CN115896118B - 诱导植物产生抗性的褐飞虱唾液蛋白NlG14基因、蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了诱导植物产生抗性的褐飞虱唾液蛋白NlG14基因、蛋白及其应用，所述褐飞虱唾液蛋白基因为NlG14，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明鉴定到来自褐飞虱(Nilaparvata lugens)的一个唾液蛋白基因NlG14，该基因编码的蛋白能够触发HR、ROS和胼胝质沉积，从而诱导植物产生抗性，包括抗虫性和抗病性。本发明褐飞虱唾液蛋白NlG14具有开发成植物免疫诱抗剂的价值，为防控植物病虫害提供理论支撑，同时也可以直接导入作物中制备转基因植株，提供新型转基因抗病策略。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及诱导植物产生抗性的褐飞虱唾液蛋白NlG14基因、蛋白及其应用。
背景技术
在植物和昆虫的长期协同进化过程中，昆虫为了更好地取食植物，进化出大量的攻击寄主的武器，例如效应蛋白(effector)。昆虫分泌这些效应蛋白到植物体内，为了其更好地取食寄主植物，然而伴随着植物的共同进化，有些效应蛋白会被植物自身进化的调控抗病相关基因识别。对效应蛋白的识别通常会触发局部抗性反应，成为超敏反应(HR)，其特征在于感染部位的快速细胞死亡。这一明显的HR反应也是作为激发植物免疫的重要信号。活性氧积累也是一个触发植物免疫反应的关键信号，也可以作为植物防御反应触发的信号标识。利用农杆菌介导的瞬时表达***接种病原菌或昆虫是最直接评估基因是否能够诱导植物抗性的方法。
ROS积累在植物防卫反应中起着非常重要的作用，它参与调控气孔运动，促进细胞编程性死亡，作为第二信使可在转录水平上激活和调控植物体内各种防卫相关基因的表达。植物胼胝质的沉积，可加强植物细胞壁来阻止病原微生物侵入，也可阻塞筛管，阻止刺吸式昆虫取食韧皮部汁液，从而达到抗病或抗虫目的。植物免疫诱抗剂可以分为生物来源及非生物来源，生物来源的免疫诱抗剂主要从细菌、真菌和病毒中鉴定纯化出。目前，昆虫源的免疫诱抗蛋白仍然较少。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的农作物抗虫基因资源不足，本发明提供诱导植物产生抗性的褐飞虱唾液蛋白基因，本发明通过筛选获得了来源于褐飞虱(Nilaparvatalugens)的唾液蛋白NlG14，该蛋白通过触发植物过敏性反应(HR)、胼胝质沉积和活性氧(ROS)积累，提升对害虫和病原物的抗性，保护农作物生产，首次提出了可以诱导植物产生抗性的褐飞虱唾液蛋白基因NlG14。
本发明还提供所述诱导植物产生抗性的褐飞虱唾液蛋白NlG14、表达载体和应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明提供一种诱导植物产生抗性的褐飞虱唾液蛋白基因，所述褐飞虱唾液蛋白基因为NlG14，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述的基因编码的褐飞虱唾液蛋白NlG14，其特征在于，所述褐飞虱唾液蛋白NlG14的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明所述的褐飞虱唾液蛋白基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
其中所述重组表达载体的出发载体为表达载体PBINGFP2。
作为优选，构建所述NlG14基因的重组表达载体pBINGFP2:NlG14。以植物表达载体PBINGFP2为出发载体，将NlG14基因***KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点获得。
本发明所述的NlG14基因或者所述蛋白或所述的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌在诱导植物产生抗性中的应用。
其中，所述抗性包括抗虫性和抗病性。
作为优选，通过诱导植物产生局部坏死和活性氧积累在诱导植物产生抗性中的应用。
本发明所述的基因或者所述蛋白或所述的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌在制备植物免疫诱抗剂中的应用。
本发明还可以提供一种植物免疫诱抗剂，该诱抗剂含所述的褐飞虱唾液蛋白NlG14重组菌的发酵液。
本发明所述的基因或者所述蛋白或所述的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌在培育抗病虫作物品种的应用。
其中，将所述的基因、蛋白、表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌导入植株中，经过抗性筛选得到阳性转化植株，获得抗病虫作物品种。
进一步地，所述基因、蛋白、表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌导入植株中，触发HR、ROS诱导植物产生抗性。
本发明通过筛选获得了来源于褐飞虱(Nilaparvata lugens)的唾液蛋白基因能够触发植物过敏性反应(HR)、胼胝质沉积和活性氧(ROS)积累，此外利用农杆菌介导的瞬时表达***客观评估发现能够诱导植物产生抗性。激发HR，促进ROS积累，促进胼胝质沉积，触发植物免疫，诱导植物产生抗病反应，有助于研究开发植物免疫诱抗剂。这个基因的强大功能既可以作为开发植物免疫诱抗剂的基因，又可以利用转基因技术直接将基因导入植物体内，开发培育抗病虫品种。开发农作物抗病虫品种是病虫害防治最经济有效的方法，在高效防控病虫害的同时，减少农药使用，降低环境污染风险。本发明第一次发现褐飞虱唾液蛋白NlG14具有诱导植物产生抗性的特征，明确了诱导植物产生抗性的分子生物学机制，有助于该基因、蛋白在免疫有抗性的开发和转基因植物的创制。
本发明以模式植物本氏烟为测试对象，本氏烟可以作为植物代表，通过农杆菌介导的瞬时表达***对褐飞虱潜在唾液蛋白NlG14调控植物防御反应的机制进行了研究。图1的结果表明，NlG14的瞬时表达可以引起植物过敏性反应(HR)以及活性氧(ROS)积累。本发明还通过苯胺蓝染色法检测了NlG14的瞬时表达对植物胼胝质沉积量的影响。图2的结果表明，NlG14的瞬时表达可以显著提高植物的胼胝质沉积。本发明还通过在瞬时表达NlG14的本氏烟叶片上接种病原菌或昆虫评估植物对病虫害抗性。图3的结果表明，NlG14的瞬时表达有效抑制了辣椒疫霉的侵染和草地贪夜蛾的取食。
本发明首次发现褐飞虱唾液蛋白NlG14具有诱导植物产生抗性的功能，明确了诱导植物产生抗性的分子生物学机制，有助于该基因、蛋白在免疫有抗性的开发和转基因植物的创制。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明从褐飞虱(Nilaparvata lugens)中鉴定到唾液蛋白基因NlG14，首次提出了褐飞虱唾液蛋白基因NlG14和蛋白NlG14在诱导植物产生抗虫性和抗病性中的应用，将基因NlG14***植物表达载体PBINGFP2，将所述载体导入植物中，能够产生显著的HR反应、ROS积累和胼胝质沉积，激发植物免疫。
本发明表达了NlG14的本氏烟，对多种害虫和病原菌表现出良好的抑制取食和抑制侵染的效果，该NlG14蛋白基因具有开发成植物免疫诱抗剂的价值，为防控植物病虫害提供理论支撑。同时也可以直接导入作物中制备转基因植株，提供新型转基因抗病策略。
附图说明
图1为NlG14蛋白触发植物HR、ROS；其中，A为农杆菌瞬时表达注射本氏烟叶片会诱导HR表型；B为农杆菌瞬时表达注射本氏烟叶片会诱导活性氧积累；
图2为NlG14蛋白诱发植物叶片胼胝质积累；其中数字表示三个叶盘胼胝质斑点平均数量；
图3为NlG14诱导植物抗性；其中，A为农杆菌瞬时表达NlG14基因在烟草上能够提高植物对辣椒疫霉的抗性；B为农杆菌诱导抗病表型的病斑相对面积统计；C为农杆菌瞬时表达NlG14基因在烟草上能够提高植物对草地贪夜蛾的抗性；D为农杆菌诱导抗虫表型的幼虫数统计。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例中使用的原料和试剂等均市售可得，或者采用市售的同类型原料均可。
实施例1
1.实验昆虫
供试昆虫褐飞虱(Nilaparvata lugens)由南京农业大学杀虫剂药理与神经毒理学实验室提供，室内(温度：27±1℃，湿度70％±10％，光照：L：D＝16h：8h，)传代饲养于Xiushui11水稻上。
2.供试本氏烟幼苗的准备
本氏烟草(Nicotiana benthamiana)(华越洋生物有限公司，北京)播种于装有蛭石的一次性塑料杯(200mL)中，放到16h光照/8h黑暗的温室中生长。使其生长7天，生长出两片真叶后将其移栽至蛭石黑土体积比例为5：1的培养土里生长30天，取相同3，4，5叶位的叶片用作表达实验基因，然后持续观察7天叶片表型是否有明显HR。
3.提取褐飞虱(Nilaparvata lugens)RNA，并获得目的基因的cDNA。
收集30头五龄褐飞虱(Nilaparvata lugens)，根据Invitrogen公司的说明，使用TrizolTM reagent提取总RNA。根据TaKaRa公司的说明，使用PrimeScript RT Reagent Kit去除基因组DNA，然后反转录合成cDNA。以上述cDNA为模版，用相应上下游引物进行PCR扩增(引物序列见表1)
表1引物序列
| name | sequence |
| NlG14-F | ATGCTACTGAGGAAGATTGTTT |
| NlG14-R | CTACAGCTCATCTTTCTCGTTATT |
PCR反应体系为：12.5μL 2×Phanta Master Mix；2μL(10μm)引物；1μL cDNA模板；无菌水补足至25μL。
反应程序为：95℃5min预变性；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
上述PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳、回收、经测序确认无误后，获得的序列为所述NlG14基因的核苷酸序列。所述NlG14基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。NlG14基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。后续研究发现其具有诱导植物产生坏死和活性氧积累的强大功能。
实施例2
构建pBINGFP2:NlG14表达载体
利用实施例1中cDNA为模板，用添加有质粒同源臂的上下游引物进行PCR扩增不包含信号肽的全长序列(引物序列见表2)。PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳、回收(方法同实施例1的步骤(3))，得到目的基因。
表2引物序列
将pBINGFP2(南京农业大学植病系植物与疫霉互作实验室提供，Tianqiao S,Zhenchuan M,Danyu S,et al.An Oomycete CRN Effector Reprograms Expression ofPlant HSP Genes by Targeting their Promoters[J].Plos Pathogens,2015,11(12):e1005348)空载体质粒用KpnⅠ和BamHⅠ进行酶切；利用诺唯赞公司的同源重组酶ExnaseⅡ(货号：C112)将目的片段和载体连接。
反应体系如下：4μL 5×CEⅡBuffer；2μL ExnaseⅡ；1μL上述PCR回收产物；4μL上述酶切后空载体；无菌水补足至10μL。
反应程序为：37℃条件下反应30min。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，在Kan抗性培养基上筛选转化子，挑取阳性克隆提取质粒进行菌落PCR鉴定。将鉴定到的阳性克隆测序，正确即获得了PBINGFP2:NlG14表达载体，其序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例3
表达载体转化农杆菌及功能验证。
1.PBINGFP2:NlG14表达载体转化农杆菌
利用电转法将PBINGFP2:NlG14表达载体转化农杆菌细胞GV3101(购自庄盟公司)。具体过程为：将实施例2构建的表达载体加入农杆菌感受态，轻轻混匀后转移至无菌的电击杯中，进行电击转化。电击完成后将农杆菌感受态细胞按体积比10％加入到700μL LB液体培养基中，28℃200rpm振荡培养2h。吸取100μL菌液，均匀涂抹在含有50mM卡那霉素和25mM利福平的固体LB培养基平板上，28℃倒置培养48h。挑取单菌落进行菌落PCR，获取阳性克隆，即含PBINGFP2:NlG14表达载体的农杆菌。
2.在本氏烟草中瞬时表达PBINGFP2:NlG14、PBINGFP2和PBI121:INF1
将步骤(1)获得含PBINGFP2:NlG14的农杆菌、含空载PBINGFP2的农杆菌(方法同步骤(1))和含PBI121:INF1载体的农杆菌(其中PBI121载体为常规植物表达载体，PBI121表达INF1蛋白由南京农业大学植病系植物与疫霉互作实验室提供，Dong Y,Jing M,Shen D,etal.The mirid bug Apolygus lucorum deploys a glutathione peroxidase as acandidate effector to enhance plant susceptibility[J].Journal of ExperimentalBotany,2020(9):9，构建方法同步骤(1))，分别接种到含有50mM卡那霉素和25mM利福平的液体LB培养基中，28℃230rpm震荡培养20h。将菌液收集，5000rpm离心3min，利用渗透缓冲液(10mM MgCl2,500mM MES,100mM乙酰丁香酮)清洗一次。最后用渗透缓冲液稀释菌液至OD600值0.4。用1mL注射器在本氏烟草叶片分别注射上述含不同基因的菌液(保证每个叶片注射浸润后面积相同，一般达到饱和状态即可)，每个最少6个重复重复，实验重复三次，结果如图1所示。
3.活性氧(ROS)积累检测
注射所有处理基因48h后，用DAB染液(1mg/mL DAB,10mM Na2HPO4)在25℃避光浸泡6h，然后用95％乙醇脱色处理，最后用相机拍照记录表型，实验结果如图1所示。图1的结果表明，基因NlG14的瞬时表达可以引起植物过敏性反应(HR)以及活性氧(ROS)积累，阳性对照INF1同样表现出HR反应和ROS积累，但阴性对照GFP没有任何变化。
4.胼胝质沉积检测
注射48后，将叶盘用95％的乙醇脱色，漂白后的样品用ddH2O清洗，用染液(70mMKH2PO4和0.05％苯胺蓝，pH 9)室温孵育1h，染色后的叶片贴在抗荧光淬灭封片剂中，用荧光倒置显微镜观察拍照，用ImageJ软件计算胼胝质沉淀物的数量，实验重复三次，实验结果如图2所示。图2的结果表明，基因NlG14的瞬时表达可以显著提高植物的胼胝质沉积，同时证明表达了NlG14蛋白。
5.瞬时表达PBINGFP2:NlG14蛋白的本氏烟抗病性检测
将表达了NlG14蛋白的本氏烟叶片剪下，放置于滤纸保湿的托盘内。用打孔器在辣椒疫霉的平板生长边缘打孔，将打下的菌碟菌面向下，左右对称放置在本氏烟叶片的左右两侧。将托盘放置于25℃培养箱，黑暗，36h。取出叶片，然后用手持紫外荧光仪照射叶片。颜色变深的区域即为辣椒疫霉的侵染区域。表达GFP蛋白的叶面为对照，利用Image J软件测量相对侵染区域面积，比较两种蛋白对本氏烟抗性的影响。发现来自褐飞虱的NlG14蛋白显著提高了本氏烟草对辣椒疫霉的抗性(如图3所示)，同时采用上述相同的方法测试其他病原菌的抗性，包括寄生疫霉、核盘菌、青枯雷尔氏菌、丁香假单胞菌、互隔交链孢和胡萝卜软腐果胶杆菌等(如表1所示)，说明NlG14蛋白显著提高了本氏烟草对上述病原菌的抗性。
表1.瞬时表达PBINGFP2:NlG14蛋白对病原菌侵染的抑制作用
6.瞬时表达PBINGFP2:NlG14蛋白的本氏烟抗虫性检测
根据步骤(2)中的方法，利用本氏烟草中瞬时表达***，将GFP或GFP:NlG14在本氏烟草叶片瞬时表达，24h后剪下叶片，放置于托盘内。茎部用湿润的棉花保湿，将8个2龄草地贪夜蛾幼虫放置在叶片中部，分别在12h和24h后进行观察统计两片叶片虫数，共16个重复。发现NlG14蛋白的表达显著抑制了草地贪夜蛾的取食(如图3所示)，同时采用上述相同的方法测试对其他害虫的抗性，包括棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、玉米螟、草地螟、桃蚜、棉蚜和烟粉虱等(如表2所示)，说明NlG14蛋白的表达显著抑制了上述害虫的取食。
表2.瞬时表达PBINGFP2:NlG14蛋白对害虫危害的抑制作用
Claims (9)
1.一种诱导植物产生抗性的褐飞虱唾液蛋白基因，其特征在于，所述褐飞虱唾液蛋白基因为NlG14，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述的基因编码的褐飞虱唾液蛋白NlG14，其特征在于，所述褐飞虱唾液蛋白NlG14的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种含有权利要求1所述的褐飞虱唾液蛋白基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体的出发载体为表达载体PBINGFP2。
5.一种权利要求1中所述的NlG14基因或者权利要求2中所述蛋白或权利要求3中所述的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌在诱导植物产生抗性中的应用，所述抗性包括抗虫性和抗病性。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过诱导植物产生局部坏死和活性氧积累在诱导植物产生抗性中的应用。
7.一种权利要求1中所述的基因或者权利要求2中所述蛋白或权利要求3中所述的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌在制备植物免疫诱抗剂中的应用。
8.一种权利要求1中所述的基因或者权利要求2中所述蛋白或权利要求3中所述的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌在培育抗病虫作物品种的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述的基因、蛋白、表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌导入植株中，经过抗性筛选得到阳性转化植株，获得抗病虫作物品种。
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