CN109722456B

CN109722456B - 一种丙烯酸的生物合成方法及应用

Info

Publication number: CN109722456B
Application number: CN201711047658.8A
Authority: CN
Inventors: 江会锋; 逯晓云; 徐占梅; 王杰
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin National Synthetic Biotechnology Innovation Center Co ltd
Priority date: 2017-10-31
Filing date: 2017-10-31
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2037-10-31
Also published as: CN116287029A; CN109722456A

Abstract

本发明公开了一种丙烯酸的生物合成方法及应用。本发明提供所提供的生物合成方法是利用生物酶ceas2催化DHAP或D‑G3P生成丙烯酸的方法。与现有技术相比，本发明所提供的丙烯酸生物合成方法不依赖于维生素B‑12和辅酶CoA，具有潜在的应用前景。本发明的实现为丙烯酸的生物合成打开了一扇新的大门，为实现生物基丙烯酸的工业生产奠定了基础。

Description

一种丙烯酸的生物合成方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种丙烯酸的生物合成方法及应用，特别涉及一种利用生物酶ceas2催化DHAP或D-G3P生成丙烯酸的方法及应用。

背景技术

丙烯酸(Acrylic acid)，化学式为C3H4O2，是无色透明、味苦辣、带有刺激性气味的腐蚀性液体，能溶于水、乙醇及***等，不耐光及热，有自聚性。丙烯酸是重要的有机化工原料，大部分用于生产丙烯酸酯(如丙烯酸甲酯、乙酯、丁酯及辛酯等)，少量用于生产高吸水性树脂、助洗涤剂和水处理剂等。丙烯酸及其酯系列产品可广泛应用于涂料、化纤、纺织、皮革、塑料、粘和剂、石油开采等各个领域。

丙烯酸主要采用化学方法生产。丙烯酸在20世纪30年代实现工业化生产。其生产历程经历了几个阶段：氯乙醇法、氰乙醇法、高压Reppe法、烯酮法、丙烯腈水解法和丙烯氧化法。前面几种工艺因技术和经济原因已经基本被淘汰。现在采用的丙烯氧化法是20世纪60年代发展起来的方法。所谓丙烯两步氧化法是在复合金属氧化物催化剂存在下,经空气氧化先生成丙烯醛，再进一步催化氧化成丙烯酸。

随着化石原料的枯竭以及环境污染等问题，开发生物法生产丙烯酸具有重要的现实意义。而目前报道的生物合成法代谢途径长、依赖于维生素B-12和辅酶CoA，难以在生产上应用。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种利用生物酶ceas2催化DHAP或D-G3P生成丙烯酸的方法。

第一，本发明请求保护Ceas2蛋白或其相关生物材料在丙烯酸生物合成中的应用。

其中，所述Ceas2蛋白具体可为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)或(A2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

所述相关生物材料具体可为能够表达所述Ceas2蛋白的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA等。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述表达盒可由能够启动所述核酸分子转录的启动子，所述核酸分子，以及转录终止序列组成。

第二，本发明请求保护一种丙烯酸生物合成方法。

本发明所提供的丙烯酸生物合成方法，可包括如下步骤：以Ceas2蛋白为生物酶，催化底物生成丙烯酸；所述底物为磷酸二羟基丙酮(DHAP)或/和3-磷酸甘油醛(D-G3P)。所述Ceas2蛋白为前文(A1)-(A4)任一所示蛋白。

在以所述Ceas2蛋白为生物酶催化所述底物生成丙烯酸的反应中，所述Ceas2蛋白与所述底物的用量配比可为0.9-1.1g：1mol。

更加具体的，在本发明中，在以所述Ceas2蛋白为生物酶催化所述底物生成丙烯酸的反应中，反应体系如下：5mM DHAP或D-G3P，2mM TPP(焦磷酸硫胺素)，6mM MgSO₄、1mg/ml所述Ceas2蛋白和蛋白缓冲液(50mM Tris-HCl，2mM EDTA，体积百分含量0.1％Triton X-100，pH8.2)。

