CN110343159B

CN110343159B - 一种绿豆开花基因VrELF3的表达载体的应用

Info

Publication number: CN110343159B
Application number: CN201910757723.9A
Authority: CN
Inventors: 叶卫军; 周斌; 杨勇; 田东丰; 张丽亚; 张磊
Original assignee: Institute Of Crops Anhui Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute Of Crops Anhui Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-08-16
Filing date: 2019-08-16
Publication date: 2021-05-14
Anticipated expiration: 2039-08-16
Also published as: CN110343159A

Abstract

本发明公开了一种绿豆开花基因VrELF3的表达载体的应用，绿豆开花基因VrELF3的核苷酸序列如序列表Seq ID NO.1所示核苷酸序列。所述绿豆开花基因VrELF3通过在植物中进行表达，以调节所述植物的开花时间。本发明可促使转基因植物提前开花，缩短生育期，具有调控植物的开花期的生理功能。

Description

一种绿豆开花基因VrELF3的表达载体的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域的一种绿豆开花基因，尤其涉及该绿豆开花基因VrELF3的表达载体的应用。

背景技术

绿豆营养丰富，籽粒蛋白质含量高达19.5％～33.1％，高于水稻、小麦、玉米等禾谷类作物，属高蛋白、中淀粉、低脂肪类食物。不仅如此，绿豆还富含多种矿质元素、维生素、及活性物质，具有解毒、抗菌抑菌、抗过敏、降血脂、降血压、抗肿瘤、预防癌症等功效，属于医食两用作物。绿豆可以被加工为粉、汤、粥、面条等多种形式的食品，深受大众喜爱，其秸秆也可加工为饲料。绿豆根系中与其共生的根瘤菌有固氮能力，种植绿豆可改善土壤肥力和结构，不仅满足自身生长的需要，也可供后茬作物使用。此外，绿豆还具有喜温、生育期短、播种弹性大、耐贫瘠、耐荫，经济效益高等特点使其深受广大农户的喜爱。

目前，绿豆主要产区在亚洲、非洲、欧洲，分布区域较广。但就单个绿豆品种或种质资源而言，由于区域适应性的限制，严重制约了优良品种的种植范围。以往的研究表明作物区域适应性与光周期和生育期调控基因密切相关。因此，对绿豆光周期调控的遗传解析和分子机理研究有助于提高绿豆分子育种水平，加快广适品种的选育。在现有技术中，已有研究通过大豆基因调控植物的开花期，但是其表达模式受光的调节作用较弱，而通过绿豆基因的表达来改变植物的开花时间并未报道。

发明内容

针对现有的技术问题，本发明提供一种绿豆开花基因VrELF3的表达载体的应用，可促使转基因植物提前开花，缩短生育期，可调控植物花期。

本发明采用以下技术方案实现：本发明提供了一种含有绿豆开花基因VrELF3的表达载体的应用，所述表达载体为将上述任意所述的绿豆开花基因VrELF3***至植物表达载体中所获取的过量表达载体，启动相应目的基因表达的启动子为强启动子35S；其中，所述绿豆开花基因VrELF3的核苷酸序列如序列表Seq ID NO.1所示核苷酸序列；所述绿豆开花基因VrELF3通过在植物中进行表达，以调节所述植物的开花时间。

作为上述方案的进一步改进，所述表达载体的宿主细胞为将所述表达载体转入根癌农杆菌中所获取的宿主细胞。

作为上述方案的进一步改进，所述表达载体的构建方法包括以下步骤：

(1)取含有所述绿豆开花基因VrELF3的绿豆的幼嫩叶片，提取RNA并反转录为全长cDNA；

(2)通过序列表Seq ID NO.9中的正向引物5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTT AATGAGGAGA GGGAAGGAT-3'、序列表Seq ID NO.10中的反向引物5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACTAGACTGAGTCATACTG-3'，以所述全长cDNA为模板进行PCR扩增，获取PCR产物；

