CN110938579A

CN110938579A - 酪氨酸解氨酶重组菌、酪氨酸解氨酶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110938579A
Application number: CN201911284391.3A
Authority: CN
Inventors: 陶福平; 秦勇; 张炜; 占纪勋
Original assignee: Hangzhou Viablife Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Viablife Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2020-03-31

Abstract

本发明提供一种酪氨酸解氨酶重组菌、酪氨酸解氨酶及其制备方法和应用，其中，酪氨酸解氨酶重组菌的构建方法包括以下步骤：提取具有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的目标基因；将目标基因连接至质粒，获得重组质粒；将重组质粒导入菌体，获得酪氨酸解氨酶重组菌。目的在于提供一种酪氨酸解氨酶重组菌、酪氨酸解氨酶及其制备方法和应用，酪氨酸解氨酶的转化效率高，稳定性好。

Description

酪氨酸解氨酶重组菌、酪氨酸解氨酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种酪氨酸解氨酶重组菌、酪氨酸解氨酶及其制备方法和应用。

背景技术

TAL(Tyrosine ammonia lyase，酪氨酸解氨酶)是一种重要的苯丙素类化合物前体转化关键酶，能够高效地将酪氨酸转化为肉桂酸，实现进一步的产物应用。植物中发现TAL存在于高粱、大麦、小麦、燕麦、水稻、玉米、甜甘蔗、欧芹等单子叶植物中。微生物中则已发现担子菌、荚膜红细菌、放线菌、粘红酵母及丝孢酵母。由于自然界中肉桂酸含量的限制，导致生物转化苯丙烷代谢受限，并进一步限制了苯丙素类活性化合物的应用开发工作。因此，需要开发一种促进苯丙烷代谢的酶，进而提高产物的产量。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酪氨酸解氨酶重组菌、酪氨酸解氨酶及其制备方法和应用，酪氨酸解氨酶的转化效率高，稳定性好。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

本发明提供一种酪氨酸解氨酶重组菌，所述酪氨酸解氨酶重组菌中具有如SEQ IDNO.1和/或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的重组质粒。

在一个具体实施例中，酪氨酸解氨酶重组菌的构建方法包括以下步骤：

提取具有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的目标基因；将目标基因连接至质粒，获得重组质粒；将重组质粒导入菌体，获得酪氨酸解氨酶重组菌。

在一个具体实施例中，将目标基因连接至质粒，获得重组质粒，包括以下步骤：对目标基因进行扩增后连接到第一质粒，获得重组载体；对重组载体进行酶切处理，得到目标基因片段；将目标基因片段连接到第二质粒，获得重组质粒。

本发明还提供一种酪氨酸解氨酶的制备方法，对上述任一实施例所述的酪氨酸解氨酶重组菌进行培养，获得菌体；将所述菌体破碎后进行离心分离，收集上清液；将所述上清液进行分离纯化，获得酪氨酸解氨酶。

在一个具体实施例中，对酪氨酸解氨酶重组菌进行培养，获得菌体，包括以下步骤：在含有5～70μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在100～500rpm、25～45℃条件下，扩大培养至OD₆₀₀达到0.4～0.6时，并向培养基中添加80～320μM异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，持续培养8～16小时，获得菌体。

本发明还提供一种通过上述任一实施例所述的酪氨酸解氨酶的制备方法制备的酪氨酸解氨酶。

本发明还提供一种酪氨酸解氨酶在苯丙素类化合物前体转化中的应用。

在一个具体实施例中，将0.01～0.05摩尔体积的第一酪氨酸解氨酶和/或第二酪氨酸解氨酶加入pH为7.0～12.0的磷酸盐缓冲溶液中，并加入40～60摩尔体积的甘氨酸碱性缓冲液、10～20摩尔体积的酪氨酸或苯丙氨酸，混合均匀在30℃～70℃下培育不少于1小时，再在沸水浴中处理8～15min，再进行离心处理，获取上清液，获得3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酸或3-苯基-2-丙烯酸。

