CN114606169B

CN114606169B - 一种全细胞催化生产1,6-己二醇的方法、重组微生物及其应用

Info

Publication number: CN114606169B
Application number: CN202210204772.1A
Authority: CN
Inventors: 陈振; 朱强
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2022-03-03
Filing date: 2022-03-03
Publication date: 2023-10-17
Anticipated expiration: 2042-03-03
Also published as: CN114606169A

Abstract

本发明涉及生物化工技术领域，具体公开了一种全细胞催化生产1,6‑己二醇的方法、重组微生物及其应用。本发明的重组微生物与出发菌株相比，过表达醛还原酶yahk，以及表达羧酸还原酶MpCAR和4'‑磷酸泛酰氨基转移酶sfp，所述出发菌株为大肠杆菌。本发明通过在大肠杆菌中引入外源羧酸还原酶和4'‑磷酸泛酰氨基转移酶，并过表达醛还原酶获得的重组大肠杆菌进行全细胞催化，可以在温和的条件下利用1,6‑己二酸生产1,6‑己二醇，具有十分广阔的应用前景。

Description

一种全细胞催化生产1,6-己二醇的方法、重组微生物及其应用

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，具体地说，涉及一种全细胞催化生产1,6-己二醇的方法、重组微生物及其应用。

背景技术

1,6-己二醇是一种重要的化学品,可以作为原料合成一系列具有重要应用的高附加值产品，例如具有特殊性能的高档聚氨酯胶黏剂、聚氨酯弹性体，其应用覆盖聚氨酯、聚酯、涂料、染料、医药等多个领域，具有广阔的市场前景。目前1,6-己二醇高价格限制了其产能和应用，但全球市场对该产品的需求正在以5％～8％的年增长率增长。

工业上主要是通过1,6-己二酸酯化加氢生产1,6-己二醇，其生产装置属高压甲级防爆装置，通常面临设备装置要求高、设备腐蚀问题严重、催化剂稳定性差等问题。例如公开号CN113683483A的中国专利，提供了将己二酸和C6混合醇混合进行酯化反应再加氢还原的方式生产1,6-己二醇，也需要高温高压进行加氢反应。

目前，生物基合成1,6-己二醇的研究主要集中在使用纤维素、糠醛等生物质经过酸催化转化，例如公开号为CN113024350A的中国专利通过生物基呋喃类化合物制备1,6-己二醇。

通过生物催化的方法生产1,6-己二醇，不仅反应温和，而且具备较好的反应选择性，可以减少金属催化剂和化石能源的消耗，提高循环经济水平，实现低碳生产。因此，开发基于1,6-己二酸为底物生物生产1,6-己二醇的生物制造工业对于环境保护及提高循环经济水平都具有重大意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种高效、高产，可利用利用己二酸在温和条件下转化生产1,6-己二醇的新方法。

本发明的技术方案如下：

一种重组微生物，其与出发菌株相比，过表达醛还原酶yahk，以及表达羧酸还原酶MpCAR和4′-磷酸泛酰氨基转移酶sfp，所述出发菌株为大肠杆菌。

本发明通过在大肠杆菌中引入来自Mycolicibacterium paratuberculosis的羧酸还原酶MpCAR和来自Bacillus subtilis的4′-磷酸泛酰氨基转移酶sfp，并过表达大肠杆菌中原有的醛还原酶yahk获得了一种新的重组大肠杆菌，其可高效生物转化己二酸生产1,6-己二醇。

本发明中，所述羧酸还原酶MpCAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述4′-磷酸泛酰氨基转移酶sfp的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述羧酸还原酶MpCAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述4′-磷酸泛酰氨基转移酶sfp的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明另提供一种上述重组微生物的如下任一种应用：

(1)在发酵生产1,6-己二醇中的应用；

(2)在用于生产1,6-己二醇的微生物遗传育种中的应用；

(3)在提高生物法合成1,6-己二醇的能力中的应用。

本发明还提供一种全细胞催化生产1,6-己二醇的方法，其包括培养上述重组微生物的步骤。

本发明的方法中，培养所述重组微生物时的催化体系包括：PBS缓冲液、葡萄糖、己二酸和上述重组微生物的细胞悬液。

本发明的所述催化体系包括：浓度为0.01M、pH值为7.2～7.4的PBS缓冲液，浓度为10-60g/L的葡萄糖，浓度为10-60g/L的己二酸或己二酸二钠，细胞悬液的OD₆₀₀为20-60的所述重组微生物；