(3)先对所述PCR产物进行凝胶电泳并回收，再将回收产物交换到入门载体中，获得重组入门载体；

(4)提取所述重组入门载体的质粒，并将所述VrELF3基因片段交换至所述植物表达载体中，以获取所述过量表达载体。

本发明的绿豆开花基因VrELF3的表达载体的应用，其具有以下有益效果：

1、该绿豆开花基因VrELF3的表达载体，可促使转基因植物提前开花，缩短生育期，因此具有调控植物的开花期的生理功能，可用于植物基因工程领域以调控植物花期。

附图说明

图1为本发明实施例1的绿豆开花基因VrELF3的蛋白与大豆GmELF3蛋白的氨基酸序列比对图；

图2为本发明实施例4的绿豆开花基因VrELF3在绿豆不同器官中表达水平的检测方法所检测的各个器官的相对表达量的对比图；

图3为本发明实施例9的绿豆开花基因VrELF3的转基因株系和野生型植株中VrELF3的相对表达量的对比图，图中左侧WT为野生型植株，右侧为阳性转基因株系；

图4为本发明实施例10的绿豆开花基因VrELF3过量表达后的开花时间对比图；

图5为本发明实施例10的绿豆开花基因VrELF3的转基因株系和野生型植株的表型对照图，图中左侧为野生型植株，右侧为转基因株系。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

请参阅图1，本发明提供了一种绿豆开花基因VrELF3，该绿豆开花基因VrELF3包含选自下组的核苷酸序列：

(a)序列表Seq ID NO.1所示核苷酸序列；

(b)与(a)的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(c)与(a)的核苷酸序列具有至少50％同源性的核苷酸序列；在其他实施例中，(c)的核苷酸序列与(a)的核苷酸序列可以具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％同源性的核苷酸序列；

(d)与(a)的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但在序列上不同的核苷酸序列；

(e)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：序列表Seq ID NO.2中所示的氨基酸序列，或者，由于至少一个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或***而与序列表Seq ID NO.2所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，与序列表Seq ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少50％(当然，在其他实施例中，也可为至少60％、至少70％、至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％)同源性的氨基酸序列；

(f)(a)-(e)任何一个的核苷酸序列的活性片段；或

(g)与(a)-(e)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在本实施例中，测序结果表明绿豆开花基因VrELF3的CDS序列如表Seq ID N0.1所示，由2121个碱基组成。另外，本实施例根据绿豆开花基因VrELF3的CDS序列确定其编码的蛋白序列如Seq ID NO.2所示，由706个氨基酸残基构成，与大豆中GmELF3的同源性为78.2％(图1)，因此推测绿豆开花基因VrELF3与大豆中的同源基因可能具有相同的生物学功能。本实施例进行相关研究发现，绿豆开花基因VrELF3通过在植物中进行表达，以调节植物的开花时间。因此，本实施例的绿豆开花基因VrELF3，可促使转基因植物提前开花，缩短生育期，因此具有调控植物的开花期的生理功能，可用于植物基因工程领域以调控植物花期。

实施例2

本实施例提供了一种由实施例1中绿豆开花基因VrELF3编码的蛋白质，其氨基酸序列选自：

(1)如序列表Seq ID NO.2所示的氨基酸序列；

(2)将(1)的氨基酸序列替换、缺失、添加和/或***至少一个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

实施例3

本实施例提供了一种绿豆开花基因VrELF3的编码序列检测方法，该基因为实施例1中的绿豆开花基因VrELF3，而编码序列检测方法包括以下步骤。

(1)取含有绿豆开花基因VrELF3的绿豆的幼嫩叶片至液氮中进行研磨，并通过试剂盒提取总RNA。本实施例可以取中绿5号的幼嫩叶片，在液氮中充分研磨后，用植物总RNA提取试剂盒TRIzol(Invitrigen)提取总RNA。

(2)提取总RNA，并反转录为全长cDNA。在本实施例中，cDNA第一链的合成利用TaKaRa PrimeScript^TMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行，具体操作按说明进行。

(3)以全长cDNA为模板，通过序列表Seq ID NO.3中的正向引物5'-AAGTTCAGCCCCTACCGT-3'、序列表Seq ID NO.4中的反向引物5'-GAATTGCTTTTGACCTATTA-3'为第一对测序引物，序列表Seq ID NO.5中的正向引物5'-TAATGGAAATGCCGCTACAG-3'和序列表Seq ID NO.6中的反向引物5'-TACATACCAATGTGCTGTAA-3'为第二对测序引物，进行PCR反应扩增。其中，PCR反应总体系的体积为20μL，并且包括cDNA(50ngμL^-1)2μL、正向和反向引物(10μM)各1.0μL、10×PCR缓冲液2.0μL，dNTP Mixture(2mM)2μL，LATaq酶(5U/μL)0.2uL，补水至20μL。而且，PCR扩增程序为94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，进行35个循环；最后，72℃延伸10min后4℃保存。