本发明还提供一种酪氨酸解氨酶重组菌在苯丙素类化合物前体转化中的应用。

在一个具体实施例中，将所述第一酪氨酸解氨酶重组菌和/或所述第二酪氨酸解氨酶重组菌采用含有5～70μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养，100～500rpm，25～45℃，培养至OD₆₀₀达到0.4～0.6时，并向培养基中添加80～320μM异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，持续培养8～16小时后进行分离、清洗，收集重组菌体，将所述重组菌体转入pH为7～12的磷酸盐缓冲溶液中，并加入0.01～0.05摩尔体积的酪氨酸或苯丙氨酸，混合均匀，在100～500rpm、28～37℃条件下反应4～8小时；再向反应液中加入100～300摩尔体积的盐酸后，进行离心，取上清液，获得3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酸或3-苯基-2-丙烯酸。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明先提取SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的目标基因，通过PCR扩增并连接到质粒获得重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌获得酪氨酸解氨酶重组菌。将获得的酪氨酸解氨酶重组菌经过扩大培养、分离、纯化后获得酪氨酸解氨酶。

另外，酪氨酸解氨酶重组菌和酪氨酸解氨酶均可对苯丙素类化合物具有高效催化作用，且生产易操作、稳定性好，适于大规模工业化生产。

附图说明

图1为本发明酪氨酸解氨酶和重组质粒的电泳图；

图2为本发明酪氨酸解氨酶的pH适应曲线；

图3为本发明酪氨酸解氨酶的温度适应曲线；

图4为本发明酪氨酸转化为3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酸产物液相检测；

图5为本发明苯丙氨酸转化为3-苯基-2-丙烯酸产物液相检测。

具体实施方式

以下将结合附图，对本发明进行更为详细的描述，需要说明的是，以下参照附图对本发明进行的描述仅是示意性的，而非限制性的。各个不同实施例之间可以进行相互组合，以构成未在以下描述中示出的其他实施例。

本发明还提供一种重组质粒，该重组质粒包含有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列的一种或两种酪氨酸解氨酶表达基因。

本发明提供一种酪氨酸解氨酶重组菌，该酪氨酸解氨酶重组菌中具有如如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的重组质粒，也就是说，该酪氨酸重组菌包含有上述一种或两种重组表达质粒，用于表达上述一种或两种酪氨酸解氨酶。

具体地，TAL(Tyrosine ammonia lyase，酪氨酸解氨酶)是一种重要的苯丙素类化合物前体转化关键酶，能够高效地将酪氨酸转化为肉桂酸，实现进一步的产物应用。本发明通过对已知TAL来源菌种的基因进行分析查找近似基因组，在基因库中筛选近似基因序列并进行确认，对确认具备相应基因序列的菌种序列进行克隆复制、扩大培养。实验研究发现糖丝菌属Saccharothrix sp.NRRL B-16348和链霉菌属Streptomyces sp.NRRL F-4489全基因组中潜在有TAL近似功能的基因序列，通过设计引物序列，将疑似序列进行克隆扩增和表达(工程菌)，用底物进行测试，确定其确实具有相应底物转化功能(酪氨酸和苯丙氨酸转化)，同时效率较好。

本发明提供一种酪氨酸解氨酶重组菌的构建方法，包括以下步骤：提取具有如SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的目标基因；将目标基因连接至质粒，获得重组质粒；将重组质粒导入菌体，获得酪氨酸解氨酶重组菌。其中，将目标基因连接至质粒，获得重组质粒，包括以下步骤：对目标基因进行扩增后连接到第一质粒，获得重组载体；对重组载体进行酶切处理，得到目标基因片段；将目标基因片段连接到第二质粒，获得重组质粒。

具体地，酪氨酸解氨酶重组菌的构建方法，包括以下步骤：(1)提取基因：使用Quick-DNA全序列提取试剂盒(Zymo Research,USA)从所述糖丝菌属菌株中进行全基因序列提取，并获得第一目标基因Sas-TAL，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或使用Quick-DNA全序列提取试剂盒(Zymo Research,USA)从所述链霉菌属菌株中进行全基因序列提取，并获得第二目标基因Sts-TAL，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(2)构建质粒：对所述第一目标基因Sas-TAL进行PCR扩增，对核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的所述第一目标基因进行PCR扩增的引物序列为：