优选，所述催化体系包括：浓度为0.01M、pH值为7.2～7.4的PBS缓冲液，浓度为40g/L的葡萄糖，浓度为20g/L的己二酸二钠，细胞悬液的OD₆₀₀为25-35的所述重组微生物。

本发明的方法中，所述催化体系的反应条件为：30±1℃，190-210rpm，反应时间为22-24h。

本发明构建的全细胞催化反应体系，可提高1,6-己二醇产量。通过以上方式可获得高效生产1,6-己二醇的全细胞催化方案，在24h内生产7g/L 1,6-己二醇。

本发明的有益效果至少在于：

本发明中提供了一种全细胞催化生产1,6-己二醇的方法，其能够利用己二酸在温和条件下转化生产1,6-己二醇。该反应时间较直接发酵更短，且中间操作较少，产量更高。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1在大肠杆菌中引入己二酸转化路径

大肠杆菌本身无法直接利用己二酸合成1,6-己二醇，为此在大肠杆菌中引入来自Mycolicibacterium paratuberculosis的羧酸还原酶MpCAR(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)，同时引入来自Bacillus subtilis的4′-磷酸泛酰氨基转移酶sfp(氨基酸序列如SEQID NO.2所示)，并过表达大肠杆菌中原有的醛还原酶yahk，构建能利用己二酸转化生产1,6-己二醇的大肠杆菌重组菌株W03/MpCAR-sfp-yahk。

重组菌株W03/MpCAR-sfp-yahk构建方法：

将质粒PCDFDuet-MpCAR-sfp-yahk电转入大肠杆菌W03(大肠杆菌W3110利用CRISPR-Cas9技术敲除pta-ackA基因、ldhA基因、adhE基因)的感受态中，在包含100mg/L壮观霉素的LB平板上获得正确的重组菌株，命名为W03/MpCAR-sfp-yahk。

质粒PCDFDuet-MpCAR-sfp-yahk构建方法：

以Vector-F(TTAGGCTTATTGTAAAAGAAGGAGATATACATGAAAATTTACGGCAT，SEQ IDNO.5)和Vector-R(AGTAGCAGTACTCATGTATATCTCCTTCTTCCATGGTCTGTTTCC，SEQ ID NO.6)为引物，以质粒PCDFDuet(购自Addgene)为模板扩增获得3.9Kb的PCR片段。以MpCAR-F(AAGAAGGAGATATACATGAGTACTGCTACTCACGATGAACG，SEQ ID NO.7)和MpCAR-R(GTATATCTCCTTCTTTTACAATAAGCCTAACAACTGAAGGTCAGTG，SEQ ID NO.8)为引物，以人工合成密码子优化后的MpCAR基因(核酸序列如SEQ ID NO.3所示)为模板扩增获得3.5Kb的PCR片段。以sfp-F(TTAGGCTTATTGTAAAAGAAGGAGATATACATGAAAATTTACGGCAT，SEQ ID NO.9)和sfp-R(AGCTTTGATCTTCATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTTCAAAGTAACTCCTCG，SEQ ID NO.10)为引物，以人工合成密码子优化后的sfp基因(核酸序列如SEQ ID NO.4所示)为模板扩增得到0.8Kb的PCR片段。以yahk-F(AAGAAGGAGATATACATGAAGATCAAAGCTGTTGGTGCA，SEQ ID NO.11)yahk-R(TTGCTCAGCGGTGGCTCAGTCTGTTAGTGTGCGATTATCGATAACA，SEQ ID NO.12)为引物，以W03菌株为模板扩增获得1.1Kb的PCR片段。利用Gibson组装的方法将四个片段组装，获得质粒PCDFDuet-MpCAR-sfp-yahk。

将重组大肠杆菌W03/MpCAR-sfp-yahk在500mL的摇瓶中进行培养，培养基为包含2g/L己二酸的MR培养基(己二酸二钠2g/L，葡萄糖20g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8g/L，(NH₄)₂HPO₄4g/L，KH₂PO₄ 6.67g/L，柠檬酸钾0.8g/L，酵母粉2.5g/L，FeSO₄·7H₂O 10g/L,CaCl₂·2H₂O2g/L,ZnSO₄·7H₂O 2.2g/L，MnSO₄·4H₂O 0.5g/L,CuSO₄·5H₂O 1.0g/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O0.1g/L,Na₂B₄O₇·10H₂O 0.02g/L，壮观霉素100mg/L)，培养温度为37度，转速200rpm，发酵周期为48h，发酵结束利用高效液相色谱检测己二酸转化情况，检测条件：Aminex HPX-87H柱子，流动相为5mM硫酸，流速0.6mL/min，柱温35℃，进样量20μL，根据标准曲线计算即得各组分实际浓度。结果发现W03/MpCAR-sfp-yahk菌株48h可以积累1.25g/L 1,6-己二醇。

实施例2全细胞催化合成1，6-己二醇的方法

为了提升1,6-己二醇的产量，本发明开发了一种全细胞催化合成1,6-己二醇的方法，具体步骤如下：

(1)将大肠杆菌菌株W03/MpCAR-sfp-yahk在含有100mg/L壮观霉素的LB平板上37℃过夜培养。然后接种至30mL含有100mg/L壮观霉素的LB培养基中，37℃培养12h，获得种子液；将种子液按1％体积接种量接入200mL含有100mg/L壮观霉素的LB培养基中，37℃发酵培养12h，4000rpm离心，收集菌体，用PBS缓冲液(10mM,pH值为7.2)洗涤细胞，再离心后用无菌水重悬细胞，得到重组大肠杆菌细胞悬液。

(2)在250mL带挡板的摇瓶中加入10mL的催化体系，其中包含：PBS缓冲液(0.01M，pH值为7.2)、葡萄糖(40g/L)、己二酸二钠(20g/L)、重组大肠杆菌细胞悬液(初始OD₆₀₀为30)。以上催化体系，在30℃，200rpm中催化反应，反应时间为24h后终止反应，得到反应液。采用高效液相色谱分析本实验得到的1,6-己二醇的浓度。通过上述体系最终1,6-己二醇浓度达到6.97g/L。

实施例3

本实施例提供了一种全细胞催化合成1,6-己二醇的方法，具体方法与实施例2相同，区别仅在于，改变实施例2的步骤(2)中己二酸二钠的添加量，使催化体系中的己二酸浓度分别为40g/L、10g/L、60g/L，其他反应条件不变，24h后反应液中1,6-己二醇的浓度分别为5.37g/L、6.18g/L、3.54g/L。

对比例1

本对比例提供了一种全细胞催化合成1,6-己二醇的方法，具体方法与实施例2相同，区别仅在于，改变实施例2的步骤(2)中己二酸二钠的添加量，使催化体系中的己二酸浓度为80g/L，其他反应条件不变，24h后反应液中1,6-己二醇的浓度分别为1.36g/L。

实施例4

本实施例提供了一种全细胞催化合成1,6-己二醇的方法，具体方法与实施例2相同，区别仅在于，改变实施例2的步骤(2)中重组大肠杆菌在催化体系中的初始OD值，使其初始OD₆₀₀分别为20、40、60，其他反应条件不变，24h后反应液中1,6-己二醇的浓度分别为4.73g/L、6.48g/L、5.26g/L。

对比例2

本对比例提供了一种全细胞催化合成1,6-己二醇的方法，具体方法与实施例2相同，区别仅在于，改变实施例2的步骤(2)中重组大肠杆菌在催化体系中的初始OD值，使其初始OD₆₀₀分别为10、80、100，其他反应条件不变，24h后反应液中1,6-己二醇的浓度分别为1.35g/L、4.45g/L、3.74g/L。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 清华大学

<120> 一种全细胞催化生产1,6-己二醇的方法、重组微生物及其应用

<130> KHP221111733.1

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1173

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Thr Ala Thr His Asp Glu Arg Leu Asp Arg Arg Val His Glu

1 5 10 15

Leu Ile Ala Thr Asp Pro Gln Phe Ala Ala Ala Gln Pro Asp Pro Ala

20 25 30

Ile Thr Ala Ala Leu Glu Gln Pro Gly Leu Arg Leu Pro Gln Ile Ile

35 40 45

Arg Thr Val Leu Asp Gly Tyr Ala Asp Arg Pro Ala Leu Gly Gln Arg

50 55 60

Val Val Glu Phe Val Thr Asp Ala Lys Thr Gly Arg Thr Ser Ala Gln

65 70 75 80

Leu Leu Pro Arg Phe Glu Thr Ile Thr Tyr Ser Glu Val Ala Gln Arg

85 90 95

Val Ser Ala Leu Gly Arg Ala Leu Ser Asp Asp Ala Val His Pro Gly

100 105 110

Asp Arg Val Cys Val Leu Gly Phe Asn Ser Val Asp Tyr Ala Thr Ile

115 120 125

Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Gly Ala Val Ser Val Pro Leu Gln Thr

130 135 140

Ser Ala Ala Ile Ser Ser Leu Gln Pro Ile Val Ala Glu Thr Glu Pro

145 150 155 160

Thr Leu Ile Ala Ser Ser Val Asn Gln Leu Ser Asp Ala Val Gln Leu

165 170 175

Ile Thr Gly Ala Glu Gln Ala Pro Thr Arg Leu Val Val Phe Asp Tyr

180 185 190

His Pro Gln Val Asp Asp Gln Arg Glu Ala Val Gln Asp Ala Ala Ala

195 200 205

Arg Leu Ser Ser Thr Gly Val Ala Val Gln Thr Leu Ala Glu Leu Leu

210 215 220

Glu Arg Gly Lys Asp Leu Pro Ala Val Ala Glu Pro Pro Ala Asp Glu

225 230 235 240

Asp Ser Leu Ala Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Ala Pro

245 250 255

Lys Gly Ala Met Tyr Pro Gln Ser Asn Val Gly Lys Met Trp Arg Arg

260 265 270

Gly Ser Lys Asn Trp Phe Gly Glu Ser Ala Ala Ser Ile Thr Leu Asn

275 280 285

Phe Met Pro Met Ser His Val Met Gly Arg Ser Ile Leu Tyr Gly Thr

290 295 300

Leu Gly Asn Gly Gly Thr Ala Tyr Phe Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser

305 310 315 320

Thr Leu Leu Glu Asp Leu Glu Leu Val Arg Pro Thr Glu Leu Arg Phe

325 330 335

Val Pro Arg Ile Trp Glu Thr Leu Tyr Gly Glu Phe Gln Arg Gln Val

340 345 350

Glu Arg Arg Leu Ser Glu Ala Gly Asp Ala Gly Glu Arg Arg Ala Val

355 360 365

Glu Ala Glu Val Leu Ala Glu Gln Arg Gln Tyr Leu Leu Gly Gly Arg

370 375 380

Phe Thr Phe Ala Met Thr Gly Ser Ala Pro Ile Ser Pro Glu Leu Arg

385 390 395 400

Asn Trp Val Glu Ser Leu Leu Glu Met His Leu Met Asp Gly Tyr Gly

405 410 415

Ser Thr Glu Ala Gly Met Val Leu Phe Asp Gly Glu Ile Gln Arg Pro

420 425 430

Pro Val Ile Asp Tyr Lys Leu Val Asp Val Pro Asp Leu Gly Tyr Phe

435 440 445

Ser Thr Asp Arg Pro His Pro Arg Gly Glu Leu Leu Leu Arg Thr Glu

450 455 460

Asn Met Phe Pro Gly Tyr Tyr Lys Arg Ala Glu Thr Thr Ala Gly Val

465 470 475 480

Phe Asp Glu Asp Gly Tyr Tyr Arg Thr Gly Asp Val Phe Ala Glu Ile

485 490 495

Ala Pro Asp Arg Leu Val Tyr Val Asp Arg Arg Asn Asn Val Leu Lys

500 505 510

Leu Ala Gln Gly Glu Phe Val Thr Leu Ala Lys Leu Glu Ala Val Phe

515 520 525

Gly Asn Ser Pro Leu Ile Arg Gln Ile Tyr Val Tyr Gly Asn Ser Ala

530 535 540

Gln Pro Tyr Leu Leu Ala Val Val Val Pro Thr Glu Glu Ala Leu Ala

545 550 555 560

Ser Gly Asp Pro Glu Thr Leu Lys Pro Lys Ile Ala Asp Ser Leu Gln

565 570 575

Gln Val Ala Lys Glu Ala Gly Leu Gln Ser Tyr Glu Val Pro Arg Asp

580 585 590

Phe Ile Ile Glu Thr Thr Pro Phe Ser Leu Glu Asn Gly Leu Leu Thr

595 600 605

Gly Ile Arg Lys Leu Ala Trp Pro Lys Leu Lys Gln His Tyr Gly Glu

610 615 620

Arg Leu Glu Gln Met Tyr Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gln Ala Asn Glu

625 630 635 640

Leu Ala Glu Leu Arg Arg Asn Gly Ala Gln Ala Pro Val Leu Gln Thr

645 650 655

Val Ser Arg Ala Ala Gly Ala Met Leu Gly Ser Ala Ala Ser Asp Leu

660 665 670

Ser Pro Asp Ala His Phe Thr Asp Leu Gly Gly Asp Ser Leu Ser Ala

675 680 685

Leu Thr Phe Gly Asn Leu Leu Arg Glu Ile Phe Asp Val Asp Val Pro

690 695 700

Val Gly Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Asp Leu Ala Ala Ile Ala Ser

705 710 715 720

Tyr Ile Glu Ala Glu Arg Gln Gly Ser Lys Arg Pro Thr Phe Ala Ser

725 730 735

Val His Gly Arg Asp Ala Thr Val Val Arg Ala Ala Asp Leu Thr Leu

740 745 750

Asp Lys Phe Leu Asp Ala Glu Thr Leu Ala Ala Ala Pro Asn Leu Pro

755 760 765

Lys Pro Ala Thr Glu Val Arg Thr Val Leu Leu Thr Gly Ala Thr Gly

770 775 780

Phe Leu Gly Arg Tyr Leu Ala Leu Glu Trp Leu Glu Arg Met Asp Met

785 790 795 800

Val Asp Gly Lys Val Ile Ala Leu Val Arg Ala Arg Ser Asp Glu Glu

805 810 815

Ala Arg Ala Arg Leu Asp Lys Thr Phe Asp Ser Gly Asp Pro Lys Leu

820 825 830

Leu Ala His Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Asp His Leu Glu Val Ile Ala

835 840 845

Gly Asp Lys Gly Glu Ala Asn Leu Gly Leu Gly Gln Asp Val Trp Gln

850 855 860

Arg Leu Ala Asp Thr Val Asp Val Ile Val Asp Pro Ala Ala Leu Val

865 870 875 880

Asn His Val Leu Pro Tyr Ser Glu Leu Phe Gly Pro Asn Ala Leu Gly

885 890 895

Thr Ala Glu Leu Ile Arg Leu Ala Leu Thr Ser Lys Gln Lys Pro Tyr

900 905 910

Thr Tyr Val Ser Thr Ile Gly Val Gly Asp Gln Ile Glu Pro Gly Lys

915 920 925

Phe Val Glu Asn Ala Asp Ile Arg Gln Met Ser Ala Thr Arg Ala Ile

930 935 940

Asn Asp Ser Tyr Ala Asn Gly Tyr Gly Asn Ser Lys Trp Ala Gly Glu

945 950 955 960

Val Leu Leu Arg Glu Ala His Asp Leu Cys Gly Leu Pro Val Ala Val

965 970 975

Phe Arg Cys Asp Met Ile Leu Ala Asp Thr Thr Tyr Ala Gly Gln Leu

980 985 990

Asn Leu Pro Asp Met Phe Thr Arg Leu Met Leu Ser Leu Val Ala Thr

995 1000 1005

Gly Ile Ala Pro Gly Ser Phe Tyr Glu Leu Asp Ala Asp Gly Asn Arg

1010 1015 1020

Gln Arg Ala His Tyr Asp Gly Leu Pro Val Glu Phe Ile Ala Ala Ala

1025 1030 1035 1040

Ile Ser Thr Leu Gly Ser Gln Ile Thr Asp Ser Asp Thr Gly Phe Gln

1045 1050 1055

Thr Tyr His Val Met Asn Pro Tyr Asp Asp Gly Val Gly Leu Asp Glu

1060 1065 1070

Tyr Val Asp Trp Leu Val Asp Ala Gly Tyr Ser Ile Glu Arg Ile Ala

1075 1080 1085

Asp Tyr Ser Glu Trp Leu Arg Arg Phe Glu Thr Ser Leu Arg Ala Leu

1090 1095 1100

Pro Asp Arg Gln Arg Gln Tyr Ser Leu Leu Pro Leu Leu His Asn Tyr

1105 1110 1115 1120

Arg Thr Pro Glu Lys Pro Ile Asn Gly Ser Ile Ala Pro Thr Asp Val

1125 1130 1135

Phe Arg Ala Ala Val Gln Glu Ala Lys Ile Gly Pro Asp Lys Asp Ile

1140 1145 1150

Pro His Val Ser Pro Pro Val Ile Val Lys Tyr Ile Thr Asp Leu Gln

1155 1160 1165

Leu Leu Gly Leu Leu

1170

<210> 2

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Ile Tyr Gly Ile Tyr Met Asp Arg Pro Leu Ser Gln Glu Glu

1 5 10 15

Asn Glu Arg Phe Met Ser Phe Ile Ser Pro Glu Lys Arg Glu Lys Cys

20 25 30

Arg Arg Phe Tyr His Lys Glu Asp Ala His Arg Thr Leu Leu Gly Asp

35 40 45

Val Leu Val Arg Ser Val Ile Ser Arg Gln Tyr Gln Leu Asp Lys Ser

50 55 60

Asp Ile Arg Phe Ser Thr Gln Glu Tyr Gly Lys Pro Cys Ile Pro Asp

65 70 75 80

Leu Pro Asp Ala His Phe Asn Ile Ser His Ser Gly Arg Trp Val Ile

85 90 95

Cys Ala Phe Asp Ser Gln Pro Ile Gly Ile Asp Ile Glu Lys Thr Lys

100 105 110

Pro Ile Ser Leu Glu Ile Ala Lys Arg Phe Phe Ser Lys Thr Glu Tyr

115 120 125

Ser Asp Leu Leu Ala Lys Asp Lys Asp Glu Gln Thr Asp Tyr Phe Tyr

130 135 140

His Leu Trp Ser Met Lys Glu Ser Phe Ile Lys Gln Glu Gly Lys Gly

145 150 155 160

Leu Ser Leu Pro Leu Asp Ser Phe Ser Val Arg Leu His Gln Asp Gly

165 170 175

Gln Val Ser Ile Glu Leu Pro Asp Ser His Ser Pro Cys Tyr Ile Lys

180 185 190

Thr Tyr Glu Val Asp Pro Gly Tyr Lys Met Ala Val Cys Ala Ala His

195 200 205

Pro Asp Phe Pro Glu Asp Ile Thr Met Val Ser Tyr Glu Glu Leu Leu

210 215 220

<210> 3

<211> 3522

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgagtactg ctactcacga tgaacgctta gatcgtcgcg tacacgagct tatcgctacc 60

gatccccagt ttgcggccgc gcaacctgat cctgccatta cagctgccct tgaacaacct 120

ggattacgcc ttccccagat tatccgcacc gtccttgacg gatatgcaga tcgtcccgcg 180

ttaggacagc gtgtggtgga gtttgtgacg gacgccaaaa cgggtcgcac gagtgcgcaa 240

ttattacctc gcttcgagac gatcacttat agcgaagtcg cacagcgtgt gtctgctctt 300

ggacgtgcac tttcggatga tgcagtgcat cctggagatc gtgtatgtgt tcttgggttt 360

aatagcgtcg actatgccac aatcgatatg gctttggggg ccattggtgc tgtctccgtc 420

ccgcttcaga cgtccgccgc gatctctagc ttgcagccca ttgtagccga aacagagccc 480

accttgattg catcgagtgt aaatcaatta agcgacgcgg tgcagcttat cacgggcgct 540

gaacaggcgc cgacacgtct tgtcgttttc gattatcacc cgcaggtcga cgaccagcgc 600

gaggccgtgc aggatgcagc ggcacgcctg tcctccactg gggtagctgt ccagacttta 660

gcagaattat tggaacgtgg gaaagacttg cctgcagttg cagaaccccc ggcagatgaa 720

gactcattgg cccttttaat ttataccagt ggctcaacgg gagcacctaa gggagccatg 780

tacccgcaat cgaatgttgg aaaaatgtgg cgtcgtggct caaagaactg gttcggagag 840

agtgctgctt cgatcacatt aaattttatg cccatgtcgc acgttatggg acgcagtatc 900

ttgtatggta ccttgggcaa cgggggcacg gcatacttcg cagcacgttc ggacttgtcc 960

acactgctgg aggatctgga gttagtacgt cccacggaac ttcgctttgt tccacgtatc 1020

tgggaaacgt tgtatgggga gttccagcgt caggtagagc gtcgtttgtc ggaggcggga 1080

gatgcggggg aacgtcgcgc agtagaggcc gaagtcctgg ctgaacaacg tcagtacctg 1140

ttaggcgggc gctttacatt cgcaatgacg gggtctgccc ccattagtcc tgaactgcgc 1200

aactgggtgg aaagccttct tgagatgcat ctgatggatg gctatggtag cactgaggca 1260

ggtatggtct tatttgacgg tgaaatccaa cgcccgcctg ttatcgatta taagttagtc 1320

gatgtgcctg atctgggcta cttttctaca gaccgtccac atccccgcgg cgagctttta 1380

ttacgtacag aaaatatgtt cccaggttac tataaacgcg ctgagacgac ggccggcgtg 1440

ttcgatgaag acggttatta ccgtactggt gatgtttttg ctgaaattgc gccggatcgc 1500

ttagtgtacg tggaccgccg taataatgtc cttaagttgg cacagggtga atttgtgacg 1560

ttagcaaaac ttgaagctgt atttggaaac tcgcctctta tccgtcaaat ttatgtgtac 1620

gggaattcag cgcagcctta cttgttggct gtggtagtgc cgacagagga ggcgttggct 1680

agtggtgatc ctgaaactct taagcccaaa attgctgatt cgttacaaca ggtagccaag 1740

gaagccggac ttcagtcgta tgaggtgccc cgtgacttca ttattgaaac tacccccttc 1800

tctctggaga acggattact tacaggaatt cgtaagttgg catggcctaa gttaaaacaa 1860

cattacggag agcgtttaga acaaatgtat gctgatctgg cagccgggca ggcaaacgag 1920

ttagccgaac ttcgccgtaa cggcgcgcaa gcacctgtac ttcagactgt ctcccgtgcg 1980

gccggggcta tgctgggttc tgcggccagc gacctgagcc cggacgcgca cttcacggac 2040

ttaggggggg acagtttgtc ggccttaact tttggaaacc tgttgcgcga aatcttcgat 2100

gtggatgtac cggtgggtgt tatcgtgagc cccgctaatg accttgccgc gatcgcgagt 2160

tacattgagg ctgagcgcca ggggtcaaaa cgtccgacat ttgccagcgt acacggacgc 2220

gatgcaaccg ttgtccgtgc ggcggatctg acgttggaca aatttcttga cgcggagaca 2280

ttagccgccg cgcctaatct gccgaagcca gccactgaag tacgcacggt gctgctgacc 2340

ggcgcgacgg gcttcctggg acgttatttg gcccttgagt ggttggagcg catggacatg 2400

gttgacggta aggtaatcgc cttggtacgt gcacgcagcg acgaggaagc tcgcgcccgc 2460

ctggataaaa cctttgacag tggtgatcct aaactgttag ctcactatca acaattagcg 2520

gctgaccact tagaagtgat cgccggggat aaaggcgagg caaacctggg gttaggacag 2580

gatgtatggc aacgcttagc ggataccgtt gacgtgatcg ttgacccggc cgcactggtg 2640

aatcatgttc ttccgtattc agagcttttt ggtccgaacg cgcttgggac ggccgagttg 2700

atccgtttag cattgacctc gaaacaaaag ccctatacgt atgtctccac gatcggtgtg 2760

ggcgatcaga tcgagccagg gaaatttgta gagaatgcag atattcgtca aatgtcggcg 2820

acacgtgcta ttaatgattc ttacgcaaat ggttacggca atagtaaatg ggctggagag 2880

gtgcttctgc gcgaggctca cgacctttgt ggcttaccag tggcggtgtt ccgttgcgac 2940

atgatccttg ccgatacgac atacgctggg caacttaact tacccgatat gttcacccgt 3000

ttgatgctgt ctcttgtggc gacaggaatt gctcccgggt ccttttatga gttggacgca 3060

gacgggaatc gtcaacgcgc gcattatgat ggcttgcccg ttgaattcat cgcggcagcg 3120

attagcacct tgggctcgca gatcaccgat tcggatacag gattccaaac ctatcacgtc 3180

atgaatccat atgatgatgg cgttggatta gacgagtatg tcgattggtt ggttgacgca 3240

ggctatagca tcgagcgcat cgcggattac tctgagtggc tgcgccgttt cgagacgtcc 3300

ctgcgtgctc ttcccgatcg ccagcgccaa tactctctgc tgccattgtt gcacaattat 3360

cgcacaccgg aaaagcccat caacggtagt attgctccga cagacgtttt ccgcgctgcc 3420

gtacaggagg ccaagatcgg tcccgacaag gatatcccgc atgtctcgcc acccgttatc 3480

gtcaaataca tcactgacct tcagttgtta ggcttattgt aa 3522

<210> 4

<211> 675

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaaaattt acggcatcta catggaccgt cccttatctc aggaagaaaa tgaacgtttt 60

atgtccttta tctctccgga aaaacgtgag aaatgtcgtc gtttttatca caaggaagac 120

gctcatcgca ctctgcttgg cgacgtactt gttcgtagcg ttatctcacg ccagtatcaa 180

ttggataagt ccgacattcg tttttcgacc caggagtacg ggaagccgtg tatcccagac 240

ctgcccgatg ctcattttaa cattagccac tctggacgct gggtgatttg cgccttcgac 300

agccagccta tcggaattga cattgagaaa acaaagccaa tttctttgga aatcgccaaa 360

cgtttcttct caaaaactga gtatagtgat cttctggcaa aggacaaaga cgagcagacc 420

gattattttt accatctttg gagcatgaag gaatcgttta ttaaacagga agggaaaggg 480

cttagtttgc ccttagacag cttctcagtc cgcttacacc aggatggaca ggtgtcaatc 540

gagttaccag actcccactc cccttgttat attaagactt atgaagtcga tcctggttat 600

aagatggcag tgtgtgctgc acaccctgac tttcccgaag acattacgat ggtctcctac 660

gaggagttac tttga 675

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttaggcttat tgtaaaagaa ggagatatac atgaaaattt acggcat 47

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agtagcagta ctcatgtata tctccttctt ccatggtctg tttcc 45

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aagaaggaga tatacatgag tactgctact cacgatgaac g 41

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtatatctcc ttcttttaca ataagcctaa caactgaagg tcagtg 46

<210> 9

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttaggcttat tgtaaaagaa ggagatatac atgaaaattt acggcat 47

<210> 10

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agctttgatc ttcatgtata tctccttctt aaagtttcaa agtaactcct cg 52

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aagaaggaga tatacatgaa gatcaaagct gttggtgca 39

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttgctcagcg gtggctcagt ctgttagtgt gcgattatcg ataaca 46

Claims

1.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物与出发菌株相比，过表达醛还原酶yahk，以及表达羧酸还原酶MpCAR和4'-磷酸泛酰氨基转移酶sfp，所述出发菌株为大肠杆菌W03，所述大肠杆菌W03为敲除了pta-ackA基因、ldhA基因和adhE基因的大肠杆菌W3110；

所述羧酸还原酶MpCAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述4'-磷酸泛酰氨基转移酶sfp的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述醛还原酶yahk的编码基因为以yahk-F和yahk-R为引物，以大肠杆菌W03为模板扩增获得的1.1Kb的PCR片段；yahk-F的序列如SEQ ID NO.11所示，yahk-R的序列如SEQ IDNO.12所示。

2.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述羧酸还原酶MpCAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1或2所述的重组微生物，其特征在于，所述4'-磷酸泛酰氨基转移酶sfp的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.权利要求1-3任一项所述的重组微生物的如下任一种应用：

（1）在发酵生产1,6-己二醇中的应用；

（2）在提高生物法合成1,6-己二醇的能力中的应用。

5.一种全细胞催化生产1,6-己二醇的方法，其特征在于，包括培养权利要求1-3任一项所述的重组微生物的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，培养所述重组微生物时的催化体系包括：PBS缓冲液、葡萄糖、己二酸和权利要求1-3任一项所述的重组微生物的细胞悬液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述催化体系包括：浓度为0.01M、pH值为7.2~7.4的PBS缓冲液，浓度为10-60g/L的葡萄糖，浓度为10-60g/L的己二酸或己二酸二钠，细胞悬液的OD₆₀₀为20-60的所述重组微生物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述催化体系包括：浓度为0.01M、pH值为7.2~7.4的PBS缓冲液，浓度为40g/L的葡萄糖，浓度为20g/L的己二酸二钠，细胞悬液的OD₆₀₀为25-35的所述重组微生物。

9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，所述催化体系的反应条件为：30±1℃，190-210 rpm，反应时间为22-24h。