CN110907372B - 包含白芨提取物的牙膏抗炎性能体外评价模型和方法 - Google Patents

包含白芨提取物的牙膏抗炎性能体外评价模型和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110907372B
CN110907372B CN201911213385.9A CN201911213385A CN110907372B CN 110907372 B CN110907372 B CN 110907372B CN 201911213385 A CN201911213385 A CN 201911213385A CN 110907372 B CN110907372 B CN 110907372B
Authority
CN
China
Prior art keywords
toothpaste
sample
bletilla striata
inflammatory
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911213385.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110907372A (zh
Inventor
吴文惠
郭庆
徐丹红
包斌
郭锐华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Ocean University
Original Assignee
Shanghai Ocean University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Ocean University filed Critical Shanghai Ocean University
Priority to CN201911213385.9A priority Critical patent/CN110907372B/zh
Publication of CN110907372A publication Critical patent/CN110907372A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110907372B publication Critical patent/CN110907372B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

本发明公开了包含白芨提取物的牙膏抗炎性能体外评价模型和方法，其评价指标包括血浆中细胞因子IL‑10、IL‑6、IL‑1β和TNF‑α含量中至少一种，通过细胞培养和活性检测确定牙膏样品最适浓度，再取生长状态呈对数期的细胞，加入LPS诱导细胞中HEGCs呈炎症状态，分别加入上述最适浓度的实验样品和对照样品，继续培养并检测其分泌细胞因子的含量，通过细胞因子含量变化评价包含白芨提取物的牙膏抗炎性能。本发明为口腔护理产品抗炎或修复损伤功效前期验证提供快捷可靠的评价方法，也为口腔护理行业动物替代实验、口腔护理产品开发和功效验证提供新思路。

Description

包含白芨提取物的牙膏抗炎性能体外评价模型和方法
技术领域
本发明属于口腔护理产品性能测试技术领域，涉及评价包含白芨提取物的牙膏抗炎性能，特别涉及构建一种体外评价模型，用于评价该牙膏的抗牙龈炎性能。
背景技术
目前，口腔护理产品的原料筛选和产品抗炎功效测试方法主要为体内模型，包括动物模型和临床实验模型。相关研究报道，于群生等采用注射甲醛致小鼠牙龈黏膜炎模型进行牙膏抗炎实验，同时配合漱口液治疗口腔溃疡的临床试验；蒋才武等采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀及弗氏完全佐剂致大鼠足肿胀模型，用于评价牙膏的抗炎作用；陈秋迎等通过Loe和Silness牙龈指数对志愿者进行测试，评价使用牙膏前后牙龈炎症的状况；柏琼等采用医院口腔科门诊临床实验，评价牙膏改善牙龈炎症状的效果。但是，无论是动物模型还是临床试验模型对于前期原料筛选或产品功效验证都存在高成本、高风险、操作复杂和测试结果不稳定等局限性，同时也存在一定的盲目性。
人牙龈上皮细胞(HGECs)为多角形，融合呈典型的“铺路石”外观，免疫细胞化学检测显示，该细胞角蛋白染色阳性、波形丝蛋白染色阴性，证实其为外胚层来源的细胞，同时它也是一种细胞激活因子，对牙周炎的产生有重要作用。但是，当前用于抗炎模型的细胞大多采用RAW264.7巨噬细胞，对抵抗病原菌的第一层口腔表面HGECs研究较少。
牙周病原菌内毒素(LPS)是一种由类脂A、核心寡聚糖和O-特异性多糖侧链组成的糖脂类物质，是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，可直接作用于牙周组织细胞，刺激单核细胞和巨噬细胞等效应细胞，诱发炎症反应引起牙周组织的破坏。目前，还未见有报道LPS诱导HEGCs的体外模型用于评价含白芨提取物的牙膏的抗炎功效。
发明内容
本发明针对现有技术中目前还没有体内外牙龈炎模型用于全面评价白芨提取物及包含其的牙膏抗牙龈炎和修复牙龈炎的作用，构建一种体外评价模型，选择口腔中抵御病原微生物入侵的第一道屏障HGECs用于该模型中，综合评价包含白芨提取物的牙膏抗炎性能。
本发明还通过上述体外评价模型可量化评价内含白芨提取物的牙膏抗牙龈炎功效。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
包含白芨提取物的牙膏抗炎性能体外评价模型，其评价指标包括血浆中细胞因子IL-10、IL-6、IL-1β和TNF-α含量中至少一种；
所述体外评价模型的构建方法包含以下步骤：
(ⅰ)牙膏样品前处理；和
(ⅱ)HGECs细胞培养，和
(ⅲ)细胞活性检测确定包含白芨提取物的牙膏样品最适浓度，包括步骤：
a)取步骤(ⅱ)中生长状态呈对数期的细胞，检测其空白时的吸光度OD0；
b)向其中分别加入100uL含有10uL浓度为10μg/mLLPS的实验样品和对照样品，培养24h；其中：实验样品为包括若干个包含不同浓度梯度白芨提取物的牙膏样品，对照样品为不添加任何样品的培养基溶液；
c)加入CCK-8试剂，孵育6h，测量550nm处各样品的吸光度ODt；
d)筛选得到细胞存活率在80％～100％范围内实验样品的最适浓度；
(ⅳ)取步骤(ⅱ)中生长状态呈对数期的细胞，加入10uL浓度为10μg/mLLPS诱导细胞中HEGCs使其呈炎症状态，再分别加入100uL步骤(ⅲ)中最适浓度的实验样品和相同的对照样品，培养24h，分别检测其分泌细胞因子IL-10、IL-6、IL-1β和TNF-α的含量。
还包括通过动物模型验证所述体外评价模型一致性的步骤。
步骤(ⅰ)中，将牙膏溶于等量无水乙醇中，在60℃加入少量无水硫酸钠搅拌至充分溶解，离心，取上清液后旋蒸(40℃、75rpm)至初始牙膏体积，真空干燥6h，-80℃冻藏12h，冻干20h，得到牙膏的醇提物，用0.9％的生理盐水或DMEM培养基逐步稀释，离心，0.22μm滤膜过滤，4℃保存。
步骤(ⅱ)中，细胞培养的方法包括：HGECs培养于含有10％热灭活牛血清DMEM高糖培养基中，添加1％100μg/mL的青霉素和链霉素，37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱内及时换液并传代培养。
步骤(ⅲ)中，所述牙膏样品内白芨提取物的浓度梯度范围为0.05～0.80ug/mL。
步骤(ⅲ)中，细胞存活率＝(实验样品的ODt-OD0)/(对照样品的ODt-OD0)×100％。在细胞存活率80％～100％范围内时所述牙膏样品内白芨提取物最适浓度为0.5ug/mL。
另一方面，上述体外评价模型用于评价包含白芨提取物的牙膏抗炎性能的方法，通过所述体外评价模型获得所述牙膏样品和对照样品细胞因子IL-10、IL-6、IL-1β和TNF-α的含量，并根据其含量变化评价所述包含白芨提取物的牙膏抗炎性能。进一步，其评价标准包括：
抗炎因子IL-10升高，表示牙膏抗炎效果越好；和/或
炎症因子IL-1β和IL-6降低，表示牙膏抗炎效果越好；和/或
肿瘤坏死因子TNF-α降低，表示牙膏抗炎效果越好。
本发明的体外评价模型通过炎症因子表达水平和细胞迁移的变化，在较短时间内对包含白芨提取物的牙膏抗炎性能最适浓度筛选和功效验证，避免盲目进行动物和临床实验带来的高成本、高风险、操作复杂和测试结果不稳定等局限性，大大缩短试验时间，节约成本，也对口腔护理产品抗炎或修复损伤功效前期验证提供快捷可靠的评价方法，也为口腔护理行业动物替代实验、口腔护理产品开发和功效验证提供新的思路。
附图说明
图1是不同样品在不同浓度下的细胞存活率变化；其中，A-白芨Ⅰ号牙膏；B-白芨Ⅱ号牙膏；C-阴性牙膏；D-阳性牙膏(氨甲环酸牙膏)；E-白芨提取物。
图2是不同样品对LPS刺激HGECs细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的影响；其中，A-白芨Ⅰ号牙膏；B-白芨Ⅱ号牙膏；C-阴性牙膏；D-阳性牙膏(氨甲环酸牙膏)；E-白芨提取物，Control-经LPS诱导HGECs炎症的空白模型，P＜0.05用*表示；P＜0.01用**表示；P＜0.001用***表示。
图3是实施例中不同样品对牙龈炎大鼠动物模型血清中分泌细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的影响；其中，A-白芨Ⅰ号牙膏；B-白芨Ⅱ号牙膏；C-阴性牙膏；D-阳性牙膏(氨甲环酸牙膏)；E-白芨提取物；F-牙龈炎组；G-健康组，(#P<0.05；##P<0.01；###P<0.001vs.F groups；*P<0.01；**P<0.01；***P<0.001vs.G groups)。
图4是实施例中不同样品对牙龈炎大鼠动物模型牙龈指标的影响；其中，A-白芨Ⅰ号牙膏；B-白芨Ⅱ号牙膏；C-阴性牙膏；D-阳性牙膏(氨甲环酸牙膏)；E-白芨提取物；Control-患严重牙龈炎大鼠模型，P＜0.05用*表示；P＜0.01用**表示；P＜0.001用***表示。
图5是一实施例中大鼠牙龈炎体内模型图片。
图6是实施例中不同样品对大鼠上颌侧面牙周组织的X-射线影像；其中，A-白芨Ⅰ号牙膏；B-白芨Ⅱ号牙膏；C-阴性牙膏；D-阳性牙膏(氨甲环酸牙膏)；E-白芨提取物；F-牙龈炎组；☆：牙槽骨吸收；★：牙槽骨修复。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
<材料与方法>
P.gingivalis(ATCC33277)，F.nucleatum(ATCC49256)，HGECs(上海赛齐生物技术公司)；Wistar大鼠、雌性新西兰兔(SPF级，上海杰思捷实验动物有限公司)；二磷酸腺苷(ADP，美国Sigma-Aldrich公司，批号A2754)，ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)；DMEM高糖培养基，0.25％胰酶，胎牛血清、青霉素和链霉素(Gibco公司)；其他分析纯试剂均采购于国药、生工等国内试剂供应商。
菌液制备。牙龈卟啉单胞菌(P.g)和具核梭杆菌(F.n)接种于营养肉汤培养基中，在37℃厌氧条件下培养2～5d，挑取平板上单个菌落用无菌PBS(50mmol/L，pH7.4)配制菌悬液5mL，并调节为0.5麦氏比浊浓度(即1×108CFU/mL)，然后加入羧甲基纤维素，用0.22μm孔径的滤膜过滤，配制成含2％羧甲基纤维素的新鲜菌液。
<构建牙膏抗炎性能体外评价模型>
构建牙膏抗炎性能体外评价模型，具体步骤如下：
步骤一：牙膏样品前处理。将牙膏溶于等量无水乙醇中，在60℃加入少量无水硫酸钠搅拌至充分溶解，离心，取上清液后旋蒸(40℃、75rpm)至初始牙膏体积，真空干燥6h，-80℃冻藏12h，冻干20h，得到牙膏的醇提物，用0.9％的生理盐水或DMEM培养基逐步稀释，离心，0.22μm滤膜过滤，4℃保存，(一周内用完)备用。
步骤二：细胞培养。HGECs培养于含有10％热灭活牛血清DMEM高糖培养基中，添加1％100μg/mL的青霉素和链霉素，37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱内及时换液并传代培养，取5-6代生长状态呈对数期的细胞进行试验。
步骤三：细胞活性检测确定包含白芨提取物的牙膏样品最适浓度。具体步骤为：a)取生长状态呈对数期的细胞，检测其空白时的吸光度OD0；b)向其中分别加入100uL含有10uL浓度为10μg/mLLPS的实验样品和对照样品，培养24h；其中：实验样品为包括若干个包含不同浓度梯度白芨提取物的牙膏样品，对照样品为不添加任何样品的培养基溶液；c)加入CCK-8试剂，孵育6h，测量550nm处各样品的吸光度ODt；d)筛选得到细胞存活率在80％～100％范围内实验样品的最适浓度。
步骤四：检测样品中分泌细胞因子IL-10、IL-6、IL-1β和TNF-α的含量。取生长状态呈对数期的细胞，加入10uL浓度为10μg/mLLPS诱导细胞中HEGCs使其呈炎症状态，再分别加入100uL最适浓度的实验样品和相同的对照样品，培养24h，分别检测其分泌细胞因子IL-10、IL-6、IL-1β和TNF-α的含量。
实施例一 验证牙膏抗炎性能体外评价模型
CCK-8试剂可用于检测牙膏样品对HGECs细胞增殖和毒性分析，根据加如牙膏样品后细胞存活率筛选HGECs的最适牙膏样品浓度值，其中：
细胞存活率＝(实验样品的ODt-OD0)/(对照样品的ODt-OD0)×100％。
ELISA检测IL-6、IL-1β、IL-10和TNF-α的水平：于96孔板中，每孔加HGECs细胞悬液(5.0×104cells/mL)100uL，置于37℃、5％CO2培养箱孵育24h，弃去培养液，加入含不同浓度牙膏样品的新鲜DMEM(高糖)培养液100uL，继续培养24h，加入含LPS的DMEM(高糖)培养液使其终浓度为10ug/mL。37℃、5％CO2培养箱中培养24h，收集细胞上清液，依据IL-6、IL-1β、IL-10和TNF-α的ELISA试剂盒说明书测定含量。
以IL-1β为例，用抗原IL-1β单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的IL-1β与单抗结合，加入生物素化的抗原IL-1β，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记与生物素结合，加入酶底物OPD，出现蓝色，加终止液硫酸，颜色变黄色，在450nm处测吸光度A值，IL-1β浓度与A值成正比，可通过绘制标准曲线计算出样品中IL-1β浓度。
CCK-8试剂用于添加白芨提取物或氨甲环酸牙膏最适浓度的筛选，具有灵明度高、细胞毒性小、结果优于MTT等优点。选择细胞存活率在80％～100％的牙膏样品浓度进行HGECs分泌细胞因子含量检测，如图1所示，采用0.5ug/mL牙膏样品浓度评价各组牙膏样品的抗炎作用最适(P<0.05)。
IL-10为抗炎因子，可通过释放免疫介质从而达到抑制炎症作用，IL-1β、IL-6为炎症因子，当机体发生炎症时这两种细胞因子相应增加，TNF-α是一种肿瘤坏死因子，可通过引起一些炎症反应使肿瘤细胞出血性坏死。如图2所示，氨甲环酸牙膏组处理的HGECs分泌IL-10含量最高，为98.95ng/L±2.42ng/L(P＜0.001)；IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子TNF-α含量最低，分别为6.12ng/L±0.02ng/L，6.36ng/L±0.04ng/L(P＜0.01)，13.09ng/L±0.01ng/L(P＜0.01)；其中白芨提取物、白芨Ⅰ号牙膏组和白芨Ⅱ号牙膏组对HGECs炎症模型均有显著性影响(P＜0.05)。
实施例二 大鼠动物试验
构建丝线结扎磨牙牙龈炎大鼠模型时同时使用沾有牙龈卟啉单胞菌(P.g)和具核梭杆菌(F.n)诱导建立牙龈炎大鼠动物模型，具体如下：
SPF级Wistar大鼠共20只，雌性，体重200±20g，活动良好，无龋坏，无牙周病。由于大鼠口腔上颚牙齿细小，结扎比较困难，大鼠腹腔注射10％水合氯醛3.5mg/kg麻醉后，选择双侧上颌第二磨牙用5-0医用丝线结扎于牙颈部，结扎丝线尽量放入龈沟内，遇结扎线脱落需重新结扎，如图5所示。结扎后用10％糖水代替饮水喂养，每隔一天接种一次制备好的菌液0.5mL。28d后，建模成功后用牙膏样品15d，检测大鼠唾液的免疫球蛋白IgG、IgM、IgA因子、以及牙龈指数GI和菌斑指数PI，并进行大鼠血浆中的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6因子和X-ray形态学分析。其中，IgA为分泌性的免疫球蛋白A，是机体抵御病原体的第一道免疫防线，有效地阻止口腔中有害物质进入上皮细胞；IgM为免疫球蛋白M，是免疫应答中最早出现的抗体，可根据其含量来评价口腔中牙龈炎的修复作用；IgG是免疫球蛋白G，是血清中主要的抗体成分，唾液中含量极低。牙龈指数GI通过检查牙龈颜色改变评价口腔的健康情况，菌斑指数PI根据牙面菌斑的厚度评价口腔中牙周病防治效果，牙龈出血指数BOP通过探针刺激牙龈部分评价口腔牙龈的病理状况。
如表1所示，氨甲环酸牙膏处理后IgA的变化最为明显，增加了1.18mg/L(P＜0.01)，白芨Ⅰ号牙膏处理后IgM增加了410ng/L(P＜0.01)，而IgG在第三周大鼠口腔发炎严重时，由于牙龈易出血导致能在口腔唾液中到大量血清中的IgG，但第六周牙膏处理后则恢复正常值。
表1：各组大鼠唾液的IgG、IgM、IgA比较
Figure BDA0002298785580000061
Figure BDA0002298785580000062
如图3所示，大鼠牙龈炎模型中，白芨提取物处理的大鼠口腔GI、PI、BOP均显著性减少(P<0.001)，其次是白芨牙膏处理组(P<0.01)，表明白芨提取物及其牙膏有良好的口腔治疗作用。如图4所示，血浆中白芨提取物处理组的IL-10含量最高，为27.98ng/L±1.22ng/L(P＜0.05)；IL-1β、IL-6、TNF-α含量最低，分别为12.26ng/L±0.30ng/L(P＜0.001)，2.62ng/L±0.01ng/L(P＜0.001)，103.99ng/L±4.37ng/L(P＜0.001)；其中添加白芨提取物或氨甲环酸牙膏对大鼠牙龈炎模型均有显著性修复效果(P＜0.05)。
如图6所示，对照组的大鼠牙銀组织中，可观察到明显的銀***退缩和炎性细胞浸涧，銀***位于釉牙骨质界下方，牙槽帷高度降低，牙槽崎顶到釉牙骨质界的距离显著増加。与对照组相比，各牙膏处理组牙齿排列紧密，牙齿与牙槽贴合紧密；用药组大鼠第二磨牙与相邻磨牙间隙明显减小，牙齿与牙槽缝隙减小。表明各牙膏组可明显改善牙周炎大鼠牙间隙以及牙齿与牙槽缝隙。其中白芨Ⅰ号牙槽吸收比白芨Ⅱ组高。
LPS耐受的研究主要集中于单核/巨噬细胞，树突状细胞等免疫细胞。还缺乏HGECs免疫耐受的直接报道，研究已证实慢性牙周炎患者的牙龈组织中，能够识别LPS等毒力因子。选择最贴近最外层易感染的HGECs进行试验，CCK-8检测显示选择0.5ug/mL的样品浓度检测炎症因子，白芨Ⅰ号牙膏、白芨Ⅱ号牙膏、阴性牙膏、氨甲环酸牙膏和白芨提取物对LPS刺激HEGCs细胞上清液中IL-10均呈极显著性增加(P＜0.001)，与对照组相比其含量分别增加了36.62ng/L、27.70ng/L、60.73ng/L、20.26ng/L、90.02ng/L；TNF-α一般性减少(P＜0.05)，比对照组减少了13.03ng/L、8.80ng/L、21.95ng/L、2.59ng/L、23.35ng/L，IL-1β无明显差异，分别比对照组减少了4.83ng/L、1.62ng/L、6.19ng/L、0.66ng/L、7.48ng/L，和IL-6显著性减少(P＜0.01)分别比对照组减少16.75ng/L，11.61ng/L、45.08ng/L、0.62ng/L、45.94ng/L。四组试验结果表明在体外炎症细胞模型中，体外抗炎效果为：白芨提取物＞氨甲环酸牙膏＞白芨Ⅰ号牙膏组＞白芨Ⅱ号牙膏组＞阴性牙膏组。
在牙周疾病中，牙龈炎和牙龈出血发生率较高。采用微生物试验评价和动物试验评价二种方法相结合，以提高产品研究工作的效率，并减低临床试验成本。我们建立了一个综合评价白芨提取物及其牙膏对抗牙龈炎修复功效的体外模型，从X-ray组织观察、探针牙龈诊断(GI、PI)、唾液中免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)检测以及血浆中细胞因子IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α指标全面评价牙膏对牙周炎的治疗分析。其中GI、PI指数明显比造模成功后低，牙膏处理后X-射线影像显示相邻磨牙间隙比造模成功时明显减小，后牙齿与牙槽缝隙明显降低，牙槽嵴轻微吸收，牙槽骨骨质有所增加。进一步证明，牙膏对炎症介质和炎性细胞因子的抑制作用导致实验结果显示出较好的抗炎性，并与体外HGECs炎症模型的结果一致。

Claims (2)

1.一种评价包含白芨提取物的牙膏抗炎性能的方法，其特征在于，通过体外评价模型获得所述牙膏样品和对照样品细胞因子IL-10、IL-6、IL-1β和TNF-α的含量，并根据其含量变化评价所述包含白芨提取物的牙膏抗炎性能，其中抗炎因子IL-10升高，表示牙膏抗炎效果越好，炎症因子IL-1β和IL-6降低，表示牙膏抗炎效果越好，肿瘤坏死因子TNF-α降低，表示牙膏抗炎效果越好；
所述包含白芨提取物的牙膏抗炎性能体外评价模型通过包含以下步骤的构建方法得到：
(ⅰ)牙膏样品前处理：将牙膏溶于等量无水乙醇中，在60℃加入少量无水硫酸钠搅拌至充分溶解，离心，取上清液后40℃和75rpm旋蒸至初始牙膏体积，真空干燥6h，-80℃冻藏12h，冻干20h，得到牙膏的醇提物，用0.9%的生理盐水或DMEM培养基逐步稀释，离心，0.22µm滤膜过滤，4℃保存；
(ⅱ)HGECs细胞培养：HGECs培养于含有10%热灭活牛血清DMEM高糖培养基中，添加1%100µg/mL的青霉素和链霉素，37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内及时换液并传代培养；
(ⅲ)细胞活性检测确定包含白芨提取物的牙膏样品最适浓度，包括步骤：
a)取步骤(ⅱ)中生长状态呈对数期的细胞，检测其空白时的吸光度OD0；
b)向其中分别加入100µL 含有10µL 浓度为10μg/mLLPS的实验样品和对照样品，培养24h，实验样品为包括若干个包含不同浓度梯度白芨提取物的牙膏样品，对照样品为不添加任何样品的培养基溶液；
c)加入CCK-8试剂，孵育6h，测量550nm处各样品的吸光度ODt；
d）筛选得到细胞存活率在80%-100%范围内实验样品的最适浓度；
所述牙膏样品内白芨提取物的浓度梯度为0.05-0.80µg /mL，细胞存活率=(实验样品ODt-OD0)/(对照样品ODt-OD0)×100%；
(ⅳ)取步骤(ⅱ)中生长状态呈对数期的细胞，加入10µL 浓度为10μg/mL LPS诱导细胞中HEGCs使其呈炎症状态，再分别加入100µL 步骤(ⅲ)中最适浓度的实验样品和相同浓度对照样品，培养24h，分别检测细胞分泌细胞因子IL-10、IL-6、IL-1β和TNF-α的含量；
还包括通过动物模型验证所述体外评价模型一致性的步骤。
2.根据权利要求1所述的评价包含白芨提取物的牙膏抗炎性能的方法，其特征在于，细胞存活率80%-100%范围内所述牙膏样品内白芨提取物的最适浓度为0.5µg /mL。
CN201911213385.9A 2019-12-02 2019-12-02 包含白芨提取物的牙膏抗炎性能体外评价模型和方法 Active CN110907372B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911213385.9A CN110907372B (zh) 2019-12-02 2019-12-02 包含白芨提取物的牙膏抗炎性能体外评价模型和方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911213385.9A CN110907372B (zh) 2019-12-02 2019-12-02 包含白芨提取物的牙膏抗炎性能体外评价模型和方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110907372A CN110907372A (zh) 2020-03-24
CN110907372B true CN110907372B (zh) 2023-02-14

Family

ID=69821255

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911213385.9A Active CN110907372B (zh) 2019-12-02 2019-12-02 包含白芨提取物的牙膏抗炎性能体外评价模型和方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110907372B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111925978A (zh) * 2020-07-07 2020-11-13 武汉市农业科学院 一种医疗材料中甲醛体外细胞毒性的测试方法
CN112921065A (zh) * 2021-02-05 2021-06-08 广州舒客实业有限公司 含透明质酸口腔护理组合物的筛选***、模型及构建方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101463343A (zh) * 2008-12-30 2009-06-24 同济大学 用于抗炎药物筛选的细胞模型及利用其筛选药物的方法
CN104644494A (zh) * 2013-11-19 2015-05-27 株式会社爱茉莉太平洋 含有天然植物提取物作为有效成分的组合物及包含其的皮肤外用剂、化妆品及药剂
CN104762364A (zh) * 2015-04-13 2015-07-08 安徽农业大学 黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法
CN106498021A (zh) * 2016-11-25 2017-03-15 云南中烟工业有限责任公司 一种检测***烟制品对细胞炎症效应因子分泌量影响方法
CN106860122A (zh) * 2016-12-28 2017-06-20 贵州艾力康中草药开发有限公司 一种用于预防口腔溃疡的艾纳香牙膏及其制备方法
CN108486056A (zh) * 2018-04-27 2018-09-04 吉林大学 一种lps诱导raw264.7细胞炎症模型的建立方法
CN109142701A (zh) * 2018-07-28 2019-01-04 江西师范大学 一种羊踯躅提取物的抗炎活性检测方法和应用
CN110055211A (zh) * 2019-04-29 2019-07-26 兰州大学第一医院 利用黄连素减轻脂多糖建立体外人子***模型的方法
CN110327423A (zh) * 2019-07-29 2019-10-15 江苏迦南美地生物科技有限公司 一种含有白芨提取物成分的口腔科和喉科的消炎用喷剂

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101463343A (zh) * 2008-12-30 2009-06-24 同济大学 用于抗炎药物筛选的细胞模型及利用其筛选药物的方法
CN104644494A (zh) * 2013-11-19 2015-05-27 株式会社爱茉莉太平洋 含有天然植物提取物作为有效成分的组合物及包含其的皮肤外用剂、化妆品及药剂
CN104762364A (zh) * 2015-04-13 2015-07-08 安徽农业大学 黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法
CN106498021A (zh) * 2016-11-25 2017-03-15 云南中烟工业有限责任公司 一种检测***烟制品对细胞炎症效应因子分泌量影响方法
CN106860122A (zh) * 2016-12-28 2017-06-20 贵州艾力康中草药开发有限公司 一种用于预防口腔溃疡的艾纳香牙膏及其制备方法
CN108486056A (zh) * 2018-04-27 2018-09-04 吉林大学 一种lps诱导raw264.7细胞炎症模型的建立方法
CN109142701A (zh) * 2018-07-28 2019-01-04 江西师范大学 一种羊踯躅提取物的抗炎活性检测方法和应用
CN110055211A (zh) * 2019-04-29 2019-07-26 兰州大学第一医院 利用黄连素减轻脂多糖建立体外人子***模型的方法
CN110327423A (zh) * 2019-07-29 2019-10-15 江苏迦南美地生物科技有限公司 一种含有白芨提取物成分的口腔科和喉科的消炎用喷剂

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
广佛手对脂多糖诱导的人肺上皮细胞炎症细胞因子调控的影响;欧明娥 等;《中医药学报》;20181031;第46卷(第5期);第38-41页 *
气相色谱法测定市售牙膏中二甘醇的含量;陆敏 等;《应用化工》;20090331;第38卷(第3期);第446-448页 *
白藜芦醇对高糖环境下牙龈上皮细胞TLR4表达及炎症因子分泌的影响;吕佳姝 等;《上海口腔医学》;20170228;第26卷(第1期);第32-36页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110907372A (zh) 2020-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101826071B1 (ko) 포유동물 체내에서 유래된 세포밖 소포체를 포함하는 조성물 및 이의 용도
Guggenheim et al. In vitro modeling of host-parasite interactions: the'subgingival'biofilm challenge of primary human epithelial cells
Sato et al. Peptidoglycan of Actinomyces naeslundii induces inflammatory cytokine production and stimulates osteoclastogenesis in alveolar bone resorption
AU2015262214A1 (en) Composition for treating or preventing metabolic disease, containing, as active ingredient, extracellular vesicles derived from Akkermansia muciniphila bacteria
CN110907372B (zh) 包含白芨提取物的牙膏抗炎性能体外评价模型和方法
KR102242196B1 (ko) 스핀고모나스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
CN105456299A (zh) 稳定的油产品及其制备方法和提高乳酸杆菌菌株存活的方法
JP7264531B2 (ja) モルガネラ属細菌由来ナノ小胞およびその用途
Breivik et al. Soluble β‐1, 3/1, 6‐glucan from yeast inhibits experimental periodontal disease in Wistar rats
Hathaway-Schrader et al. Commensal gut bacterium critically regulates alveolar bone homeostasis
Koide et al. Inhibition of experimental bone resorption and osteoclast formation and survival by 2-aminoethanesulphonic acid
CN111529707B (zh) Gsdmd抑制剂在制备治疗幽门螺杆菌感染的药物中的应用
CN104306958B (zh) ***结合蛋白5在促进牙周组织再生中的应用
JP2022506081A (ja) ラクトバチルス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）を含む代謝的健康のためのプロバイオティクス補助食品
Choi et al. Effects of whole cell sonicates of Treponema lecithinolyticum on osteoclast differentiation
KR20220125785A (ko) 리포테이코산을 지표물질로 포함하는 김치 유래 유산균 사균체의 인체 유래 효소분해능 및 면역 기능 증진용 조성물
CN115364124A (zh) 一种防治口腔溃疡的益生菌贴剂及其制备方法与应用
Chen et al. Effect of artesunate on cardiovascular complications in periodontitis in a type I diabetes rat model and related mechanisms
KR101882575B1 (ko) 미생물 공서 배양를 통한 천연 발효 추출물을 함유하는 치주질환 예방 또는 개선용 조성물
JP2003113114A (ja) 免疫賦活素材
CN110179778B (zh) 固绿在制备α-突触核蛋白聚集抑制剂中的用途
CN113817677B (zh) 泛酸或其衍生物与α-D-葡萄糖-1,6-二磷酸或其衍生物在促进DC迁移中的用途
JP3866337B2 (ja) 新規なリピドａ及びｌｐｓ並びにこれを産生する光合成細菌
CN117106024B (zh) 一种人血清多肽agdmp1及其在改善胰岛素抵抗中的应用
TWI820946B (zh) 具抗牙周病菌附著功能之口腔醫藥組合物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant