CN110945122A - 用于羟醛缩合碳连接的果糖-6-磷酸醛缩酶变体 - Google Patents
用于羟醛缩合碳连接的果糖-6-磷酸醛缩酶变体 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供新的和可替代的果糖‑6‑磷酸醛缩酶(FSA)变体，其能够在羟醛缩合碳连接反应中使用醛作为原料来制备具有高化学选择性和立体选择性的光学活性结构单元，同时避免副产物的形成和后续反应。
Description
技术领域
本发明涉及化学领域，尤其涉及羟醛缩合碳连接反应。更具体地，本发明涉及可以在这些反应中用作改进的生物催化剂的醛缩酶类酶变体，因为它们选择性地制备具有高立体选择性和化学选择性的光学活性化合物，从而避免副产物的形成。
背景技术
羟醛缩合反应是烯醇盐和羰基化合物之间的一整类反应。这些是有机合成中非常重要的反应，因为当亲核烯醇酸盐攻击亲电子醛或酮时，会形成新的碳-碳键。在不同类型的羟醛缩合反应中，醛特别适合作为供体分子，因为形成的产物本身就是醛，并且它们可以进一步加成并生成更复杂的结构单元。
醛的对映选择性的羟醛缩合碳连接以提供光学活性化合物是产生价值的有吸引力的策略。起始原料通常容易获得且便宜，并且所获得的产物对于许多化学片段而言非常通用并且具有高附加值。然而，尽管此类反应可具有潜力，但由于醛固有的高反应活性，在许多情况下仍阻碍了它们的实际使用，这使这些反应易于遭受副产物形成、丁烯醛化、低聚、外消旋化和其他后续作用(和平行)反应。从反应结束时获得的副产物的(水)复合粗混合物中纯化所需目标产物非常麻烦，从实际的角度来看，在许多情况下实际上是不可能的。因此，这些合成方法不能在工业水平上使用。
该问题的一个示例性例子是氯乙醛与乙醛之间的碳连接，以(选择性地)提供4-氯-3-羟基丁醛(3)：
该反应代表高反应性醛之间具有挑战性的选择***叉碳连接的例子。在方框中，描绘了期望的(选择性)过程，而在图中的其余部分示出通常在那些反应的粗混合物中观察到的一些可能的副产物。
在这种示例性情况下，化合物(3)对于药物和精细化学应用以及天然化合物的合成可以是有用的结构单元。然而，该过程受到催化或自发产生的副产物的数量和随后可发生的后续(和平行)反应的阻碍。混合过程的这种复杂性和动力学的例子也可以在文献中找到(Rucigaj and Krajnc,Chem.Eng.J.2015,259,11-24)。
考虑到例如4-氯-3-羟基丁醛(3)对于合成目的可具有的重要性，一些专利公开了其合成。因此，CN103145540报道了5-卤代-4-羟基-1-戊烯化合物的臭氧化，从而导致所需的醛，这通过Wittig-型反应和环氧化进一步用于合成天然产物。同样，US8742176公开了基于吡咯烷的有机催化用于将乙醛对映选择性加成到氯乙醛中，以及随后的Wittig型缩合和环氧化。关于生物催化，EP1734129专注于酶2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)的制备(3)，以及向(3)进一步加成另一个乙醛分子，以提供statin链前体。在该专利中，提到来自Pyrobaculum aerophilum的DERA对两种醛(即，除其他实例外，是氯代乙醛和乙醛)的单次加成选择性。然而，对该专利的仔细阅读表明，这种酶对单次添加显示出不完全的选择性，但是仍然存在双次添加(所述专利第12页的实施例7)。因此，在反应结束时仍然需要色谱分离单加次成加合物和双次加成加合物。
已经从不同的角度对羟醛缩合反应进行了广泛的研究，包括开发用于立体控制合成的新催化剂。已开发用于不对称羟醛缩合反应的催化剂包括有机小分子、具有手性配体和醛缩酶的过渡金属配位络合物。如果在交叉羟醛缩合反应中可以化学选择性地烯醇盐阴离子的形成和羰基的进攻以避免复杂产物混合物的形成，那么羟醛缩合反应的合成效用将大大提高。由于酶具有很高的选择性，通常在实验室简单的化学反应中是不可能的，因此醛缩酶已在合成稀有糖或糖衍生物(如他汀类、iminocyclitol、埃博霉素和唾液酸)中成为一种环境友好的替代品。
醛缩酶(EC 4.1.2.X)是通常催化酮或醛供体向醛受体的立体选择性加成的裂解酶。到目前为止，大多数(如果不是全部)有机体中都存在30多种已知的缩醛酶。醛缩酶是自然界自己的催化剂，它是有机化学中最基本的反应之一：形成新的碳-碳键。在生物***中，羟醛的形成和裂解反应在糖代谢中起关键作用。如前所述，在有机合成中，醛缩酶作为以立体控制方式合成多羟基化化合物的环境友好替代品备受关注。
因此，已经开发出设计具有改善的供体选择性的醛缩酶的方法。例如，在下列文献中已经描述来自大肠杆菌的具有单、双或三氨基酸取代的果糖-6-磷酸醛缩酶(FSA)变体：Anna Szekrenyi,et al.,2014,Chemistry A European Journal,Engineering the DonorSelectivity of D-Fructose-6-Phosphate Aldolase for Biocatalytic AsymmetricCross-Aldol Additions of Glycolaldehyde。具体地，在该现有技术文件中，公开了以下大肠杆菌FSA变体：L107Y,A129G/A165G,A129S/A165G,A129T/A165G,A129G,A129V,A129T,A129S,L107Y/A129G,L107H/A129G,L107F/A129G,L107H,L107Y/A129G/A165G,L107H/A129G/A165G和L107F。评估了这些变体对供体底物(如乙醇醛和二羟基丙酮)的选择性。已发现其他FSA变体(例如A165G、A129S和A165G/A129S)对加成羟丙酮和二羟丙酮具有选择性(Gutierrez,et al.,Chem.Commun.2011,47(20),5762-5764)。然而，尽管所有这些变体对于羟甲基酮作为亲核试剂组分均具有选择性，但对于没有羟甲基官能团的那些却没有活性。因此，没有描述FSA变体对没有羟甲基官能团和非磷酸化亲电试剂的亲核试剂具有活性。
此外，在Huan Ma.2015.Digital Comprehensive Summaries of UppsalaDissertations from the Faculty of Science and Technology 1318.67中已经描述了在以苯乙醛和羟丙酮为底物的情况下具有增强的对羟醛缩合反应的催化活性的大肠杆菌FSA变体。特别地，这些变体是通过诱变在催化的Lys85、Arg134和Ser166附近的底物结合位点附近获得的。但是，对于这些变体，可以使用与上面针对现有技术的FSA变体所指出的那些相同的缺点。
可以看出，基于4-氯-3-羟基丁醛(3)等化合物的合成潜力以及预期的高市场价格，需要选择性地合成所需目标的选择性(生物)催化剂，同时避免副产物的形成和随后的反应、以及进一步的下游处理单元。拥有这些(生物)催化剂后，作为起始原料，具有高化学选择性和立体选择性的高价值(光学活性)结构单元的制备将有助于建立使用裂解酶(醛缩酶)和高反应性(廉价)醛的经济方法。
迄今为止，在文献中没有用于预期反应的如此高的立体选择性-(生物)催化剂，并且与随后向形成的产物(3)中加成醛相比，仅来自Pyrobaculum aerophilum的DERA似乎显示出对(3)的某些选择性。因此，在工业上非常重要的是开发用于从醛的羟醛缩合碳连接反应中以化学和立体选择性高的方式主要生产所需产物的(生物)催化剂。
发明概述
本发明涉及基于大肠杆菌果糖-6-磷酸醛缩酶(FSA)变体催化的酶促方法，该方法为手性合成子和其他产物提供在环境友好的条件下具有优异的化学选择性和立体选择性的合成方法的潜在潜在价值。
特别地，本发明提供新的和替代的FSA变体(突变体)，其使得能够在羟醛缩合碳连接反应中使用醛作为原料来制备具有高化学选择性和立体选择性的高价值(光学活性)结构单元，而避免副产物的形成和后续反应。
本发明公开几种FSA变体，它们适合并有利于作为酶生物催化剂用于不同结构单元的化学选择性单C-C键形成。当使用本发明的这些FSA变体时，未发现在这些羟醛缩合碳连接反应中预期的副产物(参见上图)，因为这些变体对于用作底物的单添加的醛是完全选择性的。因此，本发明的FSA变体是高度选择性的，并且只有两种底物在它们的存在下反应生成单一的缩合产物，该反应在该所需化合物(即仅形成所需的产品)处终止。因此，该方法允许使用高反应性醛作为底物。
因此，本发明提供使用醛和酮作为底物的对映选择性或非对映选择性生物催化羟醛缩合反应(C-C键形成)，从而专门导致两种底物的单一化学和立体选择性碳连接-它们之间可相似或不同-不形成副产物或不进行进一步的连续反应而添加更多的醛。单一添加的选择性总是>99.99％，因为当本发明的FSA醛缩酶变体在用作生物催化剂时，对两个底物的单一醛醇添加显示出排他的选择性。
因此，本发明的设计的FSA变体在如此具有挑战性的反应中具有显着的高选择性，从而产生对合成方法具有高度潜在兴趣的化合物，而FSA野生型根本不能催化这些反应。
尚无其他能够进行这些反应的(生物)催化剂具有如此高的选择性，其中只有两种底物发生反应以生成单一的缩合产物，并且该反应在该所需化合物处停止。唯一的例子是上面报道的DERA，其中记录了单次添加的一些(不完全)选择性。在本发明中，作为FSA变体的显着例子，在化合物4-氯-3-羟基丁醛(3)的情况下，已实现非常有希望的生产率(时空产率为10-12g L-1d-1)。这表明在经过仔细的微调和优化之后，在本发明中已经获得了坚固且完全选择性的生物催化剂。此外，已经在大肠杆菌FSA野生型或以下每种FSA变体存在下研究了这些羟醛缩合碳连接反应：A165G,L107A,L163A,A129G,L107Y/A129G,A129V,A129T,A129S,L107Y/A129G,L107H/A129G,L107F/A129G,L107H,L107Y/A129G/A165G,L107H/A129G/A165G,L107F,L107Y/A129G/A165G/S166G，但反应没有发生或以低的化学选择性和立体选择性进行。
此外，本发明中公开的这些FSA变体对于作为亲核组分的羟甲基酮和没有羟甲基官能团的那些都是选择性的。迄今为止，还没有描述FSA变体对亲核试剂具有活性，而没有羟甲基功能和非磷酸化亲电试剂。
如上所述，羟醛缩合反应非常有用，但是当使用高反应性醛时，它们的实际使用受到了阻碍。处理复杂的混合物实际上是不经济的。然而，利用本文提出的基于新的基于FSA-变体的方法，由于仅形成了所需的产物，因此大大简化了下游。此外，在温和的工艺条件下，可以进行酶促多步工艺以进一步衍生化所获得的化合物。
因此，本发明通过提供选择性生产所需产物的FSA醛缩酶变体以及制备具有高化学和立体选择性的光学活性化合物的方法来解决上述问题。
具体地，发明人发现在特定位置即SEQ ID NO:1(其是来自大肠杆菌的FSA的野生型氨基酸序列)的6位的诱变(优选地，氨基酸取代)给出这样FSA变体，当用作羟醛缩合碳连接反应的生物催化剂时会导致较高的化学和立体选择性。与SEQ ID NO:1的野生型序列相比，这导致FSA变体主要产生具有高选择性，优选具有改进的选择性的所需光学活性产物。因此，发明人提出来自大肠杆菌的野生型FSA酶的氨基酸序列中的该位置6，用于设计导致在羟醛缩合碳连接反应中的高化学和立体选择性的FSA酶变体。位于FSA序列SEQ ID NO:1的6位的特定氨基酸残基之前并未与酶的底物特异性或立体选择性相关。
因此，本发明的第一方面涉及一种果糖-6-磷酸醛缩酶变体，包含：
a.与SEQ ID NO:1具有至少80％、优选至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％、更优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列；和
b.在6位的氨基酸取代，对应于SEQ ID NO:1的1至220位。
以下，将该变体也称为“本发明的变体”或“本发明的FSA变体”。
与SEQ ID NO:1的FSA相比，当被用作羟醛缩合碳连接反应中的生物催化剂时，本发明所涵盖的FSA变体导致高对映选择性或非对映选择性，更优选地增强、增加或改善对映选择性或非对映选择性。
术语“对映选择性”是指反应对一对对映异构体之一的选择性。可以通过本领域已知的用于确定对映选择性的任何方法来评估“对映选择性”的性质。例如，可通过测量在本发明的FSA变体存在下进行的羟醛缩合碳连接反应后的对映体过量来确定对映体选择性。术语“对映体过量”(ee)是指混合物中每种对映体的量相对于混合物中化合物总量的差，以百分比表示(x 100％)。对于过量的R-对映体，对映体过量可通过以下公式计算：
ee％＝([R]-[S])/([R]+[S])x 100
对于过量的S-对映体，对映体过量可通过以下公式计算：
ee％＝([S]-[R])/([R]+[S])x 100
在上式中，[R]和[S]是混合物中对映体的相应摩尔分数，使得[R]+[S]＝1。
存在于混合物中的每种对映异构体的量可以例如但不限于通过HPLC、手性GC等来测量。
术语“非对映选择性”是指反应对一对非对映异构体之一的选择性。“非对映选择性”的性质可以通过本领域已知的用于确定非对映选择性的任何方法来评估。例如，非对映选择性可以通过在存在本发明的FSA变体的情况下进行羟醛缩合碳连接反应后测定非对映比率来确定。术语“非对映异构体比率”(dr)是指混合物中一种非对映异构体的百分比与另一种非对映异构体的百分比。
混合物中存在的每种非对映异构体的量可以例如但不限于通过NMR测量。
根据本发明，当本发明的FSA变体用作生物催化剂的反应的对映选择性或非对映选择性为“高”时，对映体过量优选为95％或更高，更优选为99％或更高，或非对映体比率优选为95或更高，更优选99或更高。
“果糖-6-磷酸醛缩酶”或“FSA”是分类为EC 4.1.2.X的酶，并且是I类醛缩酶家族的最新成员。它以同功酶形式存在：FSAA和FSAB分别由大肠杆菌中的mipB和talC基因编码。两种同工酶具有相似的底物特征，但FSAB显示出较低的催化活性和热稳定性。FSA是第一个报道的能够催化果糖-6-磷酸裂解产生DHA和G3P的酶。本发明中提到的野生型FSA的氨基酸序列是SEQ ID NO:1。
如本文所用，术语“变体”涉及这样的FSA酶，与大肠杆菌野生型FSA(SEQ ID NO:1)相比，其氨基酸序列内在本文所述的点包含至少一个突变、优选至少一个氨基酸取代，并因此具有与SEQ ID NO:1的天然或野生型酶不同的序列。如本文所用，表达“FSA变体”优选是指包含本文所述的氨基酸取代并具有果糖-6-磷酸醛缩酶活性的多肽，其通过化学合成或由表达本文所描述意义上修饰的编码FSA野生型(优选SEQ ID NO:1)的核苷酸序列的生物体重组产生。通过修饰编码天然或野生型FSA的核苷酸序列(优选SEQ ID NO:1的野生型FSA)，通过人为干预获得所述修饰的序列。术语“修饰”是指天然或野生型FSA，优选SEQ IDNO:1的氨基酸或核酸序列的任何化学修饰。
如本文所用，在描述两个或更多个多肽序列的上下文中，术语“同一性”或“同源性”涉及在两个氨基酸序列的比对位置上氨基酸残基的符合性的指定百分比。用于比较的序列比对方法在现有技术中是众所周知的。同一性可以使用下列方式来确定：Clustal法(Higgins,1989,CABIOS 5：151-153)；Wilbur-Lipman法(Wilbury Lipman,1983,Proceedings of the National Academy of Science USA 80：726-730)；GAG程序，包括GAP(Devereux et al.1984,Nucleic Acids Research 12：287Genetics Computer GroupUniversity of Wisconsin,Madison,25(WI))；BLAST或BLASTN；EMBOSS针和FASTA(Altschul et al.1999,J.Mol.Biol.215：403-410)。另外，史密斯-沃特曼算法也可以用于确定两个序列之间的同一性程度。优选地，使用具有默认参数的BLAST来确定同一性程度。该软件可在以下位置公开获得：National Center for Biotechnology Information(NCBI)。
本发明的FSA变体，除了在本文指出的特定位置上的氨基酸取代之外，在它们的氨基酸序列上可以表现出其他有限的变化。这些改变使得可以维持本发明的FSA变体的果糖-6-磷酸醛缩酶活性，并维持导致羟醛缩合碳连接反应中的高化学选择性和立体选择性的性质。所述改变可以是替换、删除或加成。保守氨基酸被取代，所述保守氨基酸是具有侧链和关于例如疏水或芳族性质相似的性质的氨基酸。这些取代包括但不限于在Glu和Asp之间、Lys和Arg之间、Asn和Gln之间、Ser和Thr之间、和/或在以下列表中包括的氨基酸之间的取代：Ala、Leu、Val和Ile。本段中提到的变化不会导致对本发明变体的基本特征或特性的相关修改。
氨基酸序列中的单个氨基酸在本文中表示为XN，其中X是序列中的氨基酸(通过在氨基酸命名法中普遍接受的一个字母代码表示)，而N是序列中的位置。氨基酸取代在本文中表示为X1NX2，其中X1是非突变酶序列中的氨基酸，X2是突变酶(变体)序列中的新氨基酸，并且N是氨基酸序列中相对于SEQ ID NO:1的位置。
在本发明的变体的优选的实施方案中，在6位的氨基酸取代是选自以下的氨基酸：A、L、N、Q、S、T、E、H、V、G、I或P，更优选被H、N、Q、L、T、E或A取代。更优选地，氨基酸取代选自：D6A、D6L、D6N、D6Q、D6S、D6T、D6E D6H、D6V、D6G、D6I或D6P，优选是D6H、D6N、D6Q、D6L、D6T、D6E或D6A。
在更优选的实施方案中，本发明的变体包含下列、甚至更优选由下列组成：氨基酸序列SEQ ID NO:1，其中位置6(D6)上的D已被选自A、L、N、Q、S、T、E、H、V、G、I或P、优选H、N、Q、L、T、E或A的氨基酸取代。
在甚至更优选的实施方案中，本发明的变体包含氨基酸取代基D6N或D6H。在本发明的特定实施方案中，变体包含下列、甚至更优选由下列组成：氨基酸序列SEQ ID NO:1，其中位置6(D6)上的D已被N或H取代。
在另外优选的实施方案中，本发明的变体还包含在26位的氨基酸取代，对应于SEQID NO:1的1至220位。更优选地，在26位的该氨基酸取代是通过选自以下氨基酸进行：V、A、L、I或P，更优选L或I。甚至更优选地，该氨基酸取代选自：T26V、T26A、T26L、T26I或T26P，优选T26L或T26I。
在特别的实施方案中，本发明的变体包含氨基酸取代基D6A和T26L或D6A和T26I。
在另外优选的实施方案中，本发明的变体还包含在位165处的氨基酸取代，对应于SEQ ID NO:1的1至220位，通过氨基酸G进行。更优选地，该氨基酸取代是A165G。
在另外特别的实施方案中，本发明的变体包含氨基酸取代基D6E和A165G或D6L和A165G。
在另外特别的实施方案中，本发明的变体在位6、26和165包含氨基酸取代，对应于SEQ ID NO:1的1至220位，更优选在每个位置上被上述氨基酸取代。
可以使用基因工程技术或重组DNA，例如通过定向诱变使野生型FSA酶的编码序列突变，来获得在FSA的野生型多肽序列中引入的本文所述的氨基酸取代。通过化学合成核苷酸序列获得的核苷酸，该核苷酸序列编码带有所述氨基酸取代的本发明的变体的序列。
因此，本发明的FSA变体可以例如但不限于在体外合成。例如，通过固相肽的合成或重组DNA方法。本发明的变体可以以重组方式产生，包括其作为成熟肽或包括信号肽的前蛋白的产生。
本发明的另一方面涉及编码本发明的变体的分离的核酸序列，以下称为“本发明的核苷酸序列”。
由于遗传密码的简并性，各种核苷酸序列可以编码相同的氨基酸序列。
根据本发明，分离的“核酸分子”、“核苷酸序列”、“核酸序列”或“多核苷酸”是已经从其天然培养基中去除的核酸分子(多核苷酸)(即已经被(包括人类操作)，并且可以包括DNA、RNA或DNA或RNA衍生物，包括cDNA。本发明的核苷酸序列可以或可以不经过化学或生物化学修饰，并且可以通过克隆和选择方法或通过测序人工获得。
本发明的核酸序列可以编码成熟多肽或由与必须随后被加工的成熟酶连接的信号肽组成的前蛋白。
本发明的核苷酸序列还可以包含其他元件，例如内含子、3'和/或5'端的非编码序列、核糖体结合位点、限制性酶切位点等。该核苷酸序列还可以包括可用于纯化或稳定所编码肽的其他氨基酸的编码序列。
本发明的核酸序列可以包含在遗传构建物中，优选地包含在表达载体中。所述遗传构建体还可包含一个或多个基因表达调节序列，例如启动子、增强子、调节子、终止子等。
因此，本发明的另一个方面涉及包含本发明的核酸序列的基因重组体，下文称为“本发明的基因构建体”。在优选的实施方案中，所述基因重建体是表达载体。
在宿主细胞中，本文所用的表述“基因重建体”、“基因构建体”或“核酸构建体”涉及转移并优选表达目的基因所需的功能单元，本文中描述了本发明的核苷酸序列。该基因构建体优选还包含调节或控制序列，包括例如可操作地连接至编码蛋白质的序列的启动子、增强子、终止子等。它是指单链或双链核酸分子，其是从天然基因中分离出来的，或者被修饰成含有核酸片段的方式，使得它们在自然界中是不存在的。当核酸的构建体包含表达编码序列所需的控制序列时，表达“核酸构建体”与表达“表达盒”同义。
优选地，本发明的基因重建体进一步包含与本发明的核酸序列可操作连接的启动子。该启动子可以是但不限于组成型或诱导型启动子。作为表达本发明的核酸序列的启动子，可以使用通常用于大肠杆菌中的异源蛋白质的生产的启动子，例如强力启动子，例如T7启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、PL启动子，可以包括在构建体中。
优选地，本发明的基因重建体还包含终止子。这种终止子的实例包括但不限于T7终止子、fd噬菌体终止子、T4终止子、四环素抗性基因终止子、大肠杆菌trpA基因终止子等。
术语“表达载体”，也称为“表达构建体”或“质粒”，涉及线性或环状的DNA分子，其包含可操作地连接至提供编码的肽的转录子的其他区段的本发明的核酸序列。通常，质粒用于在靶细胞中引入特定基因。一旦表达载体进入细胞内部，由基因编码的蛋白质优选通过细胞转录和翻译机制的核糖体复合物产生。经常对质粒进行工程改造以使其包含调控序列，所述调控序列充当增强子和启动子区域，从而导致表达载体上携带的基因的有效转录。设计良好的表达载体的目的是产生大量稳定的信使RNA，并因此产生蛋白质。表达载体是生物技术和蛋白质(例如酶)生产的基本工具。将本发明的表达载体引入宿主细胞中，使得该载体保持为染色体组成或作为染色体外自我复制载体。
术语“表达”涉及从多核苷酸合成多肽的过程。该术语包括信使RNA(mRNA)中多核苷酸的转录和所述mRNA转化为蛋白质或多肽的翻译。
表达载体的实例是但不限于噬菌体、粘粒、噬菌粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、人类人工染色体(HAC)或病毒载体，例如腺病毒、逆转录病毒或慢病毒。
用于***本发明的多核苷酸的合适的表达载体优选是用于在原核生物中蛋白质表达的质粒，例如通过下面例子的形式：pUC18，pUC19，Bluescript及其衍生物，mp18，mp19，pBR322，pMB9，Co1E1，pCR1，RP4，pET质粒，噬菌体和“启动子”载体，例如pSA3和pAT28；酵母表达载体，例如酿酒酵母的2微米质粒，整合质粒，YEP载体，着丝粒质粒等；在昆虫细胞中的表达载体，例如pAC和pVL系列的载体；植物细胞中的表达载体，例如piBi，pEarleyGate，PAVA，pCAMBIA，PGSA，PGWB，PMDC，PMY，孔系列等，以及用于真核细胞的其他蛋白质表达质粒，包括足以进行细胞转染的杆状病毒。
为了选择包含本发明的基因再生体的转化体，所述基因重组体优选包含标记，例如氨苄青霉素抗性基因。这样的质粒是可商购的并且具有强大的启动子(pUC系列(TakaraS buzo)、pPROK系列(Clontech)、pKK233-2(Clontech)等)。或者，标记物可以是其他药物抗性基因，例如卡那霉素，新霉素或氯霉素抗性基因，或荧光基因，例如荧光素酶，GFP，mCherry等。或者标记可以是营养缺陷的遗传标记。
可以使用现有技术中的任何已知方法来制备本发明的变体，例如，修饰编码SEQID NO:1的FSA酶的DNA序列，修饰的DNA序列在适当的宿主细胞中的转化和修饰的DNA序列的表达以形成突变体或变体酶。
因此，本发明的另一方面涉及包含本发明的核酸序列或本发明的基因发育体的宿主细胞，以下称为“本发明的宿主细胞”。
在本说明书中使用的术语“宿主细胞”涉及表达载体，克隆载体或任何其他外源核酸分子的接受者的任何原核或真核细胞。因此，该术语包括可以通过引入天然不包含在其中的核酸而被修饰的任何可培养细胞。优选地，宿主细胞是其中可以表达本发明的多核苷酸，产生稳定的多肽，经过翻译后修饰并位于合适的亚细胞区室中的宿主细胞。合适的宿主细胞的选择也可能受到检测信号的选择的影响。例如，使用带有报告基因的构建体(例如lacZ、萤光素酶、胸苷激酶或绿色荧光蛋白“GFP”)可以通过响应转录调节蛋白的目标基因的转录的激活或抑制来提供可选择的信号。为了实现最佳选择或筛选，必须考虑宿主细胞的表型。
本发明的宿主细胞可以是但不限于细菌细胞、放线菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞。适于用本发明的核酸序列或本发明的基因构建体转化的细菌细胞是例如埃希氏菌、假单胞菌、棒状杆菌、芽孢杆菌等细菌，并且优选使用大肠杆菌，因为使用它大量生产蛋白质的技术有很多发现。
可以培养本发明的宿主细胞以产生本发明的FSA变体。宿主细胞培养物涉及体外维持和生长宿主细胞的过程。细胞培养除了需要有足够的营养以允许细胞存活和***外，还需要控制温度、pH值、气体(氧气和二氧化碳)的比例等条件。细胞培养可以在固体底物如琼脂上进行，也可以在液体培养基中进行，该液体培养基可以悬浮培养大量细胞。
本发明的宿主细胞的培养可以在本领域通常使用的培养基中进行，例如，包含碳源、氮源、无机盐、痕量金属盐、维生素等的培养基。
因此，本发明的另一方面涉及本发明的宿主细胞在生产本发明的变体中的用途。
因此，本发明的宿主细胞在适当的培养基中培养，并且本发明的FSA变体在培养基和细胞或两者中的任何一种中积累。
通过向培养基中加入适量的对整合在本发明基因构建体中的启动子起反应的诱导剂，可以增加重组基因在宿主细胞中的表达。例如，当用lac启动子构建基因重建体时，在下游连接有目标基因，可以适当地添加IPTG，或者也可以适当地添加半乳糖。
在培养后，可以通过例如离心回收宿主细胞。由于大多数FSA酶存在于细胞中，因此可以通过破坏或裂解宿主细胞来溶解变体。超声波破坏、法国压榨破坏或玻璃珠破坏可用于破坏宿主细胞。在裂解细胞的情况下，可以采用使用溶菌酶、肽酶或其适当组合的方法。
之后，可以纯化本发明的变体。在说明书中使用的术语“纯化”涉及本发明的变体的分离及其浓度，而不考虑培养基中存在的其他多肽。本发明的FSA变体的分离或纯化可以例如使用差示溶解度技术、色谱法、电泳或等电聚焦进行。色谱技术可以基于分子量、离子电荷(基于氨基酸在工作条件下的电离状态)、蛋白质对某些基质或色谱柱的亲和力，或通过纯化标签进行，并且可以例如在圆柱上、纸上或板上进行。酶变体的分离或纯化可以例如通过用硫酸铵沉淀，凝胶过滤色谱法，离子交换色谱法，疏水色谱法，羟基磷灰石色谱法，快速蛋白液相色谱法(FPLC)或高效液相色谱(HPLC)进行，同时使用可大大减少纯化时间并提高纯化效率的自动化***。
当纯化源自本发明宿主细胞的本发明的FSA变体时，尽管通过使用酶溶解溶液作为起始原料来纯化变体，但是如果残留有未破坏或未溶解的残渣，则将其再离心并除去任何沉淀的残留物对纯化是有利的。
本发明的另一方面涉及本发明的变体或本发明的宿主细胞作为用于羟醛缩合碳连接反应(即用于立体选择性C-C键形成)的生物催化剂的用途。
本发明的变体可以直接或以包含(表达)它的微生物的形式添加到反应介质中，只要它催化羟醛缩合碳连接反应即可。因此，本发明的变体可以例如作为游离酶，作为固定化酶，作为表达它的全细胞或作为表达它的固定化全细胞添加到反应中。
术语“固定的”是指本发明的变体或本发明的宿主细胞与表面偶联，即它在表面上(通过任何连接分子直接连接或连接)或表面被其包被。所述表面可以是例如固体或半固体载体、基质、板、颗粒、优选纳米颗粒、凝胶、生物聚合物、豆类等。
包含要添加到反应培养基中的本发明的变体的添加剂可以包括培养基(已去除细胞的培养基)，细胞(包括培养的细胞和洗涤的细胞两者)，通过破碎或裂解，组合物包含通过纯化从上述培养基和/或细胞(粗酶溶液，纯化的酶)等中衍生而来的本发明的活性FSA变体。
例如，当用产生本发明的变体的整个宿主细胞生产羟醛缩合碳连接反应时，可以在宿主细胞温育期间将羟醛缩合反应的底物直接添加到培养液中。可将与培养液分离的宿主细胞，洗涤的细胞或经破碎或裂解处理的细胞添加到反应混合物中，或者从处理后的细胞中回收本发明的FSA变体，并可以将其作为粗酶溶液添加或纯化的酶加入反应混合物中。即，包含本发明的变体的任何形式的级分都可以用于根据本发明的羟醛缩合碳连接反应。
在优选的实施方案中，羟醛缩合碳连接反应发生在两个醛之间或在醛和酮之间。
更优选地，所述醛选自：2-氯乙醛(或氯乙醛)、甲醛、苄氧基乙醛、丙醛、戊醛、异戊醛、乙醛(或乙醛)、丁醛、羟醛或N-Cbz-氨基醛。羟醛的实例是3-羟基丙醛、R-3-羟基丁醛或S-3-羟基丁醛。N-Cbz-氨基醛的实例是N-Cbz-3-氨基丙醛或N-Cbz-glycinal。
在另外优选的实施方案中，酮选自：丙酮、丁酮、环丁酮、环戊酮或3-戊酮。
本发明的另一方面涉及一种用于羟醛缩合碳连接的方法，以下称为“本发明的方法”，其包括以下步骤：
a.在本发明的变体或本发明的宿主细胞存在下使两种醛或醛和酮反应，和
b.回收在步骤(a)中进行的反应产物。
在本发明方法的优选实施方案中，步骤(a)中的反应在25℃或更低的缓冲水溶液中进行。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，通过以下方法之一在步骤(b)中回收步骤(a)中进行的反应的产物：在二氧化硅或疏水聚合物载体上或在活性炭或硅藻土与活性炭的混合物上，或使用制备型正相或反相HPLC或液-液萃取，或其任何组合。
更优选地，本发明方法中的醛选自：2-氯乙醛(或氯乙醛)、甲醛、苄氧基乙醛、丙醛、戊醛、异戊醛、乙醛(或乙醛)、丁醛、羟基醛或N-Cbz-氨基醛。羟基醛的实例是3-羟基丙醛、R-3-羟基丁醛或S-3-羟基丁醛。N-Cbz-氨基醛的实例是N-Cbz-3-氨基丙醛或N-Cbz-glycinal。
在另外优选的实施方案中，本发明方法中的酮选自：丙酮、丁酮、环丁酮、环戊酮或3-戊酮。
在本发明的具体实施方案中，醛是3-羟基丙醛，酮是丙酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6H。
在另外特别的实施方案中，醛是S-3-羟基丁醛，酮是丙酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6H。
在另外特别的实施方案中，醛是R-3-羟基丁醛，酮是丙酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6H。
在另外特别的实施方案中，醛是苄氧基乙醛，酮是丙酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6Q。
在另外特别的实施方案中，醛是S-3-羟基丁醛，酮是环丁酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6H。
在另外特别的实施方案中，醛是S-3-羟基丁醛，酮是环戊酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6H。
在另外特别的实施方案中，x醛为苄氧基乙醛，酮为环丁酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6Q。
在另外特别的实施方案中，醛是N-Cbz-3-氨基丙醛，酮是丙酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6N。
在另外特别的实施方案中，醛是N-Cbz-glycinal，酮是丙酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6T。
在另外特别的实施方案中，醛是N-Cbz-3-氨基丙醛，酮是丁酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6E。
在另外特别的实施方案中，醛是N-Cbz-glycinal，酮是丁酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6T。
在另外特别的实施方案中，醛是N-Cbz-3-氨基丙醛，酮是3-戊酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6E。
在另外特别的实施方案中，醛是N-Cbz-glycinal，酮是3-戊酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6T。
在另外特别的实施方案中，醛是N-Cbz-3-氨基丙醛，酮是环丁酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6L。
在另外特别的实施方案中，醛是N-Cbz-3-氨基丙醛，酮是环戊酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6L。
在另外特别的实施方案中，醛是N-Cbz-glycinal，酮是环戊酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6Q。
本发明的变体对两种醛的单次加成(选择性单次加成)是完全选择性的(单次加成中的选择性大于99.99％)。
因此，在另外特别的实施方案中，羟醛缩合碳连接反应发生在两个醛之间，其中一个醛是乙醛，另一个醛是3-羟基丙醛，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6L和A165G。
在另外特别的实施方案中，羟醛缩合碳连接反应发生在两个醛之间，其中一个醛是乙醛，另一个醛是S-3-羟基丁醛，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6H。
在另外特别的实施方案中，羟醛缩合碳连接反应发生在两个醛之间，其中一个醛是乙醛，另一个醛是R-3-羟基丁醛，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6H。
在另外特别的实施方案中，羟醛缩合碳连接反应发生在两个醛之间，其中一个醛是乙醛，另一个醛是N-Cbz-3-氨基丙醛，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6E和A165G。
在另外特别的实施方案中，羟醛缩合碳连接反应发生在两个醛之间，其中一个醛为甲醛，另一个醛为丙醛，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6Q。
在另外特别的实施方案中，羟醛缩合碳连接反应发生在两个醛之间，其中一个醛是乙醛，另一个醛是2-氯乙醛，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6N或D6H。
在另外特别的实施方案中，醛是丙醛，酮是丙酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6E。
在另外特别的实施方案中，醛是丁醛，酮是丙酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6E。
在另外特别的实施方案中，醛是戊醛，酮是丙酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6E。
在另外特别的实施方案中，醛是异戊醛，酮是丙酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6E。
在另外特别的实施方案中，羟醛缩合碳连接反应发生在两个醛之间，其中两个醛都是丙醛，并且本发明的变体包含氨基酸取代基D6A和T26I。
在另外特别的实施方案中，羟醛缩合碳连接反应发生在两个醛之间，其中两个醛都是丁醛，并且本发明的变体包含氨基酸取代D6A和T26L。
在本发明最优选的实施方案之一中，醛是N-Cbz-3-氨基丙醛，酮是丙酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代D6N。
在本发明的另一个最优选的实施方案中，醛是3-羟基丙醛，酮是丙酮，并且本发明的变体包含氨基酸取代D6H。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，该方法在该方法结束时还包括另外的步骤c)，其包括步骤(b)中获得的产物的环化反应。更优选地，当步骤(b)中获得的产物包含胺基时，该环化反应包括还原性胺化。替代地，本发明的方法的该附加步骤可以是步骤a')，其发生在步骤(a)和(b)之间。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践中。在整个说明书和权利要求书中，单词“包括”及其变化形式并不意图排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。通过阅读说明书，本发明的其他目的，优点和特征对于本领域技术人员将变得显而易见，或者可以通过实施本发明而获悉。通过举例的方式提供了以下实施例和序列表，而无意于限制本发明。
发明详述
以下实施例显示了由本发明的FSA变体催化的示例性反应。
实施例1.将丙酮(1a)加到羟醛中的一般步骤.
反应在50mL螺旋盖锥形底部聚丙烯管中进行。方法1.向在纯水(12.8mL)中的酶溶液(3mg mL-1)中加入1M三乙醇胺缓冲液，pH 8(1mL)。向该溶液中加入醛(80mM，3.2mL的500mM储备水溶液)和丙酮(3mL)。方法2.向在纯水(16mL)中的酶溶液(3mg mL-1)中加入1M三乙醇胺缓冲液，pH 8(1mL)。向该溶液中加入溶于丙酮(3mL)的苄氧基乙醛(80mM)。对于这两种方法：总反应体积为20mL。将反应混合物在25℃摇动(1000rpm)24小时。之后，用MeOH(30mL)终止反应以沉淀酶。方法1.将混合物通过硅藻土过滤，将MeOH蒸发并将含水残余物冻干。方法2。将混合物通过活性炭过滤，蒸发MeOH，并将反应冻干。
实施例1.1.
2-甲基四氢-2H-吡喃-2,4-二醇(3bα(2S,4R),3bβ(2R,4R)和(R)-4,6-二羟基己-2-酮(3a)：按照上述方法(方法1)，以端基异构体(3bα和3bβ)的混合物并与无环前体(3)平衡(慢)的形式得到该化合物。经过足够的时间后，可以发现3bβ是主要产品。使用3-羟基丙醛(2a)(1.6mmol)和FSA D6H。产物通过硅胶柱色谱纯化，并用CHCl3：MeOH从1：0到93：7的梯度洗脱，得到50.0mg(32％)的混合物(3bα：3bβ：3.[α]D20＝–24.2(在MeOH中c＝1.07)；(3bα)：1H NMR(500MHz,CD3OD)δ3.94(m,2H),3.66(ddd,J＝11.6,5.3,1.8Hz,1H),3.58(ddd,J＝12.8,11.4,2.3Hz,1H),2.05(ddd,J＝12.6,4.8,2.1Hz,1H),1.82(ddt,J＝10.4,4.6,2.2Hz,1H),1.41(m,1H),1.37(s,3H),1.28(m,1H).13C NMR(126MHz,CD3OD)δ100.8,65.0,60.6,45.9,35.6,23.9.(3bβ)：1H NMR(400MHz,CD3OD)δ3.99(m,1H),3.56(m,1H),3.49(m,1H),2.09(m,1H),2.06(m,1H),1.71(m,1H),1.65(m,1H),1.33(s,3H).13C NMR(126MHz,CD3OD)δ96.3,65.1,57.8,46.0,38.3,24.3.打开式3：1H NMR(500MHz,CD3OD)δ4.25–4.12(m,1H),4.00–3.85(m,2H),2.61(dd,J＝6.4,2.8Hz,2H),2.18(s,3H),1.74–1.62(m,2H).13CNMR(101MHz,CD3OD)δ210.5,66.4,59.8,51.9,40.6,30.6.ESI-TOF：[M+Na]+C6H12O3Na的计算值：155.0684,测定值155.0689。
实施例1.2.