上游引物：AACATATGACCGACGCCCCCGTGGACCT，

下游引物：TAAAGCTTCTCGAGTCAGTACCGGCCCCCGGTGACCG，其中，扩增体系为前端引物1μL，全基因序列0.2μL，dNTP混合液200μM，5×浓缩缓冲液4μL，二甲基亚砜0.4μL，高保真DNA连接酶0.2μL(2U/μL)，添加超纯水定容至20μL扩增体系；扩增反应条件为先在98℃条件下预变性处理5min；再在98℃条件下变性处理40s，在56℃条件下变性处理40s，在72℃条件下变性处理3.5min，循环30组；再在72℃条件下延长处理10min。利用第一质粒pJET1.2与GeneJET Gel提取试剂盒(赛默飞)，通过扩增后的基因序列与0.8％琼脂胶混合后得到第一重组载体pJET1.2-Sas-TAL，采用限制性内切酶针对酶切位点NdeI和HindIII对第一重组载体进行酶切处理，获得第一目标基因片段，将所述第一基因片段连接到受体质粒第二质粒pET28a相应位点上，形成目标第一重组质粒pET28a-Sas-tal。

对所述第二目标基因Sts-TAL进行PCR扩增，对核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的所述第二目标基因进行PCR扩增的引物序列为：上游引物：AACATATGCCGAGTCTGGACAGCAT，下游引物：TAAAGCTTCTCGAGTCAGGCGGCGCCGGTCAGCT。其中，扩增体系为前端引物1μL，全基因序列0.2μL，dNTP混合液200μM，5×浓缩缓冲液4μL，二甲基亚砜0.4μL，高保真DNA连接酶0.2μL(2U/μL)，添加超纯水定容至20μL扩增体系；扩增反应条件为先在98℃条件下预变性处理5min；再在98℃条件下变性处理40s，在56℃条件下变性处理40s，在72℃条件下变性处理3.5min，循环30组；再在72℃条件下延长处理10min。利用第一质粒pJET1.2与GeneJET Gel提取试剂盒(赛默飞)，通过扩增后的基因序列与0.8％琼脂胶混合后得到第二重组载体pJET1.2-Sts-TAL，采用限制性内切酶针对酶切位点NdeI和HindIII对第二重组载体进行酶切处理，获得第二目标基因片段，将所述第二基因片段连接到受体质粒第二质粒pET28a相应位点上，形成目标第二重组质粒pET28a-Sts-tal。

(3)构建重组菌：利用聚二乙醇-醋酸锂介导法，将所述第一重组质粒导入如大肠杆菌载体DE3等受体细胞中，获得第一酪氨酸解氨酶重组菌DE3-Sas-TAL；利用聚二乙醇-醋酸锂介导法，将所述第二重组质粒导入大肠杆菌DE3中，获得第二酪氨酸解氨酶重组菌DE3-Sts-TAL；

本发明还提供一种酪氨酸解氨酶的制备方法，即酪氨酸解氨酶(TAL)活性酶的分离获取方法：将酪氨酸解氨酶重组菌进行培养获得菌体，将所述菌体破碎后进行离心分离，收集上清液；将所述上清液进行分离纯化，获得酪氨酸解氨酶。具体地，将所述第一酪氨酸解氨酶重组菌和/或所述第二酪氨酸解氨酶重组菌在含有5～70μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在100～500rpm、25～45℃条件下扩大培养，培养至OD₆₀₀达到0.4～0.6时，并向培养基中添加80～320μM异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，持续培养8～16小时，获得菌体，将所述菌体破碎后进行离心分离，收集上清液，再将所述上清液进行Ni亲和纯化，获得第一酪氨酸解氨酶和第二酪氨酸解氨酶。

具体地，将第一酪氨酸解氨酶重组菌和/或第二酪氨酸解氨酶重组菌在添加有卡那霉素(50μg/mL)的LB肉汤培养基中培养，在250rpm、37℃条件下，扩大培养培养至OD₆₀₀达到0.4-0.6时，将培养温度调整为28℃，并向培养基中添加200μM异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，持续培养12小时，获得菌体。将上述培养获得的菌体破碎并进行在3000×g、4℃条件下离心10min，分离所得固形物用蒸馏水洗涤2次，然后再重溶于20mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸溶液(pH 7.9，添加0.5M氯化钠)。在将上述重溶溶液置于冰浴超声裂解，裂解液再次进行离心分离，在10000×g、4℃条件下离心10min，收集上清液。上清液利用HisPur^TM Ni-NTA亲和分离柱(Thermo Scientific，Rockford，美国)进行分离纯化，具体操作可参照设备说明指导进行，并分别获得纯化的活性蛋白酶Sas-TAL和Sts-TAL。对获得的酪氨酸解氨酶Sas-TAL和Sts-TAL进行电泳分析，结果如图1所示，其中，A为酪氨酸解氨酶Sas-TAL序列电泳鉴定；B为酪氨酸解氨酶Sts-TAL序列电泳鉴定；C中3为pET28a-Sas-TAL重组质粒序列鉴定，4为pET28a序列鉴定；D中5为pET28a-Sts-TAL重组质粒序列鉴定，6为pET28a序列鉴定。对酪氨酸解氨酶Sas-TAL和Sts-TAL的温度适应范围和pH适应范围进行测试，分别如图2和图3所示，酪氨酸解氨酶Sas-TAL和Sts-TAL在体外的温度适应范围为30℃～70℃；酪氨酸解氨酶Sas-TAL和Sts-TAL在体外的pH适应范围为7～12。

本发明还提供一种通过上述酪氨酸解氨酶的制备方法制备的酪氨酸解氨酶。本发明还提供一种酪氨酸解氨酶在苯丙素类化合物前体转化中的应用，采用纯化蛋白酶体外转化方法，利用酪氨酸解氨酶Sas-TAL和Sts-TAL中的一种或两种同时用进行相应产物制备。其中，苯丙素类化合物可以是酪氨酸、苯丙氨酸等。

在一个具体实施例中，在酪氨酸解氨酶活性酶体外进行相应产物的制备方法：将0.01～0.05摩尔体积的第一酪氨酸解氨酶和/或第二酪氨酸解氨酶加入pH为7.0～12.0的磷酸盐缓冲溶液中，并加入40～60摩尔体积的甘氨酸碱性缓冲液、10～20摩尔体积的酪氨酸，混合均匀在30℃～70℃下培育不少于1小时，再在沸水浴中处理8～15min，再进行离心处理，获取上清液，获得3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酸；

或者，将0.01～0.05摩尔体积的第一酪氨酸解氨酶和/或第二酪氨酸解氨酶加入pH为7.0～12.0的磷酸盐缓冲溶液中，并加入40～60摩尔体积的甘氨酸碱性缓冲液、10～20摩尔体积的苯丙氨酸，混合均匀在30℃～70℃下培育不少于1小时，再在沸水浴中处理8～15min，再进行离心处理，获取上清液，获得3-苯基-2-丙烯酸。

具体地，将6μM的第一酪氨酸解氨酶和/或3μM的第二酪氨酸解氨酶置于200μL、pH为7.0～12.0的磷酸盐缓冲溶液体系中，优选地，pH为11。再向体系中加入10mM甘氨酸碱性缓冲液或氯化钾碱性缓冲液、3mM酪氨酸，并混合均匀，在30℃～70℃下培育1小时，优选50℃。随后在沸水浴中处理10min，再将混合液在130,000×g条件下进行离心处理15min，获取上清液。对上清液进行高效液相色谱法(HPLC)进行检测鉴定，确认获得3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酸，HPLC检测结果如图4所示，其中图中(i)为酪氨酸液相检测；(iii)为活性酶体外转化产物液相检测；(iv)为3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酸标准品液相检测。

或者，将6μM的第一酪氨酸解氨酶和/或3μM的第二酪氨酸解氨酶置于200μL、pH为7.0～12.0的磷酸盐缓冲溶液中，优选地，pH为11，并加入10mM甘氨酸碱性缓冲液或氯化钾碱性缓冲液、3mM苯丙氨酸混合均匀，在30℃～70℃条件下，优选50℃培育1小时，再在沸水浴中处理10min，再进行离心处理，获取上清液。对上清液进行高效液相色谱法(HPLC)进行检测鉴定，获得3-苯基-2-丙烯酸。HPLC检测结果如图5所示，图中(i)苯丙氨酸液相检测；(ii)活性酶体内转化产物液相检测；(iii)活性酶体外转化产物液相检测；(iv)3-苯基-2-丙烯酸标准品液相检测。

本发明还提供一种酪氨酸解氨酶重组菌在苯丙素类化合物前体转化中的应用，重组细胞体内转化方法，利用酪氨酸解氨酶重组菌DE3-Sas-TAL和DE3-Sts-TAL中的一种或两种同时用进行相应产物制备；其中，苯丙素类化合物可以是酪氨酸、苯丙氨酸等。将所述第一酪氨酸解氨酶重组菌和/或所述第二酪氨酸解氨酶重组菌采用含有5～70μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养，100～500rpm，25～45℃，培养至OD₆₀₀达到0.4～0.6时，并向培养基中添加80～320μM异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，持续培养8～16小时后进行分离、清洗，收集重组菌体，将所述重组菌体转入pH为7～12的磷酸盐缓冲溶液中，并加入0.01～0.05摩尔体积的酪氨酸，混合均匀，在100～500rpm、28～37℃条件下反应4～8小时；再向反应液中加入100～300摩尔体积的盐酸后，进行离心，取上清液，获得3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酸。

或者，将所述第一酪氨酸解氨酶重组菌和/或所述第二酪氨酸解氨酶重组菌采用含有5～70μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养，100～500rpm，25～45℃，培养至OD₆₀₀达到0.4～0.6时，并向培养基中添加80～320μM异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，持续培养8～16小时后进行分离、清洗，收集重组菌体，将所述重组菌体转入pH为7～12的磷酸盐缓冲溶液中，并加入0.01～0.05摩尔体积的苯丙氨酸，混合均匀，在100～500rpm、28～37℃条件下反应4～8小时；再向反应液中加入100～300摩尔体积(如300摩尔体积)的盐酸后，进行离心，取上清液，获得3-苯基-2-丙烯酸。

具体地，将第一酪氨酸解氨酶重组菌和/或第二酪氨酸解氨酶重组菌采用含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养，在250rpm、37℃条件下，培养至OD₆₀₀达到0.4～0.6时，再将培养温度调整为28℃，并向培养基中添加200μM异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，持续培养12小时。然后将培养物在3,000×g、4℃条件下离心分离10min，获得固形物。将固形物用蒸馏水洗涤2次后，再将所述产物转入含有10mM、10mL、pH为7～12的磷酸盐缓冲溶液体系中，优选地pH为8，向体系中加入3mM酪氨酸并混合均匀，在250rpm、28℃条件下反应6小时。再向反应液中加入3M盐酸后，再将混合液在130,000×g条件下进行离心处理15min，获取上清液。对上清液进行高效液相色谱法(HPLC)进行检测鉴定，获得3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酸，HPLC液相检测结果如图4所示，其中(ii)为活性酶体内转化产物液相检测；

或者将第一酪氨酸解氨酶重组菌和/或第二酪氨酸解氨酶重组菌分别采用含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养，在250rpm、37℃条件下，培养至OD₆₀₀达到0.4～0.6时，再将培养温度调整为28℃，并向培养基中添加200μM异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，持续培养12小时。然后将培养物在3,000×g、4℃条件下离心分离10min，获得固形物。将固形物用蒸馏水洗涤2次后，再将所述产物转入含有10mM、10mL、pH为7～12的磷酸盐缓冲溶液体系中，优选地pH为8，向体系中加入3mM苯丙氨酸混合均匀，在250rpm、28℃条件下反应6h。再向反应液中加入3M盐酸后，再将混合液在130,000×g条件下进行离心处理15min，获取上清液。对上清液进行高效液相色谱法(HPLC)进行检测鉴定，获得3-苯基-2-丙烯酸。HPLC检测结果如图5所示，图中(ii)活性酶体内转化产物液相检测。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

序列表

<110> 杭州唯铂莱生物科技有限公司

<120> 酪氨酸解氨酶重组菌、酪氨酸解氨酶及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1485

<212> DNA

<213> 糖丝菌属(Saccharothrix )

<400> 1

gtgaccgacg cccccgtgga cctcggcgca ccgctgagga gcgaccacct ccaccgtgcc 60

gccgcgccgc taccggtgct cgtcagcccc gtcgtccggg aacgggtcga ccggggccgc 120

gagtacctgc gcacggtgct ggccgacgac gatcggcccg tctacggcgc caagaccggg 180

ttcggcgccc tgatcggctt cgcgggccgt gaggacgaag ccgaccaatg cgacaacacc 240

ctcgcacacc tcggcgcggg ccaagggccc gacctgcccg ccgacatcgc ccgcgccgcg 300

ctgctcgtgc gggcgtggtc gctcgcccag ggcgtctcgg gcgtgtccgc ggacgtgttg 360

gacgggctcg cggcgatgtt cgcgaccacg ttcgtgccgg cgatcccgcg ttacggctcg 420

gtcggcgcga gcggcgacct catcccgctc gcctacgcga cccaggcgtt gcgcggccgc 480

ggtcacgcct acctggacgg cgagcggatg cccgcggacg acgccctgcg ccgtgccggc 540

ctcacgccgc tcaccctcga cgggcgtgac gcgctggcgc tcgtcaacgg cacgtcggtc 600

acgaccgccg ccgcggctct cgcgctggac agcgtgcgcg cctcgcaccg tgcgatccag 660

gacttgacct gcctgctcgt ggacgtcgtc ggcggtgacc ccggtttcct cgacccacgg 720

ctgatctccg cgtacgggca ccccggcgcg gccaccgtcg ccgagcgcat gcgcgccacc 780

ctcgcgggca cggtgccgac cggtgagcgt gcgctccagg agccctacag catccggtgc 840

tcgccgcagc tgctcggcgc ggccgaggac gcgttgcgct acgtcgacgg cgtggtggcg 900

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cacggcggca acttcttcgg ccagccggcc gcgttcgccg ccgacgtgct ggccatggtc 1020

acggcgtcgt tgggcaacct cgccgaacgg cagctggacc tgctggtcga cccggtgcgc 1080

aacaccggcc tgccgccgat gctggcggcc ggacccggac gtcagcacgg gttgcagggc 1140

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gcgctgcgcg cctacgacgt cgcagaactg ctccggctgc tgtgcggctc gctggcgctc 1320

ggcctgcggc aggcggtcca cgtgggaggc cgccgaccga ccgcgccccg ctgcgccgct 1380

ctgctcgacg ccctcgccga cgcgatcgcc ccggtcgacc cggaccgccc gctcgacgcg 1440

gacgtgcggg cggccgccga cctggtcacc gggggccggt actga 1485

<210> 2

<211> 1479

<212> DNA

<213> 链霉菌属(Streptomyces)

<400> 2

atgccgagtc tggacagcat cgtcgaggcc gcctcctgga ccgccaagct cggcccgctc 60

accgacgccg acgtggcgcg gatggaccgc agcggcgcca ccgtcgacgc gtacctcgcc 120

gagggccggc ccgtctacgg gctcacccag ggcttcggcc cgctggtgac gtactccgcc 180

acctccgaga tggagcaggg cgcctcgctc atctcccacc tcggcaccgc ccagggccgc 240

ccgatcgacc cggacgcctc ccggctggtg ttctggctgc ggctgaacag catgcgcaag 300

ggcttctccg cggtctccac ggagttctgg cagcgcctcg ccgacctgtg gaacgccggc 360

ttcaccccgg tcatcccgcg cgacggcacg gtcagcgcga gcggcgacct ccagccgctg 420

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ctcggcgccg tcctggacca gctcaccacc gccggcgaga tcctgctccg cgaggccaac 900

ggctgcaccg acaaccccct cacctacgag gaccgggtgc tgcacgccgg caacttccac 960

gcgatgccgg tcggtttcgc ctccgagcag accggtctgg ccatgcacat ggccgcgtat 1020

ctggcggagc gtcagctcgg gctggtggtc aaccccacca ccaacggcga cctgccgatc 1080

atgctcaccc cgcgggccgg ccgcggctgc ggtctggccg gtgtgcagat cagcgcgacc 1140

tcgttcatct cccggatccg ccagctggtc acccccgcct cgctgaccac cctgccgacc 1200

aacggctgga atcaggacca cgtcccgatg gccctcaacg gcgccaacgg cgtcggcgag 1260

gccctggagc tgggctggct cgccgtcggc tcgctcgcgc tggccgccgc ccagctggcc 1320

gtgatgaccg gcaaggcgga gtccgccacc ggcgtctggg ccgaactcgc ccggatctcc 1380

cccgcgttgg acgccgaccg cccgatggcc ggcgaggtgc gcgccgccgc cgagctgttc 1440

cgcgaccacg cggagcgcca gctgaccggc gccgcctga 1479

Claims

1.一种酪氨酸解氨酶重组菌，其特征在于，所述酪氨酸解氨酶重组菌中具有如SEQ IDNO.1和/或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的重组质粒。

2.一种如权利要求1所述的酪氨酸解氨酶重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取具有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的目标基因；

将目标基因连接至质粒，获得重组质粒；

将重组质粒导入菌体，获得酪氨酸解氨酶重组菌。

3.如权利要求2所述的酪氨酸解氨酶重组菌的构建方法，其特征在于，将目标基因连接至质粒，获得重组质粒，包括以下步骤：

对目标基因进行扩增后连接到第一质粒，获得重组载体；

对重组载体进行酶切处理，得到目标基因片段；

将目标基因片段连接到第二质粒，获得重组质粒。

4.一种酪氨酸解氨酶的制备方法，其特征在于，对权利要求1所述的酪氨酸解氨酶重组菌进行培养，获得菌体；将所述菌体破碎后进行离心分离，收集上清液；将所述上清液进行分离纯化，获得酪氨酸解氨酶。

5.如权利要求4所述的酪氨酸解氨酶的制备方法，其特征在于，对酪氨酸解氨酶重组菌进行培养，获得菌体，包括以下步骤：在含有5～70μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在100～500rpm、25～45℃条件下，扩大培养至OD₆₀₀达到0.4～0.6时，并向培养基中添加80～320μM异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，持续培养8～16小时，获得菌体。

6.一种如权利要求4或5所述的酪氨酸解氨酶的制备方法制备的酪氨酸解氨酶。

7.一种如权利要求6所述的酪氨酸解氨酶在苯丙素类化合物前体转化中的应用。

8.如权利要求7所述的酪氨酸解氨酶在苯丙素类化合物前体转化中的应用，其特征在于，将0.01～0.05摩尔体积的酪氨酸解氨酶加入pH为7.0～12.0的磷酸盐缓冲溶液中，并加入40～60摩尔体积的甘氨酸碱性缓冲液、10～20摩尔体积的酪氨酸或苯丙氨酸，混合均匀在30℃～70℃下培育不少于1小时，再在沸水浴中处理8～15min，再进行离心处理，获取上清液，获得3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酸或3-苯基-2-丙烯酸。

9.一种权利要求1所述的酪氨酸解氨酶重组菌在苯丙素类化合物前体转化中的应用。

10.根据权利要求9中所述的酪氨酸解氨酶重组菌在苯丙素类化合物前体转化中的应用，其特征在于，将所述第一酪氨酸解氨酶重组菌和/或所述第二酪氨酸解氨酶重组菌采用含有5～70μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养，100～500rpm，25～45℃，培养至OD₆₀₀达到0.4～0.6时，并向培养基中添加80～320μM异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，持续培养8～16小时后进行分离、清洗，收集重组菌体，将所述重组菌体转入pH为7～12的磷酸盐缓冲溶液中，并加入0.01～0.05摩尔体积的酪氨酸或苯丙氨酸，混合均匀，在100～500rpm、28～37℃条件下反应4～8小时；再向反应液中加入100～300摩尔体积的盐酸，进行离心，取上清液，获得3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酸或3-苯基-2-丙烯酸。