(4)在PCR反应结束后，先对扩增物进行琼脂糖凝胶电泳，再通过凝胶回收试剂盒(可采用AxyPrep ^TM DNA Gel Extraction Kit,Axygen)进行切胶回收并测序。本实施例的测序结果表明绿豆开花基因VrELF3的CDS序列如表Seq ID NO.1所示，其由2121个碱基组成。

实施例4

本实施例提供了一种实施例1中绿豆开花基因VrELF3在绿豆不同器官中表达水平的检测方法，该检测方法利用实时荧光定量PCR(quantitative real time，RT-PCR)检测绿豆开花基因VrELF3在绿豆各器官中的表达水平。其中，实时荧光定量PCR在LightCycler 96平台上进行，用SYBR Green I作为荧光染料。本实施例的检测方法包括以下步骤。

(1)取含有绿豆开花基因VrELF3的绿豆的根、茎、叶、花、幼荚组织，分别提取总RNA并反转录为cDNA。在本实施例中，取中绿5号根、茎、叶、花、幼荚组织，提取总RNA并反转录为cDNA。

(2)通过序列表Seq ID NO.7中正向引物5'-CCCCGGTAGACAATTTGTCA-3'和序列表Seq ID NO.8中反向引物5'-CAAGCAAAACCTCGGGTGAT-3'，对(1)的cDNA进行荧光定量PCR反应，获取绿豆开花基因VrELF3在绿豆的根、茎、叶、花、幼荚组织中的表达水平。其中，荧光定量PCR内参用绿豆β-tubulin基因，反应体系为20μL：cDNA2.0μL、正向和反向引物(10μM)各0.5μL、2×SYBR Premix EX-Taq Mix 10μL，用RNase free ddH₂O补足至20μL。PCR反应程序为94℃热启动30S，94℃进行5S，60℃进行30s，进行40个循环。通过实验发现，绿豆开花基因VrELF3在根、茎、叶、花、幼荚中均有表达，但在茎、叶和幼荚中表达量较低，在根和花中表达量较高，如图2所示。

实施例5

本实施例提供了一种含有绿豆开花基因VrELF3的表达载体，表达载体为将实施例1的绿豆开花基因VrELF3***至植物表达载体中所获取的过量表达载体，而启动相应目的基因表达的启动子为强启动子35S。

实施例6

本实施例提供了一种含有绿豆开花基因VrELF3过量表达载体的宿主细胞，宿主细胞为将实施例5中表达载体转入根癌农杆菌GV3101中所获取的宿主细胞。

实施例7

本实施例提供了一种实施例5中含有绿豆开花基因VrELF3的表达载体的构建方法，该构建方法构建过表达载体所用的引物，用于扩增VrELF3的CDS序列，并且根据VrELF3基因序列设计特异引物，分别在引物5'端加上attB接头，该构建方法包括以下步骤。

(1)取含有绿豆开花基因VrELF3的绿豆的幼嫩叶片，提取RNA并反转录为全长cDNA。其中，绿豆的品种采用中绿5号。

(2)通过序列表Seq ID NO.9中的正向引物5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTT AATGAGGAGA GGGAAGGAT-3'、序列表Seq ID NO.10中的反向引物5'-GGGGACCACT TTGTACAAGA AAGCTGGGTACTAGACTGAG TCATACTG-3'，以全长cDNA为模板进行PCR扩增，获取PCR产物。本实施例中，采用高保真酶

HS DNA Polymerase(TaKaRa Code：DR010A)，反应体系：模板cDNA 5μL；5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+plus)10μL；dNTP Mixture(各2mM)5μL，正、反向引物(10μM)各2μL；

HS DNA Polymerase0.5μL，ddH₂O补足至50μL。PCR扩增程序为：98℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸2.0min，30个循环；最后72℃延伸10min。

(3)先对PCR产物进行凝胶电泳并回收，再将回收产物连接到入门载体中。在本实施例中，PCR产物凝胶电泳并回收，将回收产物通过Gateway BP Clonase反应交换到Gateway***的入门载体pDONR221，连接反应体系如下：PCR Product(PCR产物)50-150ng，目的载体(pDONR221)150ng，5×Clonase Reaction Buffer 2μL，加入2μL BP Clonaseenzyme mix，ddH₂O补足至10μL，短暂涡旋两次混匀，轻微离心，于25℃水浴8h，然后加入1μLProteinase K solution(蛋白酶K溶液)混匀，37℃放置10min结束反应。