在以所述Ceas2蛋白为生物酶催化所述底物生成丙烯酸的反应中，反应温度可为30℃，反应时间可为10h。

所述方法可为体外纯酶反应，也可为体外固定化酶反应，或者是其他类型的体外酶反应。

本发明所提供的丙烯酸生物合成方法，也可包括如下步骤：(1)在宿主细胞中表达Ceas2蛋白，得到重组细胞；(2)以碳源为底物利用所述重组细胞合成丙烯酸。所述Ceas2蛋白为前文(A1)-(A4)任一所示蛋白。

所述碳源可为任何能够在所述宿主细胞中转化成磷酸二羟基丙酮(DHAP)或/和3-磷酸甘油醛(D-G3P)的碳源。

在本发明的一个实施例中，所述碳源具体为甘油或者葡萄糖；

进一步，所述步骤(1)可为：向所述宿主细胞到导入能够表达所述Ceas2蛋白的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述Ceas2蛋白的所述重组细胞。

更进一步地，所述“能够表达所述Ceas2蛋白的核酸分子”可通过重组载体的形式导入到所述宿主细胞中。其中，所述重组载体可为携带有所述Ceas2蛋白的编码基因的细菌质粒(如在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，具体如pET-28a等)、噬菌体、酵母质粒(如YEp系列载体等)或逆转录病毒包装质粒。

在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为将所述Ceas2蛋白的编码基因(如SEQ ID No.3)替换pET28a的NdeI和XhoI之间的小片段后得到的重组质粒。

进一步地，所述宿主细胞可为原核细胞或低等真核细胞。

更进一步地，所述原核细胞具体可为细菌；所述低等真核细胞具体可为酵母细胞。

在本发明的一个实施例中，所述宿主细胞具体为大肠杆菌，更加具体的为E.coliBL21(DE3)。相应的，所述诱导培养为向培养体系中加IPTG至终浓度0.5mM，16℃诱导培养14-16h。

在本发明中，前文所述的“能够表达所述Ceas2蛋白的核酸分子”具体为所述Ceas2蛋白的编码基因，更加具体的为如下任一：

(B1)SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(B2)SEQ ID No.1所示的DNA分子；

(B3)在严格条件下与(B1)或(B2)限定的DNA分子杂交且编码所述Ceas2蛋白的DNA分子；

(B4)与(B1)-(B3)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述Ceas2蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

进一步地，所述(B4)具体可为与SEQ ID No.3相比，存在或仅存在如下任一个或多个突变的DNA分子：GAC 901-903 TAT；TTC 1234-1236 CAG；TTC 1237-1239 CAT；TTC 1237-1239 AAT；TTC 1312-1314 CTG；ATC 1228-1230 AAT；ATC 1486-1488 GTT；CTG 241-243AGC；AAC 1477-1479 CTG；AAC 1477-1479 TAT；CGT 106-109 GAA；CGT 106-109 GGT；CGT1240-1242 AAA；GTT 97-99 ATT；GTT 97-99TAT；TAC 751-753 TTT；TAC 751-753 CTG；TAC1495-1497 TGG；TTC 1234-1236 GCA；TTC 1312-1314 ATG；TCT 1309-1311 ACC；GTT 1462-1464 TGG；TAC 1495-1497 AAA。

进一步地，步骤(2)中，所述“以碳源为底物利用所述重组细胞合成丙烯酸”可通过全细胞催化反应或者发酵培养所述重组细胞实现。

更进一步地，当所述“以碳源为底物利用所述重组细胞合成丙烯酸”通过全细胞催化反应实现时，所述步骤(2)可包括：将所述重组细胞悬于含有所述碳源的反应液中，37℃震荡反应10h。

在本发明的一个实施例中，所述“含有所述碳源的反应液”为含有含1％(体积百分含量)所述碳源(具体如葡萄糖或甘油)的50mM Tris-HCl(pH8.2)溶液。

进一步地，前文所述(A2)中，所述(A2)中，所述“将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质”可为将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中离活性中心

或

或

或

范围内的氨基酸残基进行一个或多个突变后得到的蛋白质。

更进一步地，前文所述(A2)中，所述“将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质”可为与SEQ IDNo.2相比，在或仅在如下任一个位置或多个位置存在突变：第33位、第36位、第81位、第251位、第301位、第410位、第412位、第413位、第414位、第437位、第438位、第488位、第493位、第496位、第499位。

更加具体的，所述“将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质”为与SEQ ID No.2相比，存在或仅存在如下任一个或多个突变：V33I、V33Y、R36E、R36G、L81S、Y251F、Y251L、D301Y、I410N、F412Q、F412A、F413H、F413N、R414K、S437T、F438L、F438M、V488W、N493L、N493Y、I496V、Y499W、Y499K。

相应的，所述“将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质”的编码基因具体为与SEQ ID No.3相比，存在或仅存在如下任一个或多个突变：GAC 901-903 TAT；TTC 1234-1236 CAG；TTC 1237-1239 CAT；TTC 1237-1239 AAT；TTC 1312-1314 CTG；ATC 1228-1230 AAT；ATC 1486-1488GTT；CTG 241-243 AGC；AAC 1477-1479 CTG；AAC 1477-1479 TAT；CGT 106-109 GAA；CGT106-109 GGT；CGT 1240-1242 AAA；GTT 97-99 ATT；GTT 97-99 TAT；TAC 751-753 TTT；TAC751-753 CTG；TAC 1495-1497 TGG；TTC 1234-1236 GCA；TTC 1312-1314 ATG；TCT 1309-1311 ACC；GTT 1462-1464 TGG；TAC 1495-1497 AAA。

第三、本发明请求保护Ceas2蛋白突变体或其相关生物材料。

所述Ceas2蛋白突变体具体为前文所述的“将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质”。

所述相关生物材料为能够表达所述Ceas2蛋白突变体的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

在本发明中，所述核酸分子为所述Ceas2蛋白突变体的编码基因。具体如下：与SEQID No.3相比，存在或仅存在如下任一个或多个突变：GAC 901-903 TAT；TTC 1234-1236CAG；TTC 1237-1239 CAT；TTC 1237-1239 AAT；TTC 1312-1314 CTG；ATC 1228-1230 AAT；ATC 1486-1488 GTT；CTG 241-243 AGC；AAC 1477-1479 CTG；AAC 1477-1479 TAT；CGT106-109 GAA；CGT 106-109 GGT；CGT 1240-1242 AAA；GTT 97-99 ATT；GTT 97-99 TAT；TAC751-753 TTT；TAC 751-753 CTG；TAC 1495-1497 TGG；TTC 1234-1236 GCA；TTC 1312-1314ATG；TCT 1309-1311 ACC；GTT 1462-1464 TGG；TAC 1495-1497 AAA。

在本发明中，对于氨基酸取代，使用下述命名法：原始氨基酸，位置，取代氨基酸。对于碱基取代，使用下述命名法：原始碱基，位置，取代碱基。

与现有技术相比，本发明所提供的丙烯酸生物合成方法不依赖于维生素B-12和辅酶CoA，具有潜在的应用前景。本发明的实现为丙烯酸的生物合成打开了一扇新的大门，为实现生物基丙烯酸的工业生产奠定了基础。

附图说明

图1为pET-28a-ceas2质粒图谱。

图2为Ni-NTA纯化重组蛋白Ceas2。

图3为Ceas2功能鉴定液相色谱图。

图4为全细胞催化不同C源生成丙烯酸。

图5为不同突变体全细胞催化甘油生成丙烯酸。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例进一步说明本发明，但并不限制本发明的范围。部分分子克隆方法细节依据试剂、酶或试剂盒提供商家不同而有所差别，应当按照产品说明进行操作，在实施例中不再详细描述。

实施例1、Ceas2蛋白的获得

一、ceas2基因获得

在棒状链霉菌中发现ceas2基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1，该基因编码的蛋白为Ceas2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.2，在不改变ceas2氨基酸序列的前提下，将上述野生型ceas2基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，得到优化后ceas2基因序列，具有大肠杆菌偏爱密码子，其基因序列为SEQ ID No.3。

二、表达载体的构建

将SEQ ID No.3所示的优化后ceas2基因替换pET-28a载体(Novagen，Kan⁺，见图1)酶切位点NdeI和XhoI之间的DNA片段，得到重组质粒，命名为pET-28a-ceas2。

三、Ceas2的表达

为了体外检测Ceas2酶活性，在大肠杆菌中对该酶进行外源表达及纯化。

(1)将大肠杆菌表达型重组质粒pET-28a-ceas2转入E.coli BL21(DE3)中，获得重组菌。采用卡那霉素抗性平板进行阳性克隆筛选(Kan⁺，100mg/mL)，37℃过夜培养；