(2R,4R,6S)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2,4-二醇(4)：按照上述步骤(方法1)获得该化合物。使用S-3-羟基丁醛(S-2b)(1.6mmol)和FSA D6H。产物通过硅胶柱色谱纯化，并用CHCl3：MeOH从1：0到95：5的梯度洗脱，得到60.7mg(25％)4[α]D20＝–58.8(在MeOH中c＝1.12)；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ3.96(tt,J＝11.2,4.7Hz,1H),3.67(ddd,J＝11.5,6.4,2.1Hz,1H),2.03(ddd,J＝12.5,4.8,1.9Hz,1H),1.89(ddt,J＝12.3,4.4,2.1Hz,1H),1.29(s,3H),1.25(dd,J＝12.5,11.2Hz,1H),1.17(d,J＝6.3Hz,3H),1.05(dd,J＝12.3,11.4Hz,1H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ66.5,65.2,45.3,43.0,24.1,21.7.ESI-TOF：[M+Na]+C7H14O3Na的计算值：169.0840,测定值169.0837。
实施例1.3.
(2S,4R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2,4-二醇(5)：按照上述步骤(方法1)获得该化合物。使用(R)-3-羟基丁醛(R-2b)(1.6mmol)和FSA D6H。产物通过硅胶柱色谱纯化，并用1:0至95:5的CHCl3:MeOH的逐步梯度洗脱，得到21.2mg(10％)5.[α]D 20＝+11.1(在MeOH中c＝0.36)；1H NMR(500MHz,CD3OD)δ4.03(m,1H),4.04(m,1H),1.93(ddd,J＝14.4,2.9,2.1Hz,1H),1.73(ddt,J＝13.7,3.2,2.2Hz,1H),1.70–1.65(m,1H),1.48–1.39(m,1H),1.30(s,3H),1.20(d,J＝6.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ100.0,64.7,60.8,39.8,38.8,22.9,20.1.ESI-TOF：[M+Na]+C7H14O3Na的计算值：169.0840,测定值169.0842。
实施例1.4.
5-(苄氧基)-4-羟基戊-2-酮(6)：按照上述步骤(方法2)获得该化合物。使用了苄氧基乙醛(2c)(240μL，1.6mmol)和FSA D6Q。24小时后，添加了额外的FSA D6Q(3mg ml-1)，并将反应在25℃下摇动(1000rpm)24小时。产物通过硅胶柱色谱法纯化，并用己烷：AcOEt从1：0到1：1的逐步梯度洗脱，得到256mg(77％)的6.[α]D 20＝–5.29(在MeOH中c＝1.26)；HPLC：30分钟内B的含量为10％至100％，tR＝16min；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.45–7.10(m,5H),4.53(d,J＝1.9Hz,2H),4.27–4.17(m,1H),3.50–3.37(m,2H),2.72–2.54(m,2H),2.16(s,3H).13CNMR(101MHz,CD3OD)δ210.1,138.4,127.9,127.4,127.2,75.0,74.3,67.8,49.6,30.7。
实施例2.扩大羟丁醛中羟丙基环丁酮和环戊酮的羟醛添加量.
一般程序：
反应在50mL螺旋盖的锥形底部聚丙烯管中进行。方法1.向在纯水(14.8mL)中的酶(3mg mL-1)溶液中加入1M三乙醇胺缓冲液，pH 8(1mL)。向该溶液中，添加醛(80mM，3.2mL的500mM水溶液)和酮(1mL)。方法2.向在纯水(18mL)中的酶(3mg mL-1)溶液中添加1M三乙醇胺缓冲液，pH 8(1mL)。向该溶液中，添加醛(80mM)和酮(1mL)。方法1和2：总反应体积为20mL。将反应混合物在25℃摇动(1000rpm)24小时。之后，用MeOH(30mL)终止反应以沉淀酶。方法1：将混合物通过活性炭过滤。方法2将混合物通过硅藻土过滤。方法1和2：蒸发MeOH，并将反应物冻干。
实施例2.1.
(1R,3S,5R,6R)-3-甲基-2-氧杂双环[4.2.0]辛烷-1,5-二醇(7b)及其无环形式7a处于平衡状态：按照上述步骤获得该化合物(方法1)。使用(S)-3-羟基丁醛(S-2b)(1.6mmol)，环丁酮(1b)和FSA D6H。产物通过硅胶柱色谱法纯化，并用CHCl3:MeOH的梯度从1:0至95:5洗脱，得到55.3mg(22％)的7b[α]D 20＝+13.69(在MeOH中c＝2.0)；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ3.93(dt,J＝12.0,6.3Hz,1H),3.72(dqd,J＝11.1,6.3,1.4Hz,1H),2.65(ddd,J＝9.9,8.9,6.5Hz,1H),1.96–1.89(m,2H),1.73(dddd,J＝12.7,5.9,1.5,0.7Hz,1H),1.64–1.53(m,2H),1.36(dd,J＝12.6,11.4Hz,1H),1.20(d,J＝6.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ67.6,65.7,46.8,38.3,34.8,21.8,13.3.(7a)(R)-2-((1R,3S)-1,3-二羟基丁基)环丁烷-1-酮：1H NMR(400MHz,CD3OD)δ3.94(m,2H),3.39(dddd,J＝9.7,7.1,5.3,2.7Hz,1H),3.02–2.80(m,2H),2.18–2.04(m,1H),2.02–1.95(m,1H),1.71(m,1H),1.55–1.48(m,1H)1.18(d,J＝1.7Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ68.4,67.5,65.1,45.6,45.1,24.3,14.3.ESI-TOF：[M+Na]+C8H14O3Na的计算值：181.0840，测定值181.0843。
实施例2.2.
(2S,4R,4aR,7aR)-2-甲基六氢环戊[b]吡喃-4,7a(2H)-二醇(8)：按照上述步骤(方法1)获得该化合物。使用(S)-3-羟基丁醛(S-2b)(1.6mmol)，环戊酮(1c)和FSA D6H。产物通过硅胶柱色谱纯化，并用CHCl3：MeOH从1：0到95：5的逐步梯度洗脱，得到22.6mg(8％)的8.[α]D 20＝–2.03(c＝1.49，在MeOH中)；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ4.05(dt,J＝11.8,5.4Hz,1H),3.71(dqd,J＝12.7,6.3,2.1Hz,1H),2.20(h,J＝5.6Hz,1H),1.94–1.86(m,1H),1.78–1.57(m,6H),1.43–1.30(m,1H),1.18(d,J＝6.3Hz,3H).13C NMR(126MHz,CD3OD)δ109.5(d,J＝9.0Hz),65.9,65.6,47.1,35.6,34.6,21.6,20.3,19.4.ESI-TOF：[M+Na]+C9H16O3Na计算值：195.0997,测定值195.0991。
实施例2.3.
(R)-2-((S)-2-(苄氧基)-1-羟基乙基)环丁-1-酮(9a)(75％).按照上述步骤(方法2)获得该化合物。使用了苄氧基乙醛(2c)(1.6mmol)，环丁酮(1b)和FSA D6Q。产物通过硅胶柱色谱法纯化，并用1:0至3:7的己烷:AcOEt阶梯梯度洗脱，得到46.0mg(13％)产物。HPLC：30分钟内B的含量为10％至100％，tR＝18min；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.38–7.26(m,5H),4.53(s,2H),3.92(dt,J＝6.5,5.0Hz,1H),3.59(dd,J＝9.8,6.6Hz,1H),3.55(m,1H),3.53(m,1H),2.93(ddd,J＝10.1,7.7,2.7Hz,1H),2.88(ddd,J＝9.8,6.2,2.5Hz,1H),2.15–1.96(m,2H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ212.0,139.6,129.3,128.9,128.7,74.3,73.5,70.3,64.1,45.8,13.9.辅助(R)-2-((R)-2-(苄氧基)-1-羟基乙基)环丁-1-酮(9b)(25％)：1HNMR(400MHz,CD3OD)δ7.38-7.26(m,5H),4.53(s,2H),4.05(dt,J＝6.3,5.0Hz,1H),3.47(dd,J＝9.0,5.2,1H),3.40(dd,J＝9.8,6.3,1H),3.05(m,1H),2.81(m,1H),2.15-1.96(m,2H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ212.3,139.6,129.3,128.9,128.7,74.3,73.6,69.1,64.3,46.0,13.1.ESI-TOF：[M+Na]+C13H16O3Na计算值：243.0997,测定值243.0990。
实施例3.扩大向羟醛中添加乙醛(1d)的醛醇缩合反应.
一般程序：
反应在50mL螺旋盖的锥形底部聚丙烯管中进行。向在纯水(15.7mL)中的酶(3mgmL-1)溶液中添加1M三乙醇胺缓冲液，pH 8(1mL)。向该溶液中添加醛(80mM，3.2mL的500mM储备水溶液)和乙二醛(5％，1mL，使用亲电试剂2a，或100mM，112μL，使用亲电试剂2b)。总反应体积为20mL。将反应混合物在25℃摇动(1000rpm)24小时。此后，用MeOH(30mL)终止反应，以沉淀酶，并将混合物通过活性炭过滤。蒸发MeOH，并将反应冻干。
实施例3.1.
(2S,4R)-四氢-2H-吡喃-2,4-二醇(10α-异构体)和(2R,4R)-四氢-2H-吡喃-2,4-二醇(7a)(10β-异构体)：按照上述步骤将这些化合物制成混合物(≈1：1)。使用3-羟基丙醛(2a)(1.6mmol)和FSA D6L/A165G。产物用硅胶柱色谱法纯化，用CHCl3:MeOH从1:0至95:5的逐步梯度洗脱，得到41.5mg(22％)10α:10β.[α]D 20＝–2.93(在MeOH中c＝0.62).(10α-异构体)：1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.15(dd,J＝4.4,3.1Hz,1H),4.06(dd,J＝8.4,4.4Hz,1H),3.87(dd,J＝8.8,3.2Hz,1H),3.72(dd,J＝5.6,4.3Hz,1H),1.85–1.76(m,2H),1.58(ddd,J＝12.9,8.5,3.1Hz,1H),1.49(ddd,J＝12.9,8.6,4.1Hz,1H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ91.9,63.1,58.6,39.6,33.9.(10β-异构体)：1H NMR(400MHz,CD3OD)δ4.61(dd,J＝9.0,2.2Hz,1H),3.98–3.93(m,1H),3.72(m,1H),3.40(td,J＝11.9,2.5Hz,1H),2.07(ddt,J＝12.1,4.2,2.0Hz,1H),1.77(m,1H),1.39(m,1H),1.29(m,1H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ94.2,66.0,61.1,41.8,34.1.ESI-TOF：[M+2Na]+C5H10O3Na2计算值：165.0503，测定值165.0507。
实施例3.2.
(2S,4R,6S)-6-甲基四氢-2H-吡喃-2,4-二醇(11α-异构体)(2R,4R,6S)-6-甲基四氢-2H-吡喃-2,4-二醇(11β-异构体)。按照上述步骤将这些化合物制成混合物(≈1：1)。使用S-3-羟基丁醛(S-2b)(1.6mmol)和FSA D6H。用硅胶柱色谱法纯化产物，并用1:0至95:5的CHCl3:MeOH的逐步梯度洗脱，得到57.1mg(27％)的11α：11β.[α]D 20＝–15.68(在MeOH中c＝0.19).(11α-异构体)：1H NMR(400MHz,CD3OD)δ4.65(dd,J＝9.7,2.1Hz,1H),3.80–3.70(m,1H),3.52(ddd,J＝11.2,6.3,2.0Hz,1H),2.09(ddt,J＝12.0,4.3,2.0Hz,1H),1.86(ddt,J＝12.4,4.2,1.9Hz,1H),1.22(d,J＝6.2Hz,3H),1.12–1.00(m,2H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ92.0,67.9,66.0,41.7,41.6,20.2.(11β-异构体)：1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.29(d,J＝3.6Hz,1H),4.17–3.98(m,2H),2.02–1.90(m,3H),1.40(ddd,J＝12.4,11.4,3.6Hz,1H),1.16(d,J＝6.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ93.9,63.5,62.6,42.5,39.2,20.4.ESI-TOF：[M+H]+C6H13O3计算值：133.0864，测定值133.0860。
实施例3.3.
(2S,4R,6R)-6-甲基四氢-2H-吡喃-2,4-二醇(12α-异构体)(2R,4R,6R)-6-甲基四氢-2H-吡喃-2,4-二醇(12β-异构体).按照上述步骤，这些化合物以α：β异构体≈4：1的混合物形式获得。使用R-3-羟基丁醛(R-2b)(1.6mmol)和FSA D6H。用硅胶柱色谱法纯化产物，并用1:0至95:5的CHCl3:MeOH的逐步梯度洗脱，得到28.7mg(14％)产物12α：12β.[α]D 20＝–8.5(在MeOH中c＝1.7)；(12α-异构体)1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.02(dd,J＝9.9,2.2Hz,1H),4.17(t,J＝3.0Hz,1H),3.99(dqd,J＝12.6,6.3,2.2Hz,1H),1.83(ddt,J＝13.5,3.1,2.1Hz,1H),1.63–1.55(m,1H),1.43(ddd,J＝13.3,9.9,3.0Hz,1H),1.38–1.30(m,1H),1.15(d,J＝6.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ91.7,66.4,64.8,39.0,39.0,20.3.(12β-异构体)1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.14(t,J＝3.0Hz,1H),4.36(ddd,J＝10.8,6.5,2.8Hz,1H),4.11–4.08(m,1H),1.77(td,J＝3.4,2.9,1.4Hz,1H),1.76–1.69(m,1H),1.53–1.48(m,1H),1.15(d,J＝6.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ92.1,64.2,59.5,39.3,35.5,20.1.ESI-TOF：[M+H]+C6H13O3计算值：133.0864，测定值133.0865。
实施例4.扩大向N-Cbz-氨基醛中添加丙酮、2-丁酮、3-戊酮、环丁酮和环戊酮的醛醇缩醛的规模。
一般程序：
反应在50mL螺旋盖的锥形底聚丙烯管(Falcon管)中进行。向在纯水(16mL或18mL)中的酶溶液(3mg mL–1)中添加1M pH 8的三乙醇胺缓冲液(1mL)。向该溶液中加入溶于酮(3mL丙酮，其余1mL)中的醛(80mM)。总反应体积为20mL。将反应混合物在25℃摇动(1000rpm)24小时。之后，用MeOH(30mL)终止反应以沉淀酶。然后，将混合物通过硅藻土过滤，将MeOH蒸发，并将含水残余物冻干、纯化、表征并进行还原胺化。
分子内还原胺化
通用程序：将羟醛加合物(终浓度为3mM)溶于H2O:MeOH 1:1(70mL)，然后添加Pd/C(60mg)。将混合物在H2(2.5atm)下在室温下摇动过夜。之后，将反应过滤，并将溶剂蒸发。产物无需进一步纯化即可表征。
实施例4.1.
(R)-N-Cbz-6-氨基-4-羟基己-2-酮(13)：按照上述步骤获得该化合物。使用N-Cbz-3-氨基丙醛(2d)(331.2mg，1.6mmol)和FSA D6N。24小时后，加入额外的FSA D6N(3mgml-1)，并将反应在25℃摇动(1000rpm)24小时。产物通过硅胶柱色谱法纯化，并用1:0至3:7的己烷:AcOEt阶梯梯度洗脱，得到266.2mg(85％)的标题化合物。[α]D 20＝+10.74(在MeOH中c＝2.1)；HPLC：30分钟内B的含量为10％至100％，tR＝16min；手性HPCL：tR＝25min(外消旋体：tR(R)＝25min,tR(S)＝30min)；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.45–7.18(m,5H),5.07(s,2H),4.19–3.99(m,1H),3.23(t,J＝7.0Hz,2H),2.59(d,J＝6.4Hz,2H),2.15(s,3H),1.76–1.47(m,2H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ210.4,159.0,138.4,129.4,128.9,128.8,67.4,66.5,51.7,38.6,38.2,30.6。
分子内还原胺化反应产生：(2R,4R)-2-甲基哌啶-4-醇(14)：1H NMR(400MHz,CD3OD)δ3.77(tt,J＝11.0,4.5Hz,1H),3.41–3.33(m,1H),3.25–3.14(m,1H),2.97(td,J＝13.4,3.0Hz,1H),2.09(tdd,J＝13.3,4.7,2.5Hz,2H),1.55(tdd,J＝13.7,11.0,4.5Hz,1H),1.39(dd,J＝13.1,11.3Hz,1H),1.32(d,J＝6.6Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ65.2,51.4,42.3,39.5,30.9,18.0.ESI-TOF：[M+H]+C6H14NO计算值：116.1075,测定值116.1077。
实施例4.2.
(S)-N-Cbz-5-氨基-4-羟基戊-2-酮(15)：按照上述步骤获得该化合物。使用N-Cbz-甘氨酸(2e)(310.4mg，1.6mmol)和FSA D6T。产物通过硅胶柱色谱法纯化，并用1:0至3:7的己烷:AcOEt阶梯梯度洗脱，得到114.8mg(29％)产物。[α]D 20＝+3.4(在MeOH中c＝1.9)；HPLC：30分钟内B的含量为10％至100％，tR＝15min；Chiral HPCL：tR＝31min(外消旋体：tR(R)＝31min,tR(S)＝28min)；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.34(d,J＝6.0Hz,5H),5.08(s,2H),4.18–4.04(m,1H),3.16(dd,J＝5.8,1.4Hz,2H),2.64–2.52(m,2H),2.15(s,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ209.9,159.1,138.3,129.4,129.0,128.8,126.3,68.0,67.5,48.4,47.4,30.6。
分子内还原胺化反应产生两种非对映异构体，其比率为70:30。主要：(3S,5R)-5-甲基吡咯烷-3-醇(16).1H NMR(400MHz,CD3OD)δ4.41–4.31(m,1H),3.22(p,J＝7.0,7.0,6.9,6.9Hz,1H),2.92(dd,J＝12.2,1.5Hz,1H),2.87(dd,J＝12.2,4.9Hz,1H),2.27(ddd,J＝13.5,7.8,6.5Hz,1H),1.32(dddd,J＝13.6,7.8,3.7,1.2Hz,1H),1.27(d,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ71.8,54.5,54.0,42.1,19.3.次要:(3S,5S)-5-甲基吡咯烷-3-醇(17).1H NMR(400MHz,CD3OD)δ4.41–4.29(m,1H),3.45(dp,J＝10.0,6.5,6.5,6.4,6.4Hz,1H),3.27(dd,J＝12.1,5.2Hz,1H),2.83–2.74(m,1H),1.92(ddt,J＝13.4,6.2,1.4,1.4Hz,1H),1.48(ddd,J＝13.4,10.0,5.8Hz,1H),1.20(d,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ71.5,54.0,52.9,42.8,18.3.ESI-TOF：[M+H]+C5H12NO计算值：102.0919,测定值102.0210。
实施例4.3.
主要区域异构体:(3S,4R)-N-Cbz-6-氨基-4-羟基-3-甲基己-2-酮(18)和(3S,4S)-N-Cbz-6-氨基-4-羟基-3-甲基己-2-酮(19).按照上述步骤获得该化合物。使用N-Cbz-3-氨基丙醛(2a)(1.6mmol)，丁酮(1e)和FSA D6E。产物通过硅胶柱色谱法纯化，并用从1：0至3：7的己烷：AcOEt阶梯梯度洗脱，得到213mg(48％)18+19，尽管无法在NMR光谱中指定19，并且从还原胺化中获得的产物推断出在添加羟醛中形成的百分比。[α]D 20＝+33.5(在MeOH中c＝2.1)；HPLC：30分钟内B的含量为10％至100％，tR＝18min；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.50–7.19(m,5H),5.05(s,2H),3.90(dt,J＝9.2,4.5Hz,1H),3.26–3.15(m,2H),2.67–2.53(m,1H),2.14(s,3H),1.57(tdd,J＝15.2,7.7,5.1Hz,2H),1.06(d,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ214.0,158.2,137.1,128.7,128.3,128.1,69.0,65.9,52.3,37.3,34.7,28.2,9.8.次区域异构体:(R)-N-Cbz-7-氨基-5-羟基庚-3-酮(20).产物通过制备型HPLC纯化，并用H2O:CH3CN从1:0到1:1的梯度洗脱，流速1mL min-1，并在215nm处检测，得到25mg区域异构体I:II的混合物44:56。[α]D 20＝+18.5(在MeOH中c＝0.9)；HPLC：30分钟内B的含量为10％至100％，tR＝19min；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.59–7.17(m,5H),5.07(s,2H),4.09(dt,J＝8.2,4.0Hz,1H),3.24(q,J＝7.0,6.4Hz,2H),2.59–2.54(m,2H),2.49(qd,J＝7.3,1.8Hz,2H),1.76–1.60(m,2H),1.01(t,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ212.7,159.0,138.5,129.2,128.9,128.8,66.2,65.3,49.1,36.8,36.1,34.6,6.43。
区域异构体18+19的分子内还原胺化反应产生两个非对映异构体21和22，其比率为87:13。主要:(2R,3R,4R)-2,3-二甲基哌啶-4-醇(21)：1H NMR(400MHz,CD3OD)δ3.36–3.22(m,2H),2.96(td,J＝13.3,3.1Hz,1H),2.81(dq,J＝10.7,6.5Hz,1H),2.05(ddt,J＝13.7,5.2,2.8Hz,1H),1.71–1.56(m,1H),1.44–1.32(m,1H),1.30(d,J＝6.5Hz,3H),1.06(d,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ70.6,56.3,43.6,42.3,31.6,16.3,12.4.次要.(2S,3R,4S)-2,3-二甲基哌啶-4-醇(22)：1H NMR(500MHz,CD3OD)δ3.83(dt,J＝10.2,4.4Hz,1H),3.32–3.28(m,2H),3.24(d,J＝12.0Hz,1H),2.91–2.85(m,1H),2.05–2.02(m,1H),1.77–1.66(m,2H),1.25(d,J＝6.8Hz,3H),0.94(d,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ68.3,53.8,42.7,37.7,26.6,15.1,4.8.ESI-TOF：[M+H]+C7H16NO计算值：130.1231，测定值130.1236。
实施例4.4.
主要区域异构体：(3S,4S)-N-Cbz-5-氨基-4-羟基-3-甲基戊-2-酮(23)和(3S,4R)-N-Cbz-5-氨基-4-羟基-3-甲基戊-2-酮(24)(从Nu最取代的一面开始)。按照上述步骤获得这些化合物。使用N-Cbz-甘氨酸(1e)(1.6mmol)，丁酮和FSA D6T。产物通过硅胶柱色谱法纯化，并用1:0至3:7的己烷:AcOEt阶梯梯度洗脱，得到119.2mg(28％)的23+24。[α]D 20＝+13.0(在MeOH中c＝0.78)；HPLC：30分钟内B的含量为10％至100％，tR＝17min；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.38–7.25(m,5H),5.08(s,2H),3.99(q,J＝5.8Hz,1H),3.16(qd,J＝13.9,6.1Hz,2H),2.65(dd,J＝7.3,5.6Hz,1H),2.16(s,3H),1.10(d,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ213.6,(C＝O未检测到氨基甲酸酯和Cipso),129.4,129.0,128.9,71.6,67.5,51.2,45.8,29.0,11.0.次区域异构体(S)-N-Cbz-6-氨基-5-羟基己-3-酮(25).产物通过制备型HPLC纯化，并用H2O:CH3CN从100：0到50:50的梯度洗脱，流速1mL min-1，并在215nm处检测，得到12mg的23+25的68:32混合物。[α]D 20＝+0.15(在MeOH中c＝0.8)；HPLC:30分钟内B的含量为10％至100％，tR＝18min；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.45–7.09(m,5H),5.05(s,2H),4.09(dt,J＝11.6,5.9Hz,1H),3.17–3.10(m,2H),2.54–2.50(m,2H),2.46(q,J＝7.3Hz,2H),0.98(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ(C＝O未检测到氨基甲酸酯、羰基和Cipso),128.0,127.6,127.4,66.6,66.1,46.3,46.0,36.0,6.4。
23+24的分子内还原胺化反应产生了80：8：8：4的四种非对映异构体。主要(80％)。(3S,4R,5R)-4,5-二甲基吡咯烷-3-醇(26)：1H NMR(500MHz,CD3OD)δ3.99(td,J＝6.6,4.9Hz,1H),3.40(dd,J＝12.1,6.9Hz,1H),3.14(dq,J＝9.7,6.6Hz,1H),3.06–2.99(m,1H),1.79–1.69(m,1H),1.39(d,J＝6.6Hz,3H),1.11(d,J＝6.9Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ75.2,60.4,50.1,47.5,15.3,13.3.次要(8％)(3S,4R,5S)-4,5-二甲基吡咯烷-3-醇(27)：1H NMR(500MHz,CD3OD)δ4.15(dt,J＝4.5,2.0Hz,1H),3.98–3.90(m,1H),3.53–3.46(m,1H),3.11–3.06(m,1H),2.26–2.19(m,1H),1.31(d,J＝7.0Hz,3H),0.92(d,J＝7.5Hz,3H).13CNMR(101MHz,CD3OD)δ75.6,56.7,50.5,44.1,11.6,9.9.次要(8％)(3R,4R,5R)-4,5-二甲基吡咯烷-3-醇(28)：1H NMR(500MHz,CD3OD)δ4.24(t,J＝4.1Hz,1H),3.43–3.40(m,1H),3.38–3.33(m,1H),3.02–2.97(m,1H),1.88–1.77(m,1H),1.35(d,J＝7.1Hz,3H),1.05(d,J＝2.6Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ71.8,58.6,52.1,45.2,13.7,8.8.次要(4％)(3R,4R,5S)-4,5-二甲基吡咯烷-3-醇(29)：1H NMR(500MHz,CD3OD)δ4.30(td,J＝4.7,2.6Hz,1H),3.84–3.75(m,1H),3.35–3.27(m,1H),3.19–3.14(m,1H),2.35–2.30(m,1H),1.33(d,J＝10.8Hz,3H),1.05(d,J＝2.6Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ71.8,57.2,51.5,40.0,13.8,7.1.ESI-TOF：[M+H]+C6H14NO计算值：116.1075,测定值116.1078。
实施例4.5.
(4S,5R)-N-Cbz-7-氨基-5-羟基-4-甲基庚-3-酮(30)：按照上述步骤获得该化合物。使用了N-Cbz-3-氨基丙醛(2d)(1.6mmol)，3-戊酮和FSA D6E。产物通过硅胶柱色谱法纯化，并用1:0至3:7的己烷:AcOEt阶梯梯度洗脱，得到164.1mg(35％)的30.[α]D 20＝+36.5(在MeOH中c＝2.3)；HPLC：30分钟内B的含量为10％至100％，tR＝20min；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.45–7.17(m,5H),5.05(s,2H),3.83(ddd,J＝9.4,5.6,3.7Hz,1H),3.20(hept,J＝7.2Hz,2H),2.62(p,J＝6.8Hz,1H),2.52(qd,J＝7.2,2.0Hz,2H),1.67–1.39(m,2H),1.08(d,J＝7.0Hz,3H),0.99(t,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ215.2,157.6,137.0,128.0,127.5,127.3,69.4,65.9,51.5,37.5,34.7,34.5,10.4,6.5。
分子内还原胺化反应产生(2R,3R,4R)-2-乙基-3-甲基哌啶-4-醇(31).1H NMR(400MHz,CD3OD)δ3.27–3.25(m,2H),2.87(td,J＝13.1,2.9Hz,1H),2.56(ddd,J＝10.6,7.4,3.3Hz,1H),2.02(ddt,J＝13.3,5.1,2.8Hz,1H),1.85(dqd,J＝15.2,7.6,2.8Hz,1H),1.66–1.49(m,2H),1.38(tq,J＝10.2,6.5Hz,1H),1.05(d,J＝6.5Hz,3H),1.00(t,J＝7.6Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ73.1,62.9,44.5,43.3,34.0,25.3,13.8,9.3.ESI-TOF：[M+H]+C8H18NO计算值：144.1388,测定值144.1385。
实施例4.6.
(4S,5S)-N-Cbz-6-氨基-5-羟基-4-甲基-己-3-酮(32)和(4S,5R)-N-Cbz-6-氨基-5-羟基-4-甲基-己-3-酮(33).按照上述步骤获得这些化合物。使用了N-Cbz-甘氨酸(2e)(1.6mmol)、3-戊酮和FSA D6T。产物通过硅胶柱色谱法纯化，并用1:0至3:7的己烷:AcOEt阶梯梯度洗脱，得到134.4mg(30％)的32+33.[α]D 20＝+12.3(在MeOH中c＝1.26)；HPLC：30分钟内B的含量为10-100％，tR＝19min；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.44–7.16(m,5H),5.19–5.02(m,2H),3.92(q,J＝5.6Hz,1H),3.16–3.06(m,2H),2.64(dt,J＝12.9,6.8Hz,1H),2.51(q,J＝7.2Hz,2H),1.08(d,J＝7.0Hz,3H),0.97(t,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ214.6,157.6,136.9,128.0,127.5,127.4,70.5,66.1,49.0,44.4,34.3,10.3,6.5。化合物33在NMR中没有明确分配，但它是从还原胺化产物中观察到的结构推断出来的。
分子内还原胺化反应以≈79：8：5：8的速率产生了四个非对映异构体。主要(79):(3S,4R,5R)-5-乙基-4-甲基吡咯烷-3-醇(34).1H NMR(400MHz,CD3OD)δ3.97(q,J＝5.3Hz,1H),3.36–3.30(m,1H),3.02(dd,J＝12.0,4.5Hz,1H),2.91(tdd,J＝8.7,5.1,1.5Hz,1H),1.91–1.75(m,2H),1.72–1.61(m,1H),1.10(d,J＝7.0Hz,3H),1.03(t,J＝7.5Hz,3H).13CNMR(101MHz,CD3OD)δ75.7,66.7,50.3,46.3,25.1,14.5,9.9.次要(8):(3S,4R,5S)-5-乙基-4-甲基吡咯烷-3-醇(35).1H NMR(400MHz,CD3OD)1H NMR(400MHz,CD3OD)δ4.24(t,J＝4.1Hz,1H),3.41–3.34(m,1H),3.17–3.12(m,2H),1.89–1.82(m,2H),1.54–1.43(m,1H),1.10–1.09(m,3H),1.02–0.98(m,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ72.0,64.8,52.0,43.6,23.6,15.5,10.1.次要(5):(3R,4R,5S)-5-乙基-4-甲基吡咯烷-3-醇(36)：1H NMR(400MHz,CD3OD)δ4.14(d,J＝4.5Hz,1H),3.73–3.66(m,3H),3.49–3.44(m,2H),3.11–3.07(m,1H),2.32–2.24(m,1H),1.71–1.65(m,2H),1.04(d,J＝7.5Hz,3H),0.88(d,J＝7.5Hz,3H).13CNMR(101MHz,CD3OD)δ75.7,62.7,50.6,43.0,22.1,9.9,9.5.次要(8):(3R,4R,5R)-5-乙基-4-甲基吡咯烷-3-醇(37)：1H NMR(400MHz,CD3OD)δ4.35(q,J＝5.7Hz,1H),3.47–3.43(m,1H),3.27–3.23(m,1H),3.08–3.04(m,1H),2.38(td,J＝7.4,5.0Hz,1H),1.74–1.66(m,1H),1.06(d,J＝5.1Hz,19H),0.97(d,J＝5.2Hz,2H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ71.3,63.1,49.7,39.2,25.9,9.9,6.7.ESI-TOF：[M+H]+C7H16NO计算值：130.1231,测定值130.1234。
实施例4.7.
(R)-2-((R)-N-Cbz-3-氨基-1-羟基丙基)环丁-1-酮(38)和(R)-2-((S)-N-Cbz-3-氨基-1-羟基丙基)环丁-1-酮(39)：按照上述步骤以80:20的比例获得这些化合物。使用N-Cbz-3-氨基丙醛(2d)(1.6mmol)，环丁酮和FSA D6L。通过硅胶柱色谱法纯化产物，并用己烷:AcOEt从1:0至3:7的逐步梯度洗脱，得到201.8mg(46％)产物。[α]D 20＝+36.49(在MeOH中c＝1.82)；HPLC：30分钟内B的含量为10-100％，tR＝17min。主要(80％)(38)：1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.41–7.25(m,5H),5.06(s,2H),3.73(dt,J＝9.0,4.4Hz,1H),3.47–3.35(m,1H),3.23(t,J＝6.9Hz,2H),3.03–2.78(m,2H),2.09(qd,J＝10.3,5.9Hz,1H),1.96(td,J＝10.6,5.2Hz,1H),1.86–1.63(m,2H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ212.3,159.0,138.4,129.4,129.0,128.8,69.1,67.4,66.9,45.7,38.7,36.1,14.4。次要(20)(39)：1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.41–7.25(m,5H),5.06(s,2H),3.94–3.87(m,1H),3.21–3.10(m,1H),3.22–3.15(m,2H),3.01–2.80(m,2H),2.14–1.90(m,2H),1.71–1.52(m,2H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ212.3,159.0,138.4,129.4,129.0,128.8,67.2,67.1,66.8,45.9,38.5,36.5,13.5。发生分子内还原胺化反应(1R,2R,6R)-1,2,6-三甲基双环[4.2.0]辛烷(40).1HNMR(400MHz,CD3OD)δ3.77(dt,J＝10.7,5.7Hz,1H),3.63–3.55(m,1H),3.17(dt,J＝13.2,4.2Hz,1H),2.74(t,J＝7.1Hz,1H),2.62(ddd,J＝13.7,12.0,2.9Hz,1H),2.34–2.19(m,2H),1.96–1.78(m,2H),1.78–1.63(m,2H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ64.2,52.9,40.3,37.3,28.1,24.4,18.4.ESI-TOF：[M+H]+C7H14NO计算值：128.1075，测定值128.1070。
实施例4.8.
(R)-2-((R)-N-Cbz-3-氨基-1-羟基丙基)环戊-1-酮(41)和(R)-2-((S)-N-Cbz-3-氨基-1-羟基丙基)环戊-1-酮(42)。按照上述步骤以67:33的比例获得这些化合物。使用了N-Cbz-3-氨基丙醛(2d)(1.6mmol)，环戊酮(1c)和FSA D6L。产物通过硅胶柱色谱法纯化，并用1:0至3:7的己烷:AcOEt阶梯梯度洗脱，得到303.5mg(65％)产物。HPLC:30分钟内B的含量为10％至100％，tR＝18和19min。次要(67％)(41)：1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.41–7.17(m,5H),5.06(s,2H),3.78(ddd,J＝9.1,5.4,3.4Hz,1H),3.27–3.12(m,2H),2.35–2.21(m,2H),2.18–2.09(m,3H),1.83–1.71(m,3H),1.70–1.61(m,1H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ221.4,157.5,137.0,128.0,127.5,127.3,69.1,66.1,53.7,38.7,37.4,25.8,22.6,20.2。次要(33％)(42)：1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.41–7.17(m,5H),5.06(s,2H),4.06(ddd,J＝8.4,4.7,3.2Hz,1H),3.28–3.16(m,2H),2.28–2.18(m,1H),2.18–2.09(m,5H),1.83–1.71(m,1H),1.70–1.61(m,2H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ220.9,157.5,137.0,128.0,127.5,127.3,66.1,66.8,55.2,38.9,38.5,36.3,24.0,21.5。
分子内还原胺化反应产生四种非对映异构体，包括以15：11：15：22：37的比例的脱羟基类似物47。NMR光谱的选定信号。次要(15％):(4R,4aS,7aR)-八氢-1H-环戊[b]吡啶-4-醇(43).1H NMR(500MHz,MeOD)δ4.19(dt,J＝10.6,5.2Hz,1H),3.64(m,1H),3.36(m,1H),3.02(m,1H),2.49(m,1H),2.19–1.59(m,6H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ65.5,59.0,44.6,42.3。次要(11％):(4R,4aS,7aS)-八氢-1H-环戊[b]吡啶-4-醇(44).1H NMR(500MHz,MeOD)δ3.99(td,J＝4.7,3.1Hz,1H),3.77(m,1H),3.32(m,1H),3.17(dt,J＝12.8,4.4Hz,1H),2.22(m,1H),2.19–1.59(m,7H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ63.2,55.4,45.4,37.9。次要(15％):(4S,4aS,7aS)-八氢-1H-环戊[b]吡啶-4-醇(45).1H NMR(500MHz,MeOD)δ3.62(m,1H),3.50(m,1H),3.08(dd,J＝13.6,3.5Hz,1H),2.90(td,J＝11.3,7.1Hz,1H),2.17(m,1H),2.19–1.59(m,8H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ70.5,59.9,49.7,45.0。次要(22％):(4S,4aS,7aR)-八氢-1H-环戊[b]吡啶-4-醇(46).1H NMR(500MHz,MeOD)δ3.48(m,1H),3.47(m,1H),3.01(m,1H),2.78(td,J＝11.2,7.1Hz,2H),2.14(m,1H),2.19–1.59(m,8H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ61.4,57.9,43.9,42.1。主要(37％)脱羟基类似物：(4aR,7aR)-八氢-1H-环戊[b]吡啶(47)：1H NMR(500MHz,MeOD)δ3.58(ddd,J＝7.9,5.4,2.9Hz,4H),3.27(t,J＝3.7Hz,2H),3.01(m,1H),2.35–2.25(m,1H),2.11(m,1H),1.79(m,2H),1.85(m,2H),1.71(m,1H),1.76(m,2H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ57.8,42.3,37.1,28.2,26.2,22.4,20.5,17.8.ESI-TOF：[M+H]+C8H16NO计算值：142.1231，测定值142.1238。
实施例4.9.
(R)-2-((S)-N-Cbz-2-氨基-1-羟基乙基)环戊-1-酮(49)和(R)-2-((R)-N-Cbz-2-氨基-1-羟基乙基)环戊-1-酮(50)。按照上述步骤以50:50的比例获得这些化合物。HPLC：30分钟内B的含量为10％至100％，tR分别为17和18分钟。使用N-Cbz-甘氨酸(x)(1.6mmol)，环戊酮和FSA D6Q。产物通过硅胶柱色谱法纯化，并用己烷:AcOEt从1:0至3:7的阶梯梯度洗脱，得到两个馏分池：包含49个纯净产物(53mg)的馏分池1和作为49:50(117.2mg)的1：2混合物的馏分池2，总计170.2mg(38％)产品。
(R)-2-((S)-N-Cbz-2-氨基-1-羟基乙基)环戊-1-酮(49).1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.38–7.24(m,5H),5.07(s,2H),4.09(td,J＝6.9,3.0Hz,1H),3.23(dd,J＝13.7,6.2Hz,1H),3.14(dd,J＝13.7,7.2Hz,1H),2.33–2.15(m,2H),2.15–1.92(m,4H),1.83–1.70(m,1H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ222.2,159.0,138.4,129.4,129.0,128.9,69.6,67.5,53.2,46.3,39.8,23.7,21.7。馏分池2 49:50 33:67比例。NMR:(R)-2-((R)-N-Cbz-2-氨基-1-羟基乙基)环戊-1-酮(50)：1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.42–7.16(m,5H),5.07(s,2H),3.83(q,J＝5.5Hz,1H),3.38–3.29(m,2H),2.32–1.98(m,5H),1.91–1.71(m,2H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ222.5,138.5,129.4,128.8,70.8,67.5,52.6,45.7,40.1,27.5,21.8。
馏分池2的分子内还原胺化反应(49:50 33:67的比例)产生两种非对映异构体，分别对应于醛醇加合物51和52。从阿尔多加合物49:(3S,3aS,6aR)-八氢环戊[b]吡咯-3-醇(51).1H NMR(500MHz,CD3OD)δ4.35(dt,J＝6.7,3.5Hz,1H),3.99(ddd,J＝9.0,7.2,3.3Hz,1H),3.15(d,J＝3.5Hz,2H),2.81(tdd,J＝9.3,6.4,3.6Hz,1H),2.00–1.92(m,1H),1.93–1.86(m,2H),1.89–1.75(m,2H),1.67–1.62(m,1H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ70.6,64.6,53.9,47.1,30.8,26.0,24.9。从阿尔多加合物50:(3R,3aS,6aR)-八氢环戊[b]吡咯-3-醇(52).1H NMR(500MHz,CD3OD)δ4.19–4.12(m,2H),3.20–3.15(m,1H),3.09(dt,J＝12.1,1.6Hz,1H),2.65(ddd,J＝9.6,7.9,6.3Hz,1H),1.99–1.92(m,1H),1.93–1.87(m,1H),1.69–1.67(m,1H),1.68–1.61(m,1H),1.57–1.51(m,1H),1.40(dq,J＝13.3,6.7Hz,1H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ75.6,63.0,51.7,51.6,31.7,29.1,24.9.ESI-TOF：[M+H]+C7H14NO计算值：128.1075，测定值128.1079。
实施例5.扩大乙醛的醛醇比例
实施例5.1.
(2S,4R)-N-Cbz-哌啶-2,4-二醇(54)：反应在50mL螺旋盖的锥形底部聚丙烯管中进行。向FSA D6E/A165G(3mg mL-1)在纯水(18.9mL)中的溶液中，添加1M三乙醇胺缓冲液，pH8(1mL)。向该溶液中，添加N-Cbz-3-氨基丙醛(331.2mg，80mM)和乙醛(100mM，112μL)。总反应体积为20mL。将反应混合物在25℃摇动(1000rpm)24小时。此后，用MeOH(30mL)终止反应以沉淀酶，并将混合物通过硅藻土过滤。蒸发MeOH，并将反应冻干。产物通过硅胶柱色谱法纯化，并用1:0至3:7的己烷:AcOEt阶梯梯度洗脱，得到191.3mg(47％)的标题化合物。[α]D 20＝+8.51(c＝2.1，在MeOH中)；HPLC：30分钟内B的含量为10％至100％，tR＝14.5min；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.59–7.24(m,5H),5.58–5.47(m,1H),5.22–4.99(m,2H),4.11–4.06(m,1H),4.03(tt,J＝11.3,4.5Hz,1H),3.12–2.98(m,1H),2.24–2.13(m,1H),2.02–1.92(m,1H),1.94–1.84(m,1H),1.49–1.42(m,1H),1.42–1.33(m,1H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ155.7,136.5,128.2,127.8,127.5,83.0,67.1,63.4,38.7,37.0,35.1,31.2.手性：1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.59–7.24(m,5H),5.49–5.43(m,1H),5.16–5.08(m,2H),4.03–3.99(m,1H),3.97–3.91(m,1H),3.45–3.38(m,1H),2.12–2.04(m,1H),1.86(dt,J＝14.7,3.9Hz,1H),1.81–1.70(m,2H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ155.4,136.5,128.2,127.8,127.5,82.5,67.1,60.0,35.2,33.0,31.3.ESI-TOF：[M+H]+C13H18NO4计算值：252.1235,测定值252.1231。
实施例6.醛醇丙醛除甲醛外.
实施例6.1.
反应在250mL锥形瓶中进行。向FSA D6Q(3mg mL-1，300mg)在纯水(93mL)中的溶液中添加1M三乙醇胺缓冲液pH 8(5mL)。向该溶液中，添加甲醛(10mmol，12.3M溶液的813μL)和丙醛(10mmol，725μL)。总反应体积为99.5mL。将反应混合物在25℃摇动(200rpm)48小时。
偶联反应在结构上表征了羟醛加合物57.
48小时后，将羟基丙酮(58)(10mmol，680μL)和FSA A165G(3mgmL–1，300mg)添加到反应中，并在25℃下摇动(200rpm)持续24小时。之后，用MeOH(100mL)终止反应以沉淀酶，并且将混合物通过活性炭过滤。蒸发MeOH，并将反应冻干。产物通过硅胶柱色谱法纯化，用1:0至95:5的CHCl3:MeOH的逐步梯度洗脱，得到392.2mg(25％)产物(59b)。产物59b通过NMR在结构上表征。
酶醛氧化成酸。2-羟基异丁酸酯的形成(12)。
使用来自Prozomix的醛脱氢酶(ALDH(003)，KIT：醛脱氢酶面板，目录号：PRO-ALDH(003)LOT：2016-1)。向含有57(12mL，≈100mM的11)的反应混合物中添加NAD+(来自66.3mM储备溶液的226.36μL，终浓度1mM)和NOX(PROZO)(来自119.6mg mL-1储备溶液的1254.48μL)(终浓度为57＝80mM，总体积为15mL)。通过添加AlDH(从194.4mg mL-1储备溶液中提取771.7μL)开始反应，并将反应置于室温下于1000rpm的振荡器中。3小时后，羟醛加成物至60的转化率约为96.4％。
丙醛、甲醛和醛醇加合物的HPLC分析：加入酶后和24小时后立即取出样品(5μL)，和O-苄基乙醇胺(50μL的吡啶：甲醇：水33：15：2中的0.13mM储备溶液)，并在室温下放置5分钟。此后，加入甲醇(450μL)，然后将其(30μL)注入HPLC***。HPLC分析：色谱柱：
C18，5μm，4.6×250mm色谱柱(Waters)，溶剂体系A：0.1％(v/v)TFA的H2O溶液；溶剂B：CH3CN:H2O 80:20中的0.095％(v/v)TFA，在30分钟、30℃、流速1mL min-1和215nm检测下，从B的10％到100％进行梯度洗脱。
通过与2,4'-二溴-苯乙酮反应来鉴定2-羟基异丁酸(60)：反应完成后，加入MeOH(150mL；10倍反应体积)，并用硅藻土滤出沉淀的酶。然后蒸发甲醇，并将残余物冻干。将获得的固体溶于DMF(10mL)中，并添加(1.5mmol)。反应7小时后，将混合物稀释于乙酸乙酯(50mL)中，然后加入硅胶(50g)，并将溶剂蒸发至干。通过硅胶(100g)上的柱色谱法(47×4.5cm)进行产物纯化，其中梯度洗脱为：己烷/乙酸乙酯100:0(200mL)，90:10(200mL)；80:20(200mL)，70：30(200mL)，60:40(200mL)和50:50(1L)，产物以50:50洗脱。通过TLC分析馏分(10mL)。合并含有纯产物的馏分，蒸发溶剂，得到102.3mg的4-溴苯甲酰基-β-羟基异丁酸酯。产物通过NMR分析表征。在RP-HPLC Xbridge C18(5μm，4.6×250mm，Waters)色谱柱上进行HPLC分析。溶剂体系：三氟乙酸(TFA)(0.1％v/v)在水中，溶剂B(0.095％TFA)在CH3CH：水4：1中；梯度洗脱10-100％B，30分钟，流速1mL min-1，30℃，并在215nm处检测。4-溴苯酰基-β-羟基异丁酸酯的保留时间为21分钟。
实施例7.乙二醛向2-氯乙醛中加成醛醇。
实施例7.1.
反应体积为300μL，但形式上可以放大至5-50mL(如果需要，可以增加其他量)。将2-氯乙醛(100mM)和乙醛(100mM)溶解在pH 7.5的50mM三乙醇胺缓冲液中(该量取决于反应体积)。通过添加FSA D6N(3mg mL–1)开始反应。将反应混合物在25℃晒干(1000rpm)。24小时后，如果反应未完成(最大转化率约为80-85％)，则可以另外添加FSA D6N(3mg mL-1)。反应完成后，加入MeOH(1×反应体积)。所得混合物经活性炭过滤。真空蒸发滤液，将其溶于MeOH中并吸附到二氧化硅上。将吸附到二氧化硅上的产物加载到装有二氧化硅(15厘米硅胶床)的柱色谱(直径3厘米)上，用己烷：乙酸乙酯混合物以100：0(100mL)、70:30(200mL)、50：50(400mL)和30:70(400mL)的逐步梯度洗脱样品。产物在50:50的己烷：乙酸乙酯混合物附近出现。将产物与使用DERA催化剂获得的真实样品进行比较。
HPLC分析：在添加酶后和24小时后立即取出样品(5μL)，并加入O-苄基羟胺(50μL，在吡啶：甲醇：水33：15：2中的0.13mM储备溶液)并在室温下放置5分钟。之后，添加甲醇(450μL)，然后注入(30μL)到HPLC***中(色谱柱：
C18，5μm，4.6×250mm色谱柱(Waters))。HPLC分析：溶剂A：0.1％TFA的H2O溶液。溶剂B：在CH3CN:H2O中的0.095％TFA，在30分钟内从10％到100％的B进行梯度洗脱。
实施例8.醛醇将丙酮加到丙醛中。
实施例8.1.
(R)-4-羟基己-2-酮(64)：在反应容器中，将预先培养用于FSA D6E质粒指导表达的大肠杆菌BL21冻干全细胞(250mg，相当于15mg纯FSA)悬浮于PBS缓冲液(15mL，pH 7.0)中。加入丙酮(4mL，54.5mmol)、新鲜蒸馏的丙醛(56)(1mL，13.9mmol)和DTT(2mM)。将悬浮液在旋转摇床上于21℃摇动4天，然后在3087×g下离心20分钟。用***(3×20mL)萃取上清液，并将合并的有机层经MgSO4干燥、过滤，并在真空下蒸发溶剂。通过NMR光谱分析包含几乎纯的产物64(550mg，33.9％)的油状残余物。1H NMR(300MHz,MeOD)：δ＝1.05(t,3H,J(6/5)＝7.5Hz,H-6),1.58(m,2H,H-5),2.29(s,3H,H-1),2.68(d,2H,J(3/4)＝6.4Hz,H-3),4.06(tt,1H,H-4).13C NMR(75MHz,MeOD)：δ＝10.24(C-6),30.80(C-1),30.93(C-5),51.23(C-3),70.05(C-4),210.80(C-2)。
实施例9.丙醇向正丁醛中添加醛醇
实施例9.1
(R)-4-羟基庚-2-酮(66)：在反应容器中，将预先培养用于FSA D6E质粒指导表达的大肠杆菌BL21冻干全细胞(200mg，相当于12mg纯FSA)悬浮在PBS缓冲液(15mL，pH 7.0)中。加入丙酮(1a)(4mL，54.5mmol)、新鲜蒸馏的丁醛(65)(1mL，11.1mmol)和DTT(2mM)。将悬浮液在旋转摇床上于21℃摇动4天，然后在3087×g下离心20分钟。用***(3×20mL)萃取上清液，并将合并的有机层经MgSO4干燥、过滤，并在真空下蒸发溶剂。通过NMR光谱分析包含几乎纯的产物66(141mg，9.7％)的油状残余物。1H NMR(300MHz,MeOD)：δ＝0.99(t,3H,J(7/6)＝7.1Hz,H-7),1.47(m,4H,H-5,6),2.22(s,3H,H-1),2.61(d,2H,J(3/4)＝6.1Hz,H-3),4.08(tt,1H,H-4).13C NMR(75MHz,MeOD)：δ＝14.33(C-7),19.75(C-6),30.71(C-1),40.60(C-5),51.86(C-3),68.60(C-4),210.85(C-2)。
实施例10.丙醇向正戊醛中添加醛醇
实施例10.1
(R)-4-羟基辛-2-酮(68)：在反应容器中，将预先培养用于FSA D6E质粒指导表达的大肠杆菌BL21冻干全细胞(250mg，相当于15mg纯FSA)悬浮在PBS缓冲液(15mL，pH 7.0)中。加入丙酮(1a)(4mL，54.5mmol)和新鲜蒸馏的戊醛(67)(1mL，9.4mmol)。将悬浮液在旋转摇床上于21℃摇动6天，然后在3087×g下离心20分钟。用***(3×20mL)萃取上清液，并将合并的有机层经MgSO4干燥、过滤，并在真空下蒸发溶剂。通过NMR光谱分析包含几乎纯的产物68(250mg，18.4％)的油状残余物。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ＝0.81(t,3H,J＝6.4Hz,H-8),1.15–1.48(m,6H,H-5,6,7),2.09(s,3H,H-1),2.50(m,2H,H-3),3.95(tt,1H,J＝7.4/3.4Hz,H-4).13C NMR(75MHz,CDCl3)：δ＝13.95(C-8),22.56(C-7),27.60(C-6),30.69(C-1),36.20(C-5),50.08(C-3),67.57(C-4),209.89(C-2)。
实施例11.醛醇将丙酮添加到异戊烷中
实施例11.1
(R)-4-羟基-6-甲基庚-2-酮(70)：在反应容器中，将预先培养用于FSA D6E质粒指导表达的大肠杆菌BL21冻干全细胞(191mg，相当于11mg纯FSA)悬浮于PBS缓冲液(15mL，pH7.0)中。加入丙酮(1a)(4mL，54.5mmol)、新鲜蒸馏的异戊醛(69)(1mL，9.3mmol)和DTT(2mM)。将悬浮液在旋转摇床上于21℃摇动4天，然后在3087×g下离心20分钟。用***(3×20mL)萃取上清液，并将合并的有机层经MgSO4干燥、过滤，并在真空下蒸发溶剂。通过NMR光谱分析包含几乎纯的产物70(284mg，21.2％)的油状残余物。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ＝0.87(d,6H,J＝6.6Hz,H-7/1’),1.09(m,1H,J＝13.7Hz,H-6),1.42(m,1H,J＝13.7Hz,H-5a),1.74(m,1H,H-5b),2.13(s,3H,H-1),2.52(m,2H,H-3),4.08(m,1H,J＝4.4Hz,H-4).13CNMR(75MHz,CDCl3)：δ＝22.06(C-6),23.35(C-7/1’),24.39(C-7/1’),30.84(C-1),45.58(C-5),50.57(C-3),65.69(C-4),210.15(C-2)。
实施例12.醛醇在丙醛中添加丙醛
实施例12.1
(2S,3R)-3-羟基-2-甲基戊醛(74).将酶催化剂FSA D6A/T26I(35mg)溶解在含有DTT(2mM)的三乙醇胺缓冲液(100mL；50mM，pH 7.4)中。加入新鲜蒸馏的丙醛(1500μL，20.9mmol)后，将容器塞好，并将反应混合物在20℃下搅拌3天。然后加入CaCl2溶液(终浓度为1mM)，然后加入蛋白酶K(51U)，并使用饱和的NaHCO3水溶液将pH调节至7.0。将该混合物在55℃温育2小时，在此期间混浊的溶液变得澄清。在TLC控制下，用乙酸乙酯(4×60mL)萃取产物。将合并的有机层干燥(MgSO4)，过滤，并在真空下于40℃蒸发溶剂。油状残留物通过硅胶柱色谱纯化，使用环己烷-乙酸乙酯(3：1)作为洗脱剂，得到纯净产物(230mg，9.5％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ＝0,79(d,3H,J＝7,05Hz,H-5),0,84(t,3H,J＝7,45Hz,H-2‘),1,35(m,2H,H-4),1,65(m,1H,H-2),3,50(m,2H,H-3),3,58(m,1H,H-1),3,96(brs,2H,OH-1‘,OH-3‘).13C NMR(75MHz,CDCl3)：δ＝9,90(C-5),10,57(C-2‘),26,71(C-4),38,75(C-2),66,19(C-1),74,96(C-3)。
减少醛74和二醇保护以进行构型分配。
(4R,5R)-4-乙基-2,2,5-三甲基-1,3-二恶烷(75).将醛74(1eq)溶于MeOH(1.4mL/mmol醛)中，并在室温搅拌下用NaBH4(1.5eq/mmol)分批处理。2小时后，加入2体积的盐水并沉淀出固体。将混合物用去离子水缓慢处理，直至浑浊消失(约4mL/mL MeOH)。用乙酸乙酯(6×20mL；TLC对照)萃取溶液。将合并的有机相干燥(MgSO4)、过滤并在40℃下真空浓缩。残余物(130mg，55.5％)无需进一步纯化即可直接用于下一步。
将二醇溶于无水丙酮(2.5mL)中，然后加入二甲氧基丙烷(2.5mL)。向其中加入分子筛(250mg；
)和催化量的p-TosOH。使用隔膜将容器密闭，并在20℃下搅拌2.5小时。加入饱和的NaHCO3溶液(2.5mL)后，使用***(3×5mL)萃取混合物。将合并的有机相干燥(MgSO4)，过滤并在真空下浓缩以提供缩醛75(300mg，29.9％)。1H NMR(300MHz,CDCl3,30％C6D6)：δ＝1,54(t,3H,J(4‘,3‘)＝7,4Hz,H-4‘),1,73(d,3H,J(5‘,5)＝6,8Hz,H-5‘),1,83(m,1H,H-5),1,95(ddq,1H,J(3‘,4‘)＝7,4Hz,H-3‘a),2,03(s,3H,H-1‘),2,14(s,3H,H-2‘),2,20(ddt,1H,J(3‘,4‘)＝7,4Hz,H-3‘b),4,16(dd,J(6b,5)＝1,66,J(6a,6b)＝11,40Hz,1H,H-6a),4,32(ddd,1H,J＝2,5,5,9,8,1Hz,H-4),4.56(dd,J(6a,5)＝2,8,J(6b,6a)＝11,40Hz,1H,H-6b)ppm.13C NMR(75MHz,CDCl3 30％C6D6)：δ＝9,56(C-5‘),10,33(C-4‘),18,87(C-1‘),29,81(C-3’),29,80(C-2‘),31,31(C-5),66,65(C-6),72,82(C-4),98,22(C-2)ppm。
实施例13.醛醇将丁醛添加到丁醛中
实施例13.1
(2S,3R)-2-乙基-3-羟基己醛(76)：将酶催化剂FSA D6A/T26L(35mg)溶解在含有DTT(2mM)的三乙醇胺缓冲液(100mL；50mM，pH 7.4)中。加入新鲜蒸馏的丁醛(64)(400μL，20.9mmol)后，将容器塞好，并将反应混合物在20℃下搅拌3天。然后加入CaCl2溶液(终浓度为1mM)，然后加入蛋白酶K(51U)，并使用饱和的NaHCO3水溶液将pH调节至7.0。将该混合物在55℃温育2小时，在此期间混浊的溶液变得澄清。用乙酸乙酯(4×60mL)在TLC控制下萃取产物。将合并的有机层干燥(MgSO4)、过滤，并在真空下于40℃蒸发溶剂。油状残余物通过硅胶柱色谱纯化，使用环己烷-乙酸乙酯(3:1)作为洗脱剂，得到纯净的产物76(90mg，26.9％)。1H NMR(300MHz,CHCl3)：δ＝1,31(t,6H,J＝7,5Hz,H-5‘,H-7‘),1,36(m,1H,J＝10,5Hz,H-5),1,66(m,2H,H-4a‘,H-6a‘),1,72-1,85(m,2H,H-4b‘,H-6b‘),1,77(s,3H,H-1‘),1,78(s,3H,H-2‘),1,90(m,1H,H-3a‘),2,12(m,1H,J＝3,3Hz,H-3b‘),4,17(dd,1H,J(6a,5)＝1,8J(6a,6b)＝11,8Hz,H-6a),4,24(m,2H,H-4,H-6b)ppm.13C NMR(75MHz,CHCl3)：δ＝12,06(C-7‘),14,06(C-5‘),16,15(C-4‘),18,83(C-6‘),19,15(C-1‘),29,79(C-2‘),34,88(C-3‘),39,11(C-5),62,63(C-6),71,94(C-4),98,44(C-2)ppm。
减少醛76和二醇保护以进行构型分配。
(4R,5R)-5-乙基-2,2-二甲基-4-丙基-1,3-二恶烷(77).将醛76(1eq)溶于MeOH(1.4mL/mmol醛)中，并在室温搅拌下用NaBH4(1.5eq/mmol)分批处理。基本按75所述方法进行处理和使用丙酮中的二甲氧基丙烷进行酸催化进行缩醛保护，方法与75相同。使用环己烷进行产物77的萃取，并通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯-环己烷1:10)进行纯化。1H NMR(300MHz,CDCl3,30％C6D6)：δ＝1,54(t,3H,J(4‘,3‘)＝7,4Hz,H-4‘),1,73(d,3H,J(5‘,5)＝6,8Hz,H-5‘),1,83(m,1H,H-5),1,95(ddq,1H,J(3‘,4‘)＝7,4Hz,H-3‘a),2,03(s,3H,H-1‘),2,14(s,3H,H-2‘),2,20(ddt,1H,J(3‘,4‘)＝7,4Hz,H-3‘b),4,16(dd,J(6b,5)＝1,66,J(6a,6b)＝11,40Hz,1H,H-6a),4,32(ddd,1H,J＝2,5,5,9,8,1Hz,H-4),4.56(dd,J(6a,5)＝2,8,J(6b,6a)＝11,40Hz,1H,H-6b)ppm.13C NMR(300MHz,CDCl3 30％C6D6)：δ＝9,56(C-5‘),10,33(C-4‘),18,87(C-1‘),29,81(C-3’),29,80(C-2’),31,31(C-5),66,65(C-6),72,82(C-4),98,22(C-2)ppm。
序列表
<110> 西班牙高等科研理事会
达姆斯塔特工业大学
可持续动力有限公司
<120> 用于羟醛缩合碳连接的果糖-6-磷酸醛缩酶变体
<130> PCT1641.1281
<150> EP17382194.3
<151> 2017-04-10
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 220
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (6)..(6)
<223> 该位置的氨基酸可以被氨基酸A、L、N、Q、S、T、E、H、V、G、I或P中的任何一种取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (26)..(26)
<223> 该位置的氨基酸可以被氨基酸V、A、L、I或P中的任何一种取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (165)..(165)
<223> 该位置的氨基酸可以被氨基酸G取代
<400> 1
Met Glu Leu Tyr Leu Asp Thr Ser Asp Val Val Ala Val Lys Ala Leu
1 5 10 15
Ser Arg Ile Phe Pro Leu Ala Gly Val Thr Thr Asn Pro Ser Ile Ile
20 25 30
Ala Ala Gly Lys Lys Pro Leu Asp Val Val Leu Pro Gln Leu His Glu
35 40 45
Ala Met Gly Gly Gln Gly Arg Leu Phe Ala Gln Val Met Ala Thr Thr
50 55 60
Ala Glu Gly Met Val Asn Asp Ala Leu Lys Leu Arg Ser Ile Ile Ala
65 70 75 80
Asp Ile Val Val Lys Val Pro Val Thr Ala Glu Gly Leu Ala Ala Ile
85 90 95
Lys Met Leu Lys Ala Glu Gly Ile Pro Thr Leu Gly Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Gly Ala Ala Gln Gly Leu Leu Ser Ala Leu Ala Gly Ala Glu Tyr Val
115 120 125
Ala Pro Tyr Val Asn Arg Ile Asp Ala Gln Gly Gly Ser Gly Ile Gln
130 135 140
Thr Val Thr Asp Leu His Gln Leu Leu Lys Met His Ala Pro Gln Ala
145 150 155 160
Lys Val Leu Ala Ala Ser Phe Lys Thr Pro Arg Gln Ala Leu Asp Cys
165 170 175
Leu Leu Ala Gly Cys Glu Ser Ile Thr Leu Pro Leu Asp Val Ala Gln
180 185 190
Gln Met Ile Ser Tyr Pro Ala Val Asp Ala Ala Val Ala Lys Phe Glu
195 200 205
Gln Asp Trp Gln Gly Ala Phe Gly Arg Thr Ser Ile
210 215 220
Claims (14)
1.果糖-6-磷酸醛缩酶变体，包含：
a.与SEQ ID NO:1具有至少80％、优选至少90％、更优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列，和
b.在6位的氨基酸取代，对应于SEQ ID NO:1的1至220位。
2.权利要求1所述的变体，其中所述氨基酸取代通过选自以下的氨基酸进行：A、L、N、Q、S、T、E、H、V、G、I或P，优选被H、N、Q、L、T、E或A。
3.根据权利要求1或2所述的变体，其中所述变体还包含在26位的氨基酸取代，对应于SEQ ID NO:1的1至220位。
4.根据权利要求3所述的变体，其中在26位的氨基酸是通过选自以下的氨基酸进行：V、A、L、I或P，优选L或I。
5.根据权利要求1或2所述的变体，其中所述变体还包含通过氨基酸G在165位的氨基酸取代，对应于SEQ ID NO:1的1至220位。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的变体，其中所述变体包含氨基酸取代基D6N或D6H。
7.核酸序列，编码根据权利要求1至6中任一项所述的变体。
8.基因构建体，包含根据权利要求7所述的核酸序列。
9.宿主细胞，包含根据权利要求7所述的核酸序列或根据权利要求8所述的基因构建体。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞在制备根据权利要求1至6中任一项所述的变体中的用途。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的变体或根据权利要求9所述的宿主细胞作为醇醛缩合反应的生物催化剂的用途。
12.根据权利要求11的用途，其中羟醛缩合碳连接反应发生在两个醛之间或醛和酮之间，优选其中所述醛选自：2-氯乙醛、甲醛、苄氧基乙醛、丙醛、戊醛、异戊醛、乙醛、丁醛、3-羟基丙醛、3-羟基丁醛、N-Cbz-3-氨基丙醛或N-Cbz-glycinal，并且所述酮选自：丙酮、丁酮、环丁酮、环戊酮或3-戊酮。
13.一种用于羟醛缩合碳连接的方法，包括下列步骤：
a.在根据权利要求1至6中任一项所述的变体或根据权利要求9所述的宿主细胞的存在下，使两种醛或醛与酮反应；和
b.回收在步骤(a)中进行的反应产物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述醛选自：2-氯乙醛、甲醛、苄氧基乙醛、丙醛、戊醛、异戊醛、乙醛、丁醛、3-羟基丙醛、3-羟基丁醛、N-Cbz-3-氨基丙醛或N-Cbz-glycinal，并且所述酮选自：丙酮、丁酮、环丁酮、环戊酮或3-戊酮。
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