其中，用热激法将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，菌液PCR后挑选阳性克隆送测序，得到载体中***序列与VrELF3完全相同的重组克隆，获得阳性重组克隆pDONR221-VrELF3。

(4)提取重组入门载体的pDONR221-VrELF3质粒，并将VrELF3基因片段交换至植物表达载体中，以获取过量表达载体。在本实施例中，提取pDONR221-VrELF3质粒，使用Gateway LR Clonase TM Enzyme Mix(Invitrogen公司，Cat.No.11791-019)***将VrELF3交换到过量表达载体pK2GW7中，构建重组质粒pK2GW7-VrELF3。LR反应体系如下：

反应条件：pDONR221-VrELF3质粒50-150ng，目的载体(pK2GW7)150ng，5×LRClonase Reaction Buffer 2μL，加入2μL LR Clonase enzyme mix，ddH₂O补足至10μL，短暂涡旋两次混匀，轻微离心，于25℃水浴8h后，加入1μL蛋白酶K溶液并混匀，37℃放置10min结束反应。

而且，取5μL反应产物转化大肠杆菌DH5α，菌液PCR后挑取阳性克隆进行测序鉴定，所得序列与VrELF3相同的即为阳性重组质粒pK2GW7-VrELF3。

实施例8

本实施例提供了一种拟南芥的遗传转化方法，其包括以下步骤。

(1)将实施例7中含有绿豆开花基因VrELF3表达载体的质粒与农杆菌GV3101进行冰浴混匀，并通过电击法进行转化。

(2)将转化物涂布在抗性YEP培养基上，并倒置培养，直至长出单菌落。在本实施例中，转化后的产物涂布于含有Rif(利福平)50mg/L和Spec(盐酸大观霉素)100mg/L的抗性YEP培养基上，28℃倒置培养2个晚上以至长出单菌落。

(3)挑取抗性YEP培养基上的单菌落至YEP液体培养基中，并进行震荡培养。吸取适量菌液加入YEP液体培养基(含相应抗生素)中，培养至OD600大于1。本实施例挑取长出的农杆菌单克隆至5mL YEP液体培养基中(相应抗生素为Rif 50mg/L，spec 100mg/L)，在28℃且150rpm条件下振荡培养48小时。本实施例振荡培养后的菌液按体积比1:10加入YEP液体培养基(含相应抗生素)中，在28℃下培养至OD600>1。

(4)去除盛花期的拟南芥果的果荚，将拟南芥整株置于菌液中进行侵染。在本实施例中，在拟南芥盛花期将拟南芥果荚去除干净、仅剩下花序的拟南芥整株与穴盘一起倒扣于含有已转化农杆菌的菌液里，浸苗5min，期间不断地摇晃菌液。

(5)取出侵染后的拟南芥植株进行遮光生长。本实施例在侵染完后，取出植株，侧放于托盘内，覆盖避光的黑色塑料布，放置在生长室内，并24h后揭开。

(6)将遮光生长后的拟南芥植株置于光照下进行培养，可每周浇1-2次水，待种子成熟后收获T0代种子。

(7)先将收获的T0代种子杀菌消毒后种植在固体培养基内，并进行黑暗春化，再将春化后的植株在人工气候下进行培养，并观察生长状况。其中，本实施例将收获的T0代种子杀菌消毒后，种植在MS+25mg/L Basta的固体培养基内，4℃黑暗春化3d后，将培养皿置于人工气候箱内培养，观察拟南芥植株的生长状况。其中具有BASTA抗性的转基因种子将会在筛选培养基内生长，而非转基因的种子萌发后不久就黄化死去。单株收获并种植T1代种子，幼苗用Basta继续筛选获得阳性植株，T2代单株收获。单株种植T2代种子，幼苗用Basta继续筛选，若T3代植株全部表现抗性说明对应的T2代单株为纯合阳性植株。

实施例9

本实施例提供了一种绿豆开花基因VrELF3，并在实施例8的基础上进行了对比实验。在本实施例中，种植野生型和纯合阳性拟南芥植株，提取3-4周野生型和拟南芥T3代植株叶片中总RNA，并反转录为cDNA。用引物(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)对实施例8获得的转基因拟南芥植株35S::VrELF3进行荧光定量PCR分析(以拟南芥UBQ10基因作为内参基因)。定量结果如图3所示，在拟南芥转基因株系35S::VrELF3中，VrELF3的表达水平远高于野生型，这就证明了转基因株系35S::VrELF3中的VrELF3基因过量表达。

实施例10

本实施例提供了一种绿豆开花基因VrELF3，并在实施例8的基础上进行了对比实验。本实施例从实施例8中获得拟南芥转化植株与野生型对照同时种植，同样的栽培措施进行管理，对转基因植株和野生型的花期进行调查。结果显示，绿豆开花基因VrELF3转化拟南芥，可提高植株对光周期的敏感性，提前开花。如图5所示，左侧为野生型对照，右侧为转基因植株。如图4所示，14株野生型对照从播种到开花的时间为28～31d，平均为29.4d。而转基因株系的开花时间为22～27d，平均为24.4d，说明绿豆VrELF3可显著促进植株开花。

实施例11

本实施例提供了一种植物转化体，该转化体的基因组上包含实施例6的含有启动子35S驱动的绿豆开花基因VrELF3。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 安徽省农业科学院作物研究所

<120> 一种绿豆开花基因VrELF3及其应用

<141> 2019-02-28

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2121

<212> DNA

<213> 绿豆（Vigna radiata）

<400> 1

atgaggagag ggaaggatga tgagaaggtg atggggccaa tgttccctag gctacatgtc 60

aatgatacag aaaagggagg accaagagca ccacctagga ataagatggc cctctatgag 120

cggtttagta ttccctctca aaggttcaat tcaggtgttc tgccactcaa ccaaaatatt 180

tccagtaata ctgctccccc tacatcctca agtcagggga ctgtccctga gagaaatcat 240

gtctttcctg ttcatatgcc atcgcagaaa cctattcgtc ccgtagaaaa atgtcactct 300

cgccaatcgg aagaggcaaa tttgacttgt tctcttgaac agagaaagaa ggtatatgaa 360

gaagacttta gggttcctgt atacgttcat tcaagggttg gtcagtgtaa tgataaaagt 420

gttgagagtt tcgacaggaa aaagatcact catacaggca ctaggtattt cggttgttca 480

gttgcagggc aaagtgattg tgaaagggtt cccaaacaat ttgggtcctc acatgttagg 540

aaagatgcgc gatgtgagac tgatggtctt ccacaagtaa gtacaagtaa agaccagcca 600

ttaacgtctg tccgaagcat atcaacgaga gaaaatattg acaccttagt aaggcaagcc 660

aaggtgactc cgaatcaaga gtttcaagat tgtcatgtat caaaaaggaa caggtttaga 720

caggatgatg cttgcttacg gcaggactgt ggagtggggt cccaatccaa tgacattgga 780

cacagtggtt ctcttgttca gtcttcaagg aagattggta atggaaatgc cgctacagca 840

aacaaaacca atccagctga ggcaatcaat gacactggac atcatgatac cgggacgggc 900

agtctgatac aggggggaaa attaaatgga agtgacaatg cttcaaagat ctccccggta 960

gacaatttgt caccagtgaa catttctcca gatgatgttg ttggaataat aggtcaaaag 1020

caattctgga aagctagaag agcaattgcc caccaacaga gagtgtttgc tgtccaagtg 1080

tttgagcttc acagattgat aaaggtccaa caactgatgg ctggatcacc cgaggttttg 1140

cttgaagatg gcacttttct gggaaagtct attccaaagg gatctactcg gaagaaactt 1200

tcactggaat atgttgtaaa accttggcaa caaaccctta agcgcaaaga tgattctgaa 1260

aagttaaatc ataaaatgga atgttctgcg gagaacgcag ttggcaagac gtctctctca 1320

tcagtgaaaa acgatagcca cctttcaaac tacactcctt ttccaagaaa tcctcaacag 1380

gcaaatgtgg ctgctgacag tggaatgggc ccttggtgtt tccagcagtc agccgggcac 1440

caatggttag ttcctgttat gactccttac gacgggcttg tctacaagcc atatcctagg 1500

cctggattca caggaacaga tggtggagga tgtgggcctg ctccttttgg tggtaatttt 1560

atgaatccag cctatggaat cccaacttct catcaaggag ttggggtttc accacaaaca 1620

cctccaggaa gtcttgctta cttccctcca tatgggatga cagttatgaa tgcaacaatg 1680

tcagagtcag ctgttgatca ggtgaaccag ttctcttcac taggttctca caggtataat 1740

ggccatttac ctggagggga atctaatcat atcacaaaca atcaaagctc tcgtaattta 1800

ccaactccga gaaatggagc atcgtcacat gtcctgaaat atcagacatc taaggatttt 1860

gagttgcagg gtagtacagc aagtagtcct gatgaaatgg cacaggcatt aagcacaggg 1920

caagttgcag aaggaaggga tgttcttcct cttttcccta tggttccggc agaacctgag 1980

tctattcctc gctctcttga aaccggacaa ccaactcgag taatcaaagt cgtgccgcac 2040

aaccgaatat cagcaactgc ttcagcagct agaatttttc aatcaattca ggaagagaga 2100

aaacagtatgactcagtctag 2121

<210> 2

<211> 706

<212> PRT

<213> 绿豆（Vigna radiata）

<400> 2

Met Arg Arg Gly Lys Asp Asp Glu Lys Val Met Gly Pro Met Phe Pro

1 5 10 15

Arg Leu His Val Asn Asp Thr Glu Lys Gly Gly Pro Arg Ala Pro Pro

20 25 30

Arg Asn Lys Met Ala Leu Tyr Glu Arg Phe Ser Ile Pro Ser Gln Arg

35 40 45

Phe Asn Ser Gly Val Leu Pro Leu Asn Gln Asn Ile Ser Ser Asn Thr

50 55 60

Ala Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Gly Thr Val Pro Glu Arg Asn His

65 70 75 80

Val Phe Pro Val His Met Pro Ser Gln Lys Pro Ile Arg Pro Val Glu

85 90 95

Lys Cys His Ser Arg Gln Ser Glu Glu Ala Asn Leu Thr Cys Ser Leu

100 105 110

Glu Gln Arg Lys Lys Val Tyr Glu Glu Asp Phe Arg Val Pro Val Tyr

115 120 125

Val His Ser Arg Val Gly Gln Cys Asn Asp Lys Ser Val Glu Ser Phe

130 135 140

Asp Arg Lys Lys Ile Thr His Thr Gly Thr Arg Tyr Phe Gly Cys Ser

145 150 155 160

Val Ala Gly Gln Ser Asp Cys Glu Arg Val Pro Lys Gln Phe Gly Ser

165 170 175

Ser His Val Arg Lys Asp Ala Arg Cys Glu Thr Asp Gly Leu Pro Gln

180 185 190

Val Ser Thr Ser Lys Asp Gln Pro Leu Thr Ser Val Arg Ser Ile Ser

195 200 205

Thr Arg Glu Asn Ile Asp Thr Leu Val Arg Gln Ala Lys Val Thr Pro

210 215 220

Asn Gln Glu Phe Gln Asp Cys His Val Ser Lys Arg Asn Arg Phe Arg

225 230 235 240

Gln Asp Asp Ala Cys Leu Arg Gln Asp Cys Gly Val Gly Ser Gln Ser

245 250 255

Asn Asp Ile Gly His Ser Gly Ser Leu Val Gln Ser Ser Arg Lys Ile

260 265 270

Gly Asn Gly Asn Ala Ala Thr Ala Asn Lys Thr Asn Pro Ala Glu Ala

275 280 285

Ile Asn Asp Thr Gly His His Asp Thr Gly Thr Gly Ser Leu Ile Gln

290 295 300

Gly Gly Lys Leu Asn Gly Ser Asp Asn Ala Ser Lys Ile Ser Pro Val

305 310 315 320

Asp Asn Leu Ser Pro Val Asn Ile Ser Pro Asp Asp Val Val Gly Ile

325 330 335

Ile Gly Gln Lys Gln Phe Trp Lys Ala Arg Arg Ala Ile Ala His Gln

340 345 350

Gln Arg Val Phe Ala Val Gln Val Phe Glu Leu His Arg Leu Ile Lys

355 360 365

Val Gln Gln Leu Met Ala Gly Ser Pro Glu Val Leu Leu Glu Asp Gly

370 375 380

Thr Phe Leu Gly Lys Ser Ile Pro Lys Gly Ser Thr Arg Lys Lys Leu

385 390 395 400

Ser Leu Glu Tyr Val Val Lys Pro Trp Gln Gln Thr Leu Lys Arg Lys

405 410 415

Asp Asp Ser Glu Lys Leu Asn His Lys Met Glu Cys Ser Ala Glu Asn

420 425 430

Ala Val Gly Lys Thr Ser Leu Ser Ser Val Lys Asn Asp Ser His Leu

435 440 445

Ser Asn Tyr Thr Pro Phe Pro Arg Asn Pro Gln Gln Ala Asn Val Ala

450 455 460

Ala Asp Ser Gly Met Gly Pro Trp Cys Phe Gln Gln Ser Ala Gly His

465 470 475 480

Gln Trp Leu Val Pro Val Met Thr Pro Tyr Asp Gly Leu Val Tyr Lys

485 490 495

Pro Tyr Pro Arg Pro Gly Phe Thr Gly Thr Asp Gly Gly Gly Cys Gly

500 505 510

Pro Ala Pro Phe Gly Gly Asn Phe Met Asn Pro Ala Tyr Gly Ile Pro

515 520 525

Thr Ser His Gln Gly Val Gly Val Ser Pro Gln Thr Pro Pro Gly Ser

530 535 540

Leu Ala Tyr Phe Pro Pro Tyr Gly Met Thr Val Met Asn Ala Thr Met

545 550 555 560

Ser Glu Ser Ala Val Asp Gln Val Asn Gln Phe Ser Ser Leu Gly Ser

565 570 575

His Arg Tyr Asn Gly His Leu Pro Gly Gly Glu Ser Asn His Ile Thr

580 585 590

Asn Asn Gln Ser Ser Arg Asn Leu Pro Thr Pro Arg Asn Gly Ala Ser

595 600 605

Ser His Val Leu Lys Tyr Gln Thr Ser Lys Asp Phe Glu Leu Gln Gly

610 615 620

Ser Thr Ala Ser Ser Pro Asp Glu Met Ala Gln Ala Leu Ser Thr Gly

625 630 635 640

Gln Val Ala Glu Gly Arg Asp Val Leu Pro Leu Phe Pro Met Val Pro

645 650 655

Ala Glu Pro Glu Ser Ile Pro Arg Ser Leu Glu Thr Gly Gln Pro Thr

660 665 670

Arg Val Ile Lys Val Val Pro His Asn Arg Ile Ser Ala Thr Ala Ser

675 680 685

Ala Ala Arg Ile Phe Gln Ser Ile Gln Glu Glu Arg Lys Gln Tyr Asp

690 695 700

Ser Val

705

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagttcagcccctaccgt 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaattgcttttgacctatta 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

taatggaaatgccgctacag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tacataccaatgtgctgtaa 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccccggtagacaatttgtca 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caagcaaaacctcgggtgat 20

<210> 9

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aatgaggaga gggaaggat 49

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta ctagactgag tcatactg 48

Claims

1.一种含有绿豆开花基因VrELF3 的表达载体的应用，其特征在于，所述表达载体为将绿豆开花基因VrELF3 ***至植物表达载体中所获取的过量表达载体，启动相应目的基因表达的启动子为强启动子35S；其中，所述绿豆开花基因VrELF3 的核苷酸序列如序列表SeqID NO.1 所示核苷酸序列；所述绿豆开花基因VrELF3 通过在植物中进行表达，以减少所述植物的开花时间。

2.如权利要求1 所述的含有绿豆开花基因VrELF3 的表达载体的应用，其特征在于，所述表达载体的宿主细胞为将所述表达载体转入根癌农杆菌中所获取的宿主细胞。

3.如权利要求1 所述的含有绿豆开花基因VrELF3 的表达载体的应用，其特征在于，所述表达载体的构建方法包括以下步骤：

（1）取含有所述绿豆开花基因VrELF3 的绿豆的幼嫩叶片，提取RNA 并反转录为全长cDNA；

（2）通过序列表Seq ID NO.9 中的正向引物5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAA AAGCAGGCTTAATGAGGAGA GGGAAGGAT-3'、序列表Seq ID NO.10 中的反向引物5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACTAGACTGAGTCATACTG-3'，以所述全长cDNA 为模板进行PCR 扩增，获取PCR产物；

（3）先对所述PCR 产物进行凝胶电泳并回收，再将回收产物交换到入门载体中，获得重组入门载体；

（4）提取所述重组入门载体的质粒，并将所述VrELF3 基因片段交换至所述植物表达载体中，以获取所述过量表达载体。