagtttt cgccacctaa gaatctcaag 1440
actctgaagc ttcaaggcaa cctggttgag ttgccaaaat ggatcgggca gctcaacaat 1500
ctcgtgaagc tgaagctatc agaaaccggg ctcaaggatc atgatgctgc tatacaagtc 1560
cttggtaagc tacgaaacct gaccatccta tgcctgctgg gcaagtcatt tcactcgctt 1620
gagggtggtg aactcaattt ctcggaggga tctttcaaaa gcctggtggt tctcgagctt 1680
gacttcagtg ggagcaaatg cgtcaagttt caacaaggag cattccacaa tcttgagcta 1740
ctggagcttc attgtgagct actggagctt tctggtcata ttgaagaagt cgaaactaag 1800
ttctctgggc tagaatttct cccaagaatc aaggaagtcc ggctccaggg ttatttttac 1860
ggattttatg acacacgaaa attgatggag gacttgctgg cacagctttc cgagaaccca 1920
aagaaaccaa tcctgaagcc tagcgggtga 1950
Claims (8)
1.一种水稻抗褐飞虱基因Bph9的功能分子标记引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：
正向引物：TCATTAGGAACAGGCTATGCA；
反向引物：TTCTTGTTGACACCGCTCAC。
2.一种水稻抗褐飞虱基因功能分子标记Bph9-M的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）RIGW查找籼稻中的位点基因序列，MSU查找粳稻中的位点基因序列，获得基因序列Bph9及其等位基因序列Bph1、Bph7、Bph10、Bph21；
（2）多条序列一起比较后，选用第3个外显子存在的Indel序列，利用在线引物设计软件Primer1进行分子标记引物设计，所述引物如权利要求1所述；
（3）所述水稻抗褐飞虱基因功能分子标记Bph9-M的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，利用权利要求1所述的功能分子标记引物进行PCR扩增，具有抗性功能的Bph9-M的水稻样本可以扩增出298bp大小的条带，而其它未携带Bph9-M的水稻样本会扩增出313bp或319bp条带。
3.根据如权利要求2所述的一种水稻抗褐飞虱基因功能分子标记Bph9-M的鉴定方法，其特征在于：所述的籼稻包括珍汕97和/或明恢63；所述的粳稻包括日本晴。
4.权利要求1所述的功能分子标记引物在水稻抗褐飞虱选育中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取水稻基因组DNA；
（2）基因型鉴定；所述的基因型鉴定以水稻基因组DNA作为模板，利用权利要求1所述的功能分子标记引物进行PCR扩增检测，具有抗性功能的Bph9-M的水稻样本可以扩增出298bp大小的条带，而其它未携带Bph9-M的水稻样本会扩增出313bp或319bp条带；
（3）抗褐飞虱表型鉴定。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述的提取水稻基因组DNA，采用简单CTAB法。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述的PCR扩增检测，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s、35次循环；72℃延伸10min；4℃保温。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（3）所述的抗褐飞虱表型鉴定，采用标准苗期集团筛选法。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的标准苗期集团筛选法，具体为：将供试水稻品种催芽后分别播种在塑料盆内，每个品种栽8棵，设3个重复，当稻苗长到2叶1心时，用纱网罩住整个塑料盆，接入褐飞虱2-3龄若虫每株水稻12头，进行抗性表型观察。
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