CN104762364A - 黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法，包括如下步骤：(1)2-3代奶牛乳腺上皮细胞的获取；(2)细胞的分组及处理；(3)CCK-8法检测细胞存活率；(4)流式细胞术检测细胞周期；(5)DNA ladder检测凋亡细胞核酸的变化情况；(6)透射电镜观察细胞内部形态结构变化；(7)放射免疫法检测细胞上清液中炎症相关细胞因子含量；(8)生化试剂盒法检测细胞上清液中炎症相关酶活。通过本发明所述方法对黄芪多糖拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡的作用进行探讨，高效、简便、可行且结果精确。
Description
技术领域
本发明涉及一种黄芪多糖的应用方法；尤其涉及一种黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法。
背景技术
奶牛乳腺炎严重影响奶牛的产奶量，降低牛奶品质，危害消费者健康，且延长奶牛产后发情期，增加奶牛淘汰率，从而降低奶牛养殖业经济效益。目前，关于奶牛乳腺炎的治疗手段很多，如化学药物疗法、基因工程疫苗治疗、细胞因子治疗、细菌素治疗、激素治疗及抗奶牛乳腺炎病原菌复合卵黄抗体治疗等。这些方法各有所长，虽不能彻底治愈，但都能起到一定疗效。然而这些方法的副作用却不容忽视，特别是药物残留，间接危及人类健康。因此，如何利用生物活性物质调动乳腺组织自身的防御机制，从而调节乳腺的健康水平成为奶牛乳腺炎防治研究的热点。
乳腺上皮细胞是构成乳腺的主要功能细胞，也是宿主机体抵御病原微生物入侵乳腺时的第一道防御屏障。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)，是革兰氏阴性菌(G-)细胞外膜上一种大分子结构成分。牛的乳腺对LPS的刺激非常敏感，乳腺内灌注LPS，能够诱导明显的***炎症状，同时可增加血液和乳汁中脂多糖结合蛋白和可溶性CD14的水平及炎性因子的释放，其诱发的炎症反应和G-菌感染乳腺引起的炎症反应有着极其相似的地方，因此在临床上有着极为广泛的应用。且已有研究报道表明，在体外经LPS刺激，奶牛乳腺上皮细胞亦能分泌炎症相关的介质来介导细胞损伤。
中草药及其活性有效成分在治疗奶牛***炎的临床实践中早有报道。相关报道表明，黄芪多糖对奶牛乳腺炎的防治具有潜在的研究和开发价值。钟凯等研究黄芪多糖对大肠杆菌内毒素脂多糖诱发实验性山羊、奶牛和大鼠乳腺炎的影响，结果表明，***局部灌注黄芪多糖或灌喂动物黄芪多糖，均能减轻大肠杆菌内毒素脂多糖对乳腺组织的破坏，对脂多糖诱发的动物实验性乳腺炎有一定的保护作用。
发明内容
本发明提供了一种黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法，本发明方法具有高效、简便、可行且结果精确的优点。
一种黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法，包括如下步骤：
(1)培养奶牛乳腺上皮细胞，获取2-3代对数生长期细胞用于后续试验；
(2)细胞的分组及处理：
①取所述2-3代对数生长期奶牛乳腺上皮细胞制备成1×104个/mL的细胞悬液，按每孔150μL接种于96孔细胞培养板中，在37℃条件下，CO2体积分数为5％的培养箱中常规培养24h后，随机分为如下5个试验组：(ⅰ)空白对照组；(ⅱ)脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)模型组；(ⅲ)第一黄芪多糖模型组；(ⅳ)第二黄芪多糖模型组；(ⅴ)第三黄芪多糖模型组；每组3板重复；吸弃上清后，所述空白对照组加入基础培养液200μL，所述基础培养液为含10％体积分数小牛血清的DMEM/F12培养液；所述LPS模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS的培养液200μL；所述第一黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS、1mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液200μL；所述第二黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS、3mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液200μL；所述第三黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS、5mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液200μL；
②取所述2-3代对数生长期细胞制备成5×105-1×106个/mL的细胞悬液，按每孔1.5mL接种于6孔细胞培养板中，在37℃条件下，CO2体积分数为5％的培养箱中常规培养24h后，随机分为如下5个试验验组：(ⅰ)空白对照组；(ⅱ)脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)模型组；(ⅲ)第一黄芪多糖模型组；(ⅳ)第二黄芪多糖模型组；(ⅴ)第三黄芪多糖模型组；每组3板重复；吸弃上清后，所述空白对照组加入基础培养液2mL，所述基础培养液为含10％体积分数小牛血清的DMEM/F12培养液；所述LPS模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS的培养液2mL；所述第一黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS、1mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液2mL；所述第二黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS、3mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液2mL；所述第三黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS、5mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液2mL。
(3)CCK-8法检测所述步骤(2)中的①中所述5个试验组中细胞存活率；
(4)流式细胞术检测所述步骤(2)中的②中所述5个试验组中乳腺上皮细胞周期；
(5)琼脂糖凝胶电泳检测所述步骤(2)中的②中所述5个试验组中乳腺上皮细胞DNAladder条带；
(6)透射电镜观察所述步骤(2)中的②中所述5个试验组中乳腺上皮细胞内部超微结构的变化；
(7)放射免疫法检测所述步骤(2)中的②中所述5个试验组中细胞上清液中炎症相关细胞因子含量；
(8)生化试剂盒法检测所述步骤(2)中的②中所述5个试验组中细胞上清液中炎症相关酶酶活。
本发明所述黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法，其中，所述步骤(1)具体包括如下步骤：
采用组织块培养法获得奶牛乳腺上皮细胞，用含10％体积分数小牛血清的DMEM/F12培养液作为基础培养基，于37℃、CO2体积分数为5％的培养箱中培养，经纯化后取2-3代对数生长期细胞用于后续试验。
本发明所述黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法，其中，所述步骤(3)具体包括如下步骤：
所述步骤(2)中的①中得到的5个试验组分别继续培养8h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，继续孵育1～4h，观察培养基颜色变化，在全自动酶标仪测定各孔在490nm处的吸光度值，分别计算得到所述5个试验组细胞抑制率、细胞存活率，所述细胞抑制率的计算方法为：细胞抑制率＝1-(试验组OD值/对照组OD值)×100％，细胞存活率＝1-细胞抑制率；对照组的细胞存活率定义为100％。
本发明所述黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法，其中，所述步骤(4)具体包括如下步骤：
所述步骤(2)中的②中得到所述5个试验组分别继续培养8h后，分别进行胰酶消化得到单细胞悬液并分别移至离心管中进行第一次离心，所述第一次离心为在室温条件下1500rpm离心5min，小心吸除上清液后，再分别加入1mL PBS吹打细胞沉淀后转移至流式上样管中，再次离心并吸除上清，所述再次离心与所述第一次离心条件相同，所述吸除上清液时留50μL上清液以免吸走细胞，得到细胞周期待测样品；将所述细胞周期待测样品分别进行流式细胞术检测。
本发明所述黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法，其中，所述步骤(5)具体包括如下步骤：
所述步骤(2)中的②中得到所述5个试验组分别继续培养8h后，分别胰酶消化收集细胞，分别用酚-氯仿-异戊醇法抽提细胞DNA，于1％琼脂糖凝胶中电泳，检测细胞DNA完整性。
本发明所述黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法，其中，所述步骤(6)具体包括如下步骤：
所述步骤(2)中的②中得到所述5个试验组分别继续培养8h后，分别胰酶消化收集细胞，用质量分数为2.5％的戊二醛固定，清洗数次后再用1％锇酸固定；然后分别进行脱水，所述脱水为先用质量分数为50％-70％的酒精逐级脱水，再用质量分数为80％-100％的丙酮逐级脱水；脱水后分别用Epon812树脂包埋，制成1μm半薄切片，再用甲苯胺兰染色，组织定位后制成70-80nm超薄切片，用醋酸铀-枸橼酸铅将所述超薄切片双重染色，分别在JSM-6700F透射电镜下观察所述5个试验组乳腺上皮细胞内部超微结构形态及其凋亡情况。
本发明所述黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法，其中，所述步骤(7)具体包括如下步骤：
所述步骤(2)中的②中得到所述5个试验组分别继续培养8h后，分别收集各组细胞上清液，放射免疫法检测所述各组细胞上清液中炎症相关细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-2的质量分数，单位分别依次为pg/mL、ng/mL、pg/mL、ng/mL。
本发明所述黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法，其中，所述步骤(8)具体包括如下步骤：
所述步骤(2)中的②中得到所述5个试验组分别继续培养8h后，分别收集各组细胞上清液，生化试剂盒法检测各组细胞上清液中炎症相关酶NAGase、AKP、MPO、iNOS的酶活，单位为U/L。
本发明黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法的有益效果为：
目前乳腺炎防治研究的热点是如何利用生物活性物质调动乳腺自身的防御机制、调节乳腺的健康水平，利用中草药有效成分(植物源生物活性成分)防治奶牛***炎的显著效果已日益为国内外专家关注。本发明所述方法致于阐明黄芪多糖对脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡的拮抗作用及其机制，有助于深入了解脂多糖对正常奶牛乳腺上皮细胞凋亡损伤和黄芪多糖拮抗细胞凋亡的作用机理以及内在联系。可为深入研究奶牛乳腺炎的致病机理、试验性治疗和药效学研究提供试验模型基础和数据参考。
且以奶牛乳腺上皮细胞为试验材料比通过活组织取样或屠杀大型动物(如奶牛)获得试验材料安全、经济和简便的多。在体外培养条件下研究药物或内毒素等对乳腺上皮细胞的影响，从而能够直接观察正常和病变情况下细胞的一系列生理活动，并进一步对各种药物或内毒素的作用做出客观评价，解决在活体情况下难以研究的许多问题。
下面结合附图对本发明黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法作进一步说明。
附图说明
图1为本发明黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法中CCK-8法检测各试验组乳腺上皮细胞存活率的数据统计分析图；其中，对照组为空白对照组，模型组为LPS模型组，1mg/mL为第一黄芪多糖模型组，3mg/mL为第二黄芪多糖模型组，5mg/mL为第三黄芪多糖模型组；**表示：与空白对照组相比，LPS模型组细胞存活率极显著降低(P<0.01)；##表示：与LPS模型组相比，各黄芪多糖模型组细胞活率均极显著提高(P<0.01)。
图2为本发明黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法中各试验组DNA琼脂糖凝胶电泳图；A泳道为marker；B泳道为空白对照组；C泳道为LPS模型组；D泳道为第一黄芪多糖模型组；E泳道为第二黄芪多糖模型组；F泳道为第三黄芪多糖模型组。
图3为本发明黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法中各试验组细胞内部超微结构图；其中，A图为空白对照组；B图为LPS模型组；C图为第一黄芪多糖模型组；D图为第二黄芪多糖模型组；E图为第三黄芪多糖模型组。
图4为本发明黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法中各试验组细胞上清液炎症细胞因子含量的数据统计分析图；其中，A图为TNF-α含量比较；B图为IL-1β含量比较；C图为IL-6含量比较。其中，对照组为空白对照组，模型组为LPS模型组，1mg/mL为第一黄芪多糖模型组，3mg/mL为第二黄芪多糖模型组，5mg/mL为第三黄芪多糖模型组；
图5为本发明黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法中各试验组细胞上清液炎症相关酶酶活的数据统计分析图；其中，A图为NAGase酶活比较；B图为AKP酶活比较；C图为MPO酶活比较；D图为iNOS酶活比较。其中，对照组为空白对照组，模型组为LPS模型组，1mg/mL为第一黄芪多糖模型组，3mg/mL为第二黄芪多糖模型组，5mg/mL为第三黄芪多糖模型组。
具体实施方式
实施例1
一种黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法，包括如下步骤：
(1)培养奶牛乳腺上皮细胞，获取2-3代对数生长期细胞用于后续试验；
(2)细胞的分组及处理：
①取所述2-3代对数生长期奶牛乳腺上皮细胞制备成1×104个/mL的细胞悬液，按每孔150μL接种于96孔细胞培养板中，在37℃条件下，CO2体积分数为5％的培养箱中常规培养24h后，随机分为如下5个试验组：(ⅰ)空白对照组；(ⅱ)脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)模型组；(ⅲ)第一黄芪多糖模型组；(ⅳ)第二黄芪多糖模型组；(ⅴ)第三黄芪多糖模型组；每组3板重复；吸弃上清后，所述空白对照组加入基础培养液200μL，所述基础培养液为含10％体积分数小牛血清的DMEM/F12培养液；所述LPS模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS的培养液200μL；所述第一黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS、1mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液200μL；所述第二黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS、3mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液200μL；所述第三黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS、5mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液200μL；
②取所述2-3代对数生长期奶牛乳腺上皮细胞制备成5×105-1×106个/mL的细胞悬液，按每孔1.5mL接种于6孔细胞培养板中，在37℃条件下，CO2体积分数为5％的培养箱中常规培养24h后，随机分为如下5个试验验组：(ⅰ)空白对照组；(ⅱ)脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)模型组；(ⅲ)第一黄芪多糖模型组；(ⅳ)第二黄芪多糖模型组；(ⅴ)第三黄芪多糖模型组；每组3板重复；吸弃上清后，所述空白对照组加入基础培养液2mL，所述基础培养液为含10％体积分数小牛血清的DMEM/F12培养液；所述LPS模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS的培养液2mL；所述第一黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS、1mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液2mL；所述第二黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS、3mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液2mL；所述第三黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS、5mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液2mL。
(3)CCK-8法检测所述步骤(2)中的①中所述5个试验组中细胞存活率；
(4)流式细胞术检测所述步骤(2)中的②中所述5个试验组中乳腺上皮细胞周期；
(5)琼脂糖凝胶电泳检测所述步骤(2)中的②中所述5个试验组中乳腺上皮细胞DNAladder条带；
(6)透射电镜观察所述步骤(2)中的②中所述5个试验组中乳腺上皮细胞内部超微结构的变化；
(7)放射免疫法检测所述步骤(2)中的②中所述5个试验组中细胞上清液中炎症相关细胞因子含量；
(8)生化试剂盒法检测所述步骤(2)中的②中所述5个试验组中细胞上清液中炎症相关酶酶活。
实施例2
一种黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法，包括如下步骤：
(1)采用组织块培养法获得奶牛乳腺上皮细胞，用含10％体积分数小牛血清的DMEM/F12培养液作为基础培养基，于37℃、CO2体积分数为5％的培养箱中培养，经纯化后取2-3代对数生长期细胞用于后续试验。
(2)细胞的分组及处理：
①取所述2-3代对数生长期奶牛乳腺上皮细胞制备成1×104个/mL的细胞悬液，按每孔150μL接种于96孔细胞培养板中，在37℃条件下，CO2体积分数为5％的培养箱中常规培养24h后，随机分为如下5个试验组：(ⅰ)空白对照组；(ⅱ)脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)模型组；(ⅲ)第一黄芪多糖模型组；(ⅳ)第二黄芪多糖模型组；(ⅴ)第三黄芪多糖模型组；每组3板重复；吸弃上清后，所述空白对照组加入基础培养液200μL，所述基础培养液为含10％体积分数小牛血清的DMEM/F12培养液；所述LPS模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS的培养液200μL；所述第一黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS、1mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液200μL；所述第二黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS、3mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液200μL；所述第三黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS、5mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液200μL；
②取所述2-3代对数生长期细胞制备成5×105-1×106个/mL的细胞悬液，按每孔1.5mL接种于6孔细胞培养板中，在37℃条件下，CO2体积分数为5％的培养箱中常规培养24h后，随机分为如下5个试验验组：(ⅰ)空白对照组；(ⅱ)脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)模型组；(ⅲ)第一黄芪多糖模型组；(ⅳ)第二黄芪多糖模型组；(ⅴ)第三黄芪多糖模型组；每组3板重复；吸弃上清后，所述空白对照组加入基础培养液2mL，所述基础培养液为含10％体积分数小牛血清的DMEM/F12培养液；所述LPS模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS的培养液2mL；所述第一黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS、1mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液2mL；所述第二黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS、3mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液2mL；所述第三黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度LPS、5mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液2mL。
(3)所述步骤(2)中的①中得到的5个试验组分别继续培养8h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，继续孵育1～4h，观察培养基颜色变化，在全自动酶标仪测定各孔在490nm处的吸光度值，分别计算得到所述5个试验组细胞抑制率、细胞存活率，所述细胞抑制率的计算方法为：细胞抑制率＝1-(试验组OD值/对照组OD值)×100％，细胞存活率＝1-细胞抑制率；对照组的细胞存活率定义为100％。
结果如图1所示：与空白对照组相比，LPS模型组细胞存活率极显著降低(P<0.01)；与LPS模型组相比，第一、第二和第三黄芪多糖模型组细胞存活率均极显著提高(P<0.01)；将空白对照组细胞存活率定为100％，统计数据后，LPS模型组细胞存活率为50.64％，表明LPS模型组细胞还原CCK-8的能力下降，细胞活力下降；第一、第二和第三黄芪多糖模型组细胞存活率分别为：62.94％、74.85％和85.13％，说明黄芪多糖能显著抑制LPS诱导的乳腺上皮细胞凋亡损伤，对乳腺上皮细胞有保护作用。
(4)所述步骤(2)中的②中得到所述5个试验组分别继续培养8h后，分别进行胰酶消化得到单细胞悬液并分别移至离心管中进行第一次离心，所述第一次离心为在室温条件下1500rpm离心5min，小心吸除上清液后，再分别加入1mL PBS吹打细胞沉淀后转移至流式上样管中，再次离心并吸除上清，所述再次离心与所述第一次离心条件相同，所述吸除上清液时留50μL上清液以免吸走细胞，得到细胞周期待测样品；将所述细胞周期待测样品分别进行流式细胞术检测。
结果如表1所示：LPS模型组与对照组比较，G0/G1期乳腺上皮细胞极显著增加(P<0.01)，S期、G2/M期细胞数、增殖指数(PI)均极显著降低(P<0.01)，并出现了凋亡峰；与LPS模型组相比，第一黄芪多糖模型组各细胞周期内细胞比例及增殖指数均无显著变化，也有凋亡峰的出现；与LPS模型组相比，第二黄芪多糖模型组G0/G1期乳腺上皮细胞极显著减少(P<0.01)，S期细胞比例、增殖指数均极显著增加(P<0.01)；与LPS模型组相比，第三黄芪多糖模型组G0/G1期乳腺上皮细胞极显著减少(P<0.01)，G2/M期细胞比例显著增加(P<0.05)，，S期细胞比例、增殖指数均极显著增加(P<0.01)。细胞周期中，G0/G1期细胞数量百分比减小，S期细胞数量百分比增加反映了细胞内DNA增殖。结果提示，3-5mg/mL黄芪多糖处理后使G0/G1期的细胞数量百分比减少，S期细胞数量百分比以及增殖指数增加，说明黄芪多糖能促使凋亡的乳腺上皮细胞停留在S期、细胞DNA合成增加，从而能显著抑制LPS诱导的乳腺上皮细胞凋亡损伤，对乳腺上皮细胞有保护作用。
表1 黄芪多糖对LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡周期的影响
注：LPS模型组与对照组相比较:*p<0.05,**p<0.01，黄芪多糖模型组与LPS模型组相比较：#p<0.05,##p<0.01。
(5)所述步骤(2)中的②中得到所述5个试验组分别继续培养8h后，分别胰酶消化收集细胞，分别用酚-氯仿-异戊醇法抽提细胞DNA，于1％琼脂糖凝胶中电泳，检测细胞DNA完整性。
结果如图2所示：与空白对照组细胞相比较，LPS模型组细胞出现DNA断裂程度较严重，在电泳图中呈现一系列不同长度的DNA片段；第二、三黄芪多糖模型组细胞DNA片段情况与空白对照组接近；而第一浓度黄芪多糖模型组与模型组细胞DNA片段情况相似，均出现了DNA梯状条带。细胞凋亡的发生，会引发其内源性核酸内切酶被激活，导致细胞内DNA被切成180～200bp长度不等的多个DNA片段，长度不等的DNA片段通过1％琼脂糖凝胶电泳会呈现出不同的条带；试验结果表明，黄芪多糖能够降低LPS诱导乳腺上皮细胞的DNA断裂程度，对细胞凋亡具有拮抗作用，且在本方法所述黄芪多糖质量浓度范围内呈剂量依赖性关系。
(6)所述步骤(2)中的②中得到所述5个试验组分别继续培养8h后，分别胰酶消化收集细胞，用质量分数为2.5％的戊二醛固定，清洗数次后再用1％锇酸固定；然后分别进行脱水，所述脱水为先用质量分数为50％-70％的酒精逐级脱水，再用质量分数为80％-100％的丙酮逐级脱水；脱水后分别用Epon812树脂包埋，制成1μm半薄切片，再用甲苯胺兰染色，组织定位后制成70-80nm超薄切片，用醋酸铀-枸橼酸铅将所述超薄切片双重染色，分别在JSM-6700F透射电镜下观察所述5个试验组乳腺上皮细胞内部超微结构形态及其凋亡情况。
结果如图3所示，透射电镜下可观察到，对照组乳腺上皮细胞细胞膜清晰完整，位于细胞中央，核内染色质均匀分布；LPS模型组出现细胞核碎裂、染色质浓缩，空泡增多，胞浆浓缩，出现大小不等的凋亡小体；第一黄芪多糖模型组，细胞核固缩、染色质浓缩；第二、三黄芪多糖模型组，细胞核形态趋于正常，染色质均匀分布、核膜清晰可见。结果表明，黄芪多糖能够降低LPS诱导乳腺上皮细胞的凋亡损伤，对细胞凋亡具有拮抗作用，且在本方法所述黄芪多糖质量浓度范围内呈剂量依赖性关系。
(7)所述步骤(2)中的②中得到所述5个试验组分别继续培养8h后，分别收集各组细胞上清液，放射免疫法检测所述各组细胞上清液中炎症相关细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-2的质量分数，单位分别依次为pg/mL、ng/mL、pg/mL、ng/mL。
结果如图4所示：与空白对照组相比，LPS模型组细胞上清液中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌极显著上升(P<0.01)；与LPS模型组相比，第一黄芪多糖模型组细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌水平明显降低(P<0.05)；与LPS模型组相比，第二、三黄芪多糖模型组细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌水平极显著降低(P<0.01)；结果表明黄芪多糖可以通过降低炎性细胞因子的过度分泌和释放，减轻LPS对乳腺上皮细胞的损伤，且在本方法所述黄芪多糖质量浓度范围内呈剂量依赖性关系。
(8)所述步骤(2)中②中得到所述5个试验组分别继续培养8h后，分别收集各组细胞上清液，生化试剂盒法检测各组细胞上清液中炎症相关酶NAGase、AKP、MPO、iNOS的酶活，单位为U/L。
结果如图5所示：与正常对照组相比较，LPS模型组细胞上清液中NAGase、AKP、MPO、iNOS的活性都极显著升高(P<0.01)；与LPS模型组相比，第一黄芪多糖模型组极显著降低了MPO酶活(P<0.01)；与LPS模型组相比，第二黄芪多糖模型组极显著降低了NAGase、MPO、iNOS酶活(P<0.01)，显著降低了AKP酶活(P<0.05)；与LPS模型组相比，第三黄芪多糖模型组极显著降低了NAGase、AKP、MPO、iNOS酶活(P<0.01)；NAGase、AKP、MPO、iNOS均是机体内提示炎症、乳腺受破坏程度的经典指标，在致病菌诱导的乳腺炎中，炎性细胞因子和炎症相关酶的过度分泌是导致乳腺上皮细胞损伤的主要因素。与模型组相比较，第二、三黄芪多糖模型组可明显降低这四种酶的活性，第一黄芪多糖模型组变化不明显，说明黄芪多糖可以通过降低炎性相关酶的过度分泌和释放，减轻LPS对乳腺上皮细胞的损伤，且在本方法所述黄芪多糖质量浓度范围内呈剂量依赖性关系。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)培养奶牛乳腺上皮细胞，获取2-3代对数生长期细胞用于后续试验；
(2)细胞的分组及处理：
①取所述2-3代对数生长期奶牛乳腺上皮细胞制备成1×104个/mL的细胞悬液，按每孔150μL接种于96孔细胞培养板中，在37℃条件下，CO2体积分数为5％的培养箱中常规培养24h后，随机分为如下5个试验组:(ⅰ)空白对照组；(ⅱ)脂多糖模型组，也称为Lipopolysaccharide模型组，即LPS模型组；(ⅲ)第一黄芪多糖模型组；(ⅳ)第二黄芪多糖模型组；(ⅴ)第三黄芪多糖模型组；每组3板重复；吸弃上清后，所述空白对照组加入基础培养液200μL，所述基础培养液为含10％体积分数小牛血清的DMEM/F12培养液；所述脂多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度脂多糖的培养液200μL；所述第一黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度脂多糖、1mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液200μL；所述第二黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度脂多糖、3mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液200μL；所述第三黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度脂多糖、5mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液200μL；
②取所述2-3代对数生长期奶牛乳腺上皮细胞制备成5×105-1×106个/mL的细胞悬液，按每孔1.5mL接种于6孔细胞培养板中，在37℃条件下，CO2体积分数为5％的培养箱中常规培养24h后，随机分为如下5个试验组：(ⅰ)空白对照组；(ⅱ)脂多糖模型组，即LPS模型组；(ⅲ)第一黄芪多糖模型组；(ⅳ)第二黄芪多糖模型组；(ⅴ)第三黄芪多糖模型组；每组3板重复；吸弃上清后，所述空白对照组加入基础培养液2mL，所述基础培养液为含10％体积分数小牛血清的DMEM/F12培养液；所述LPS模型组加入含100μg/mL质量浓度脂多糖的培养液2mL；所述第一黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度脂多糖、1mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液2mL；所述第二黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度脂多糖、3mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液2mL；所述第三黄芪多糖模型组加入含100μg/mL质量浓度脂多糖、5mg/mL质量浓度黄芪多糖的培养液2mL。
(3)CCK-8法检测所述步骤(2)中的①中所述5个试验组中细胞存活率；
(4)流式细胞术检测所述步骤(2)中的②中所述5个试验组中乳腺上皮细胞周期；
(5)琼脂糖凝胶电泳检测所述步骤(2)中的②中所述5个试验组中乳腺上皮细胞DNAladder条带；
(6)透射电镜观察所述步骤(2)中的②中所述5个试验组中乳腺上皮细胞内部超微结构的变化；
(7)放射免疫法检测所述步骤(2)中的②中所述5个试验组中细胞上清液中炎症相关细胞因子含量；
(8)生化试剂盒法检测所述步骤(2)中的②中所述5个试验组中细胞上清液中炎症相关酶酶活。
2.根据权利要求1所述黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括如下步骤：
采用组织块培养法获得奶牛乳腺上皮细胞，用含10％体积分数小牛血清的DMEM/F12培养液作为基础培养基，于37℃、CO2体积分数为5％的培养箱中培养，经纯化后取2-3代对数生长期细胞用于后续试验。
3.根据权利要求1所述黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括如下步骤：
所述步骤(2)中的①中得到的5个试验组分别继续培养8h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，继续孵育1～4h，观察培养基颜色变化，在全自动酶标仪测定各孔在490nm处的吸光度值，分别计算得到所述5个试验组细胞抑制率、细胞存活率，所述细胞抑制率的计算方法为：细胞抑制率＝1-(试验组OD值/对照组OD值)×100％，细胞存活率＝1-细胞抑制率；对照组的细胞存活率定义为100％。
4.根据权利要求1所述黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法，其特征在于，所述步骤(4)具体包括如下步骤：
所述步骤(2)中的②中得到所述5个试验组分别继续培养8h后，分别进行胰酶消化得到单细胞悬液并分别移至离心管中进行第一次离心，所述第一次离心为在室温条件下1500rpm离心5min，小心吸除上清液后，再分别加入1mL PBS吹打细胞沉淀后转移至流式上样管中，再次离心并吸除上清，所述再次离心与所述第一次离心条件相同，所述吸除上清液时留50μL上清液以免吸走细胞，得到细胞周期待测样品；将所述细胞周期待测样品分别进行流式细胞术检测。
5.根据权利要求1所述黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法，其特征在于，所述步骤(5)具体包括如下步骤：
所述步骤(2)中的②中得到所述5个试验组分别继续培养8h后，分别胰酶消化收集细胞，分别用酚-氯仿-异戊醇法抽提细胞DNA，于1％琼脂糖凝胶中电泳，检测细胞DNA完整性。
6.根据权利要求1所述黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法，其特征在于，所述步骤(6)具体包括如下步骤：
所述步骤(2)中的②中得到所述5个试验组分别继续培养8h后，分别胰酶消化收集细胞，用质量分数为2.5％的戊二醛固定，清洗数次后再用1％锇酸固定；然后分别进行脱水，所述脱水为先用质量分数为50％-70％的酒精逐级脱水，再用质量分数为80％-100％的丙酮逐级脱水；脱水后分别用Epon812树脂包埋，制成1μm半薄切片，再用甲苯胺兰染色，组织定位后制成70-80nm超薄切片，用醋酸铀-枸橼酸铅将所述超薄切片双重染色，分别在JSM-6700F透射电镜下观察所述5个试验组乳腺上皮细胞内部超微结构形态及其凋亡情况。
7.根据权利要求1所述黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法，其特征在于，所述步骤(7)具体包括如下步骤：
所述步骤(2)中的②中得到所述5个试验组分别继续培养8h后，分别收集各组细胞上清液，放射免疫法检测所述各组细胞上清液中炎症相关细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-2的质量分数，单位分别依次为pg/mL、ng/mL、pg/mL、ng/mL。
8.根据权利要求1所述黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法，其特征在于，所述步骤(8)具体包括如下步骤：
所述步骤(2)中的②中得到所述5个试验组分别继续培养8h后，分别收集各组细胞上清液，生化试剂盒法检测各组细胞上清液中炎症相关酶NAGase、AKP、MPO、iNOS的酶活，单位为U/L。
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