(2)挑单克隆至5mL LB液体培养基中(Kan⁺，100mg/mL)，37℃、220r/min培养至OD₆₀₀为0.6-0.8。将5mL LB培养基中菌液转接至800mL 2YT培养基中(Kan⁺，100mg/mL)，37℃、220rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，降温至16℃，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导表达16h；

(3)将上述培养菌液收集到收菌瓶中，5500r/min离心15min；

(4)弃上清，用35mL蛋白缓冲液(50mM Tris-HCl，2mM EDTA，体积百分含量0.1％Triton X-100，pH7.4)将所得菌体沉淀悬起，倒入50mL离心管中，-80℃冰箱保存。

四、蛋白纯化

(1)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200bar，4℃条件下对于上述三得到的菌体沉淀破菌2次。4℃、10000r/min离心45min，取离心后的沉淀、上清，制样；

(2)纯化：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：

a：柱平衡：挂上清前，先用ddH₂O洗2个柱体积，再用蛋白缓冲液(配方同上)平衡Ni亲和层析柱1个柱体积；

b：上样：将上清按0.5mL/min流速缓慢经过Ni亲和层析柱，再重复一次；

c：洗脱杂蛋白：采用蛋白缓冲液(配方同上)冲洗1个柱体积，再用50mL含50mM咪唑的蛋白缓冲液(配方同上)去洗脱结合较强的杂蛋白，取前几滴流穿样品，制样；

d：洗脱目的蛋白：分别用20mL含100mM，200mM，300mM咪唑的蛋白缓冲液(配方同上)将目的蛋白洗脱下来，取前几滴流穿样品，制样，12％SDS-PAGE检测。结果如图2所示，泳道M为不同分子量的marker。泳道1、2、3分别为含100mM，200mM，300mM咪唑的蛋白缓冲液洗脱后的蛋白样品。由图可见，蛋白纯度高于90％。

(3)浓缩换液：将收集到的目的蛋白用50mL Amicon超滤管(30kDa，Millipore公司)离心浓缩(4℃、3400r/min)，浓缩至1mL。加10mL蛋白缓冲液(配方同上)，浓缩至1mL，重复该过程1次，得到纯化蛋白Ceas2。

(4)用Nondrop 2000微量分光光度计检测浓缩后蛋白浓度，为4mg/mL。即得到纯化浓缩的Ceas2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.2。

实施例2、Ceas2在生物合成丙烯酸中的应用

一、Ceas2催化DHAP或D-G3P缩合合成丙烯酸

反应方程式如下1)或2)：

二、体外纯酶反应

空白对照反应体系(200μL)：5mM DHAP或D-G3P，2mM TPP(焦磷酸硫胺素)，6mMMgSO₄和蛋白缓冲液(50mM Tris-HCl，2mM EDTA，体积百分含量0.1％Triton X-100，pH8.2)。

Ceas2反应体系(200μL)：5mM DHAP或D-G3P，2mM TPP(焦磷酸硫胺素)，6mM MgSO₄、1mg/ml实施例1制备纯化的Ceas2蛋白和蛋白缓冲液(50mM Tris-HCl，2mM EDTA，体积百分含量0.1％Triton X-100，pH8.2)。

上述反应体系中，各物质的浓度均为在反应体系中的终浓度。

将上述各组反应体系混匀后于30℃反应10h。反应结束后，12000rpm离心2min,所得上清液用0.22μm滤器过滤后，进行HPLC检测，所用液相为Agilent 1260，色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H Column(300mm×7.8mm)，紫外检测器，检测波长210nm。流动相为5mM硫酸，柱温35℃，流速0.6mL/min。

结果如图3所示。由图可见，ceas2可以催化DHAP或D-G3P生成丙烯酸。

三、全细胞反应

1、培养条件

(1)挑取含pET-28a-ceas2质粒的BL21(DE3)单克隆接种于含5mL LB液体培养基(Kan⁺，100μg/mL)的小试管中，37℃摇床过夜培养。

(2)将4mL小试管菌液转入200mL的2YT液体培养基(Kan⁺，100μg/mL)中，37℃、220r/min，培养至OD 600约为0.6-0.8。

(3)加入IPTG至终浓度0.5mM，16℃诱导表达14h。

2、催化反应

(1)收菌：4℃，5500rpm离心15min，弃上清。

(2)洗杂：用20mL Ceas2全细胞缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.2)重悬菌体，5500rpm离心15min，弃上清。

(3)反应：加入全细胞催化缓冲液重悬菌体(50mM Tris-HCl，pH8.2，含1％体积百分含量的葡萄糖或甘油)，置于37℃、220rpm反应。10h后取样1mL，12000rpm离心5min，0.22μm滤器过滤。

(4)检测：HPLC检测，所用液相为Agilent 1260，色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H Column(300mm×7.8mm)，紫外检测器，检测波长210nm。流动相为5mM硫酸，柱温35℃，流速0.6mL/min。

结果如图4所示。由图可见，在已表达Ceas2蛋白的重组细胞中，以碳源为底物可以合成丙烯酸。

实施例3、Ceas2不同突变体在生物合成丙烯酸中的应用

一、定点突变

对重组质粒pET-28a-ceas2进行定点突变。定点突变采用Fast site-directMutagenesis System kit(Transgene，FM111-02)试剂盒方法。

ceas2蛋白的具体突变形式共涉及29种，如表1所示。

表1 ceas2突变体蛋白和基因突变位点

注：蛋白取代的编号是从SEQ ID No.2所示氨基酸序列的N端为起始的；基因取代的编号是从SEQ ID No.3所示核苷酸序列的5’端为起始的。表中，对于氨基酸取代，使用下述命名法：原始氨基酸，位置(即在SEQ ID No.2中的位置)，取代氨基酸。相应地，在SEQ IDNo.2的第310位用酪氨酸取代原有的天冬氨酸命名为“D310Y”。对于碱基取代，使用下述命名法：原始碱基，位置(即在SEQ ID No.3中的位置)，取代碱基。相应的，在SEQ ID No.3的第901-903位用TAT取代原有的GAC命名为“GAC901-903TAT”。

二、突变体全细胞反应

按照实施例2中方法(碳源为甘油)。

结果如图5所示。由图可见，氨基酸突变之后仍然有可能具有催化DHAP或D-G3P生成丙烯酸的功能，部分氨基酸突变之后，催化活性增加。

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种丙烯酸的生物合成方法及应用

<130> GNCLN171964

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1722

<212> DNA

<213> 棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）

<400> 1

atgtcccgtg tatcgaccgc ccccagcggc aagcctaccg ccgctcacgc cctcctgtca 60

cggttgcgtg atcacggtgt ggggaaggtg tttggggttg tcggccgaga ggccgcgtcg 120

attctcttcg acgaggtcga ggggatcgac ttcgttctga cccgccacga gttcaccgcg 180

ggtgtcgccg ctgatgtcct cgcgcggatc accggtcgcc cccaggcgtg ctgggccacc 240

ctgggccccg gtatgaccaa cctctccacc ggtatcgcca cgtccgtcct ggaccgctcg 300

ccggtcatcg cgctcgccgc gcagtcggag tcgcacgaca tcttcccgaa cgacacccac 360

cagtgcctgg actcggtggc gatcgtcgcc ccgatgtcca agtacgccgt ggagctccag 420

cggccccacg agatcaccga cctcgtcgac tccgccgtga acgcggccat gaccgagccg 480

gtcgggccct ccttcatctc cctcccggtg gacctgctcg gctcctccga gggcatcgac 540

accaccgtcc ccaacccgcc ggcgaacacc ccggcgaaac cggtcggcgt cgtcgccgac 600

ggctggcaga aggccgccga ccaggccgcc gccctgctcg ccgaggccaa gcacccggtg 660

ctcgtcgtcg gagcggccgc gatccgctcg ggcgccgtcc cggcgatccg cgccctggcc 720

gagcgcctga acatcccggt catcacgacc tacatcgcca agggtgtcct gccggtcggc 780

cacgagctga actacggcgc cgtcaccggc tacatggacg gcatcctcaa cttcccggcg 840

ctccagacca tgttcgcccc ggtggacctc gtcctcaccg tcggctacga ctacgccgag 900

gacctgcgcc cgtccatgtg gcagaagggc atcgagaaga agaccgtccg tatctccccg 960

acggtcaacc cgatcccccg ggtctaccgg cccgacgtcg acgtcgtcac cgacgtcctc 1020

gccttcgtgg agcacttcga gaccgcgacc gcctccttcg gggccaagca gcgccacgac 1080

atcgagccgc tgcgcgcccg gatcgcggag ttcctggccg acccggagac ctacgaggac 1140

ggcatgcgcg tccaccaggt catcgactcc atgaacaccg tcatggagga ggccgccgag 1200

cccggcgagg gcacgatcgt ctccgacatc ggcttcttcc gtcactacgg tgtgctcttc 1260

gcccgcgccg accagccctt cggcttcctc acctcggcgg gctgctccag cttcggctac 1320

ggcatccccg ccgccatcgg cgcccagatg gcccgcccgg accagccgac cttcctcatc 1380

gcgggtgacg gcggcttcca ctccaacagc tccgacctgg agaccatcgc ccggctcaac 1440

ctgccgatcg tgaccgtcgt cgtcaacaac gacaccaacg gcctgatcga gctgtaccag 1500

aacatcggtc accaccgcag ccacgacccg gcggtcaagt tcggcggcgt cgacttcgtc 1560

gcgctcgccg aggccaacgg tgtcgacgcc acccgcgcca ccaaccgcga ggagctgctc 1620

gcggccctgc gcaagggtgc cgagctgggt cgtccgttcc tcatcgaggt cccggtcaac 1680

tacgacttcc agccgggcgg cttcggcgcc ctgagcatct ga 1722

<210> 2

<211> 573

<212> PRT

<213> 棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）

<400> 2

Met Ser Arg Val Ser Thr Ala Pro Ser Gly Lys Pro Thr Ala Ala His

1 5 10 15

Ala Leu Leu Ser Arg Leu Arg Asp His Gly Val Gly Lys Val Phe Gly

20 25 30

Val Val Gly Arg Glu Ala Ala Ser Ile Leu Phe Asp Glu Val Glu Gly

35 40 45

Ile Asp Phe Val Leu Thr Arg His Glu Phe Thr Ala Gly Val Ala Ala

50 55 60

Asp Val Leu Ala Arg Ile Thr Gly Arg Pro Gln Ala Cys Trp Ala Thr

65 70 75 80

Leu Gly Pro Gly Met Thr Asn Leu Ser Thr Gly Ile Ala Thr Ser Val

85 90 95

Leu Asp Arg Ser Pro Val Ile Ala Leu Ala Ala Gln Ser Glu Ser His

100 105 110

Asp Ile Phe Pro Asn Asp Thr His Gln Cys Leu Asp Ser Val Ala Ile

115 120 125

Val Ala Pro Met Ser Lys Tyr Ala Val Glu Leu Gln Arg Pro His Glu

130 135 140

Ile Thr Asp Leu Val Asp Ser Ala Val Asn Ala Ala Met Thr Glu Pro

145 150 155 160

Val Gly Pro Ser Phe Ile Ser Leu Pro Val Asp Leu Leu Gly Ser Ser

165 170 175

Glu Gly Ile Asp Thr Thr Val Pro Asn Pro Pro Ala Asn Thr Pro Ala

180 185 190

Lys Pro Val Gly Val Val Ala Asp Gly Trp Gln Lys Ala Ala Asp Gln

195 200 205

Ala Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala Lys His Pro Val Leu Val Val Gly

210 215 220

Ala Ala Ala Ile Arg Ser Gly Ala Val Pro Ala Ile Arg Ala Leu Ala

225 230 235 240

Glu Arg Leu Asn Ile Pro Val Ile Thr Thr Tyr Ile Ala Lys Gly Val

245 250 255

Leu Pro Val Gly His Glu Leu Asn Tyr Gly Ala Val Thr Gly Tyr Met

260 265 270

Asp Gly Ile Leu Asn Phe Pro Ala Leu Gln Thr Met Phe Ala Pro Val

275 280 285

Asp Leu Val Leu Thr Val Gly Tyr Asp Tyr Ala Glu Asp Leu Arg Pro

290 295 300

Ser Met Trp Gln Lys Gly Ile Glu Lys Lys Thr Val Arg Ile Ser Pro

305 310 315 320

Thr Val Asn Pro Ile Pro Arg Val Tyr Arg Pro Asp Val Asp Val Val

325 330 335

Thr Asp Val Leu Ala Phe Val Glu His Phe Glu Thr Ala Thr Ala Ser

340 345 350

Phe Gly Ala Lys Gln Arg His Asp Ile Glu Pro Leu Arg Ala Arg Ile

355 360 365

Ala Glu Phe Leu Ala Asp Pro Glu Thr Tyr Glu Asp Gly Met Arg Val

370 375 380

His Gln Val Ile Asp Ser Met Asn Thr Val Met Glu Glu Ala Ala Glu

385 390 395 400

Pro Gly Glu Gly Thr Ile Val Ser Asp Ile Gly Phe Phe Arg His Tyr

405 410 415

Gly Val Leu Phe Ala Arg Ala Asp Gln Pro Phe Gly Phe Leu Thr Ser

420 425 430

Ala Gly Cys Ser Ser Phe Gly Tyr Gly Ile Pro Ala Ala Ile Gly Ala

435 440 445

Gln Met Ala Arg Pro Asp Gln Pro Thr Phe Leu Ile Ala Gly Asp Gly

450 455 460

Gly Phe His Ser Asn Ser Ser Asp Leu Glu Thr Ile Ala Arg Leu Asn

465 470 475 480

Leu Pro Ile Val Thr Val Val Val Asn Asn Asp Thr Asn Gly Leu Ile

485 490 495

Glu Leu Tyr Gln Asn Ile Gly His His Arg Ser His Asp Pro Ala Val

500 505 510

Lys Phe Gly Gly Val Asp Phe Val Ala Leu Ala Glu Ala Asn Gly Val

515 520 525

Asp Ala Thr Arg Ala Thr Asn Arg Glu Glu Leu Leu Ala Ala Leu Arg

530 535 540

Lys Gly Ala Glu Leu Gly Arg Pro Phe Leu Ile Glu Val Pro Val Asn

545 550 555 560

Tyr Asp Phe Gln Pro Gly Gly Phe Gly Ala Leu Ser Ile

565 570

<210> 3

<211> 1719

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

atgtctcgtg tttctaccgc tccgtctggt aaaccgaccg ctgctcacgc tctgctgtct 60

cgtctgcgtg accacggtgt tggtaaagtt ttcggtgttg ttggtcgtga agctgcttct 120

atcctgttcg acgaagttga aggtatcgac ttcgttctga cccgtcacga attcaccgct 180

ggtgttgctg ctgacgttct ggctcgtatc accggtcgtc cgcaggcttg ctgggctacc 240

ctgggtccgg gtatgaccaa cctgtctacc ggtatcgcta cctctgttct ggaccgttct 300

ccggttatcg ctctggctgc tcagtctgaa tctcacgaca tcttcccgaa cgacacccac 360

cagtgcctgg actctgttgc tatcgttgct ccgatgtcta aatacgctgt tgaactgcag 420

cgtccgcacg aaatcaccga cctggttgac tctgctgtta acgctgctat gaccgaaccg 480

gttggtccgt ctttcatctc tctgccggtt gacctgctgg gttcttctga aggtatcgac 540

accaccgttc cgaacccgcc ggctaacacc ccggctaaac cggttggtgt tgttgctgac 600

ggttggcaga aagctgctga ccaggctgct gctctgctgg ctgaagctaa acacccggtt 660

ctggttgttg gtgctgctgc tatccgttct ggtgctgttc cggctatccg tgctctggct 720

gaacgtctga acatcccggt tatcaccacc tacatcgcta aaggtgttct gccggttggt 780

cacgaactga actacggtgc tgttaccggt tacatggacg gtatcctgaa cttcccggct 840

ctgcagacca tgttcgctcc ggttgacctg gttctgaccg ttggttacga ctacgctgaa 900

gacctgcgtc cgtctatgtg gcagaaaggt atcgaaaaaa aaaccgttcg tatctctccg 960

accgttaacc cgatcccgcg tgtttaccgt ccggacgttg acgttgttac cgacgttctg 1020

gctttcgttg aacacttcga aaccgctacc gcttctttcg gtgctaaaca gcgtcacgac 1080

atcgaaccgc tgcgtgctcg tatcgctgaa ttcctggctg acccggaaac ctacgaagac 1140

ggtatgcgtg ttcaccaggt tatcgactct atgaacaccg ttatggaaga agctgctgaa 1200

ccgggtgaag gtaccatcgt ttctgacatc ggtttcttcc gtcactacgg tgttctgttc 1260

gctcgtgctg accagccgtt cggtttcctg acctctgctg gttgctcttc tttcggttac 1320

ggtatcccgg ctgctatcgg tgctcagatg gctcgtccgg accagccgac cttcctgatc 1380

gctggtgacg gtggtttcca ctctaactct tctgacctgg aaaccatcgc tcgtctgaac 1440

ctgccgatcg ttaccgttgt tgttaacaac gacaccaacg gtctgatcga actgtaccag 1500

aacatcggtc accaccgttc tcacgacccg gctgttaaat tcggtggtgt tgacttcgtt 1560

gctctggctg aagctaacgg tgttgacgct acccgtgcta ccaaccgtga agaactgctg 1620

gctgctctgc gtaaaggtgc tgaactgggt cgtccgttcc tgatcgaagt tccggttaac 1680

tacgacttcc agccgggtgg tttcggtgct ctgtctatc 1719

Claims

1.Ceas2蛋白或其相关生物材料在丙烯酸生物合成中的应用；

在所述应用中，以磷酸二羟基丙酮或/和3-磷酸甘油醛为底物；

所述Ceas2蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；

（A2）与SEQ ID No.2相比，仅存在如下突变的蛋白质：V33I；

（A3）在（A1）或（A2）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述相关生物材料为能够表达所述Ceas2蛋白的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

2.一种丙烯酸生物合成方法，包括如下步骤：以Ceas2蛋白为生物酶，催化底物生成丙烯酸；所述底物为磷酸二羟基丙酮或/和3-磷酸甘油醛；

所述Ceas2蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；

（A2）与SEQ ID No.2相比，仅存在如下突变的蛋白质：V33I；

（A3）在（A1）或（A2）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：在以所述Ceas2蛋白为生物酶催化所述底物生成丙烯酸的反应中，所述Ceas2蛋白与所述底物的用量配比为0.9-1.1g：1mol。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：在以所述Ceas2蛋白为生物酶催化所述底物生成丙烯酸的反应中，反应温度为30℃，反应时间为10h。

5.一种丙烯酸生物合成方法，包括如下步骤：（1）在宿主细胞中表达Ceas2蛋白，得到重组细胞；（2）以碳源为底物利用所述重组细胞合成丙烯酸；

所述碳源为能够在所述宿主细胞中转化成磷酸二羟基丙酮或/和3-磷酸甘油醛的碳源；所述碳源为甘油或者葡萄糖；

所述Ceas2蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；

（A2）与SEQ ID No.2相比，仅存在如下突变的蛋白质：V33I；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）为：向所述宿主细胞中导入能够表达所述Ceas2蛋白的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述Ceas2蛋白的所述重组细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：能够表达所述Ceas2蛋白的核酸分子是通过重组载体的形式导入到所述宿主细胞中的。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述重组载体为携带有所述Ceas2蛋白的编码基因的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质粒。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞为原核细胞或低等真核细胞。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述原核细胞为细菌；所述低等真核细胞为酵母细胞。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述细菌为大肠杆菌。

12.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：能够表达所述Ceas2蛋白的核酸分子为所述Ceas2蛋白的编码基因，为如下任一：

（B1）SEQ ID No.3所示的DNA分子；

（B2）与SEQ ID No.3相比，仅存在如下突变的DNA分子： GTT 97-99 ATT。

13.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述“以碳源为底物利用所述重组细胞合成丙烯酸”是通过全细胞催化反应或者发酵培养所述重组细胞实现的。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：当所述“以碳源为底物利用所述重组细胞合成丙烯酸”通过全细胞催化反应实现时，所述步骤（2）包括：将所述重组细胞悬于含有所述碳源的反应液中，37℃震荡反应10h。

15.Ceas2蛋白突变体或其相关生物材料；

所述Ceas2蛋白突变体为与SEQ ID No.2相比，仅存在如下突变的蛋白质：V33I；

所述相关生物材料为能够表达所述Ceas2蛋白突变体的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌。