CN110897993A - 一种外泌体冻干粉的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种外泌体冻干粉的制备方法，将外泌体提取液、保护剂、添加剂和超纯水混合，搅拌均匀，得到混合液，将混合液依次经过预冻、加强预冻、预抽真空、升华干燥和解析干燥处理，得到外泌体冻干粉，所得外泌体冻干粉蛋白活性可以保持90％以上，可冷藏或是室温保存1~2年，整个生产周期仅需要15~25小时，极大改善保存条件的要求同时便于运输；本发明一种外泌体冻干粉的应用，在促血管形成、促进细胞新生及免疫调节方面有重要作用；将外泌体冻干粉应用在美容行业，有效与皮肤细胞发生作用，促进上皮细胞的营养代谢，减少皮肤受到紫外线、自由基等侵害，减少黑色素的生成，促使真皮层胶原细胞的增生，具有抚平细纹，延缓皮肤老化、美白肌肤的效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医药制备技术领域，具体涉及一种外泌体冻干粉的制备方法及其应用。
背景技术
外泌体（exosome，Exo）是细胞向胞外分泌的囊泡类小体，直径为30nm~150nm，具有典型的脂质双分子层膜结构，存在于细胞培养上清液、 血浆、血清、唾液、尿液、羊水其它生物体液中，在机体多种生理病理过程中发挥重要作用，是近些年来生物医学领域研究的热点问题。目前干细胞广泛应用于组织修复等领域。与干细胞比较，作为其旁分泌物的干细胞外泌体具有更稳定的生物特性，有研究表明外泌体在-80℃保存2年仍能保持其生物学功能。近期研究发现，干细胞来源的外泌体可以有效转运mRNA、micro RNA及蛋白质等生物活性物质，具有减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等重要生物学功能，在调控组织再生方面存在良好的临床应用前景，目前国内鲜有将外泌体应用在生物美容领域。
外泌体提取液以液态形式保存的保质期非常短，而且保存条件非常苛刻，一般在4℃下只能保存2天左右，-20℃冷冻的条件下也只能保存半年左右，极大地限制了外泌体的应用。因此，如何方便的保存外泌体，且保持其生物活性及稳定性，同时也方便运输是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种外泌体冻干粉的制备方法，将外泌体制成冻干粉，提高外泌体的生物活性及稳定性，能够在冷藏或者常温下保存较长时间，且方便运输；
本发明的目的之二在于提供一种外泌体冻干粉的应用，将外泌体冻干粉应用在美容行业，实现美白、抗衰的效果。
本发明所采用的技术方案是，一种外泌体冻干粉的制备方法，将外泌体提取液、保护剂、添加剂和超纯水混合，搅拌均匀，得到混合液，将混合液依次经过预冻、加强预冻、预抽真空、升华干燥和解析干燥处理，得到外泌体冻干粉。
本发明的特点还在于：
混合液由以下重量份数的组分制成：外泌体提取液40~50份、保护剂8~10 份、添加剂0~2份和超纯水38~52份。
保护剂为多元醇；所述添加剂为聚合物、糖中的至少一种。
多元醇为山梨醇、甘露醇中的至少一种。
聚合物为右旋糖苷、聚乙二醇中的至少一种；所述糖为乳糖、海藻糖中的至少一种。
预冻的温度为-40~-50℃，冷冻时间为2~3h。
加强预冻的温度为-40~-50℃，冷冻时间为1~2h。
预抽真空温度为-40~-50℃，时间为0.5~1h真空度为15Pa。
升华干燥包含三个阶段，其中，
第一阶段的温度为-15℃~-10℃，时间为 6~8h，真空度为15Pa；
第二阶段的温度为-5℃~0℃，时间为1~3h，真空度为5Pa；
第三阶段的温度为0℃~10℃，时间为1~2h，真空度为0.1Pa；
解析干燥的温度为30℃~40℃，时间为3~6h，真空度为20Pa。
本发明所采用的另一个技术方案是，一种外泌体冻干粉的应用，具体按照以下步骤实施：
步骤1、制备透明质酸原液：
称取0.1~0.2份透明质酸钠、0.05~0.1份水解透明质酸钠和99.5~99.85份超纯水，在80℃~85℃下充分搅拌溶解，冷却至35℃以下，灌装，在121℃下高压蒸汽灭菌5min~20min，冷却，即得到透明质酸原液；
步骤2、称取20~30份步骤1所得透明质酸原液，倒入0.5~1份外泌体冻干粉中，摇晃至完全溶解，得到外泌体精华液，可通过微针导入或者直接涂抹于面部。
本发明的有益效果在于：
1.本发明外泌体冻干粉的制备方法，将保护剂与外泌体提取液混合后依次经过预冻、加强预冻、预抽真空、升华干燥和解析干燥处理，所得外泌体冻干粉蛋白活性可以保持90％以上，可冷藏或是室温保存1~2年，整个生产周期仅需要 15~25小时，极大改善保存条件的要求同时便于运输；
2.本发明外泌体冻干粉的应用，在促血管形成、促进细胞新生及免疫调节方面有重要作用；将外泌体冻干粉应用在美容行业，有效与皮肤细胞发生作用，促进上皮细胞的营养代谢，减少皮肤受到紫外线、自由基等侵害，减少黑色素的生成，促使真皮层胶原细胞的增生，具有抚平细纹，延缓皮肤老化、美白肌肤的效果。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的冻干曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例和附图说明，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所采用的技术方案是，一种外泌体冻干粉的制备方法，将外泌体提取液、保护剂、添加剂和超纯水混合，搅拌均匀，得到混合液，混合液由以下重量份数的组分制成：外泌体提取液40~50份、保护剂8~10 份、添加剂0~2份和超纯水38~52份；
其中， 保护剂为多元醇；所述添加剂为聚合物、糖中的至少一种；
多元醇为山梨醇、甘露醇中的至少一种；
聚合物为右旋糖苷、聚乙二醇中的至少一种；
糖为乳糖、海藻糖中的至少一种；
将混合液依次经过预冻：温度为-40~-50℃、冷冻时间为2~3h；加强预冻：温度为-40~-50℃、冷冻时间为1~2h；预抽真空：温度为-40~-50℃、时间为0.5~1h、真空度为15Pa；升华干燥：包含三个阶段，第一阶段的温度为-15℃~-10℃，时间为 6~8h，真空度为15Pa；第二阶段的温度为-5℃~0℃，时间为1~3h，真空度为5Pa；第三阶段的温度为0℃~10℃，时间为1~2h，真空度为0.1Pa；解析干燥：温度为30℃~40℃，时间为3~6h，真空度为20Pa，得到外泌体冻干粉；
外泌体冻干粉的应用，具体按照以下步骤实施：
步骤1、制备透明质酸原液：
称取0.1~0.2份透明质酸钠、0.05~0.1份水解透明质酸钠、99.5~99.85份超纯水，在80~85℃下充分搅拌溶解，冷却至35℃以下，灌装，在121℃下高压蒸汽灭菌5min~20min，冷却，得到透明质酸原液；
步骤2、称取20~30份步骤1所得透明质酸原液，倒入0.5~1份外泌体冻干粉中，摇晃至完全溶解，得到外泌体精华液，可通过微针导入或者直接涂抹于面部。
外泌体是细胞间信息交流的重要载体,外泌体特性与其来源的细胞有关，因此脐带间充质干细胞外泌体的功能与其干细胞的功能密切相关，脐带间充质干细胞外泌体能够影响皮肤细胞向年轻、健康状态发展。高活性的外泌体，在促血管形成、促进细胞新生及免疫调节方面有重要作用，可以有效的与皮肤细胞发生作用，促进上皮细胞的营养代谢，预防皮肤受到紫外线、自由基等侵害， 减少黑色素的生成、还可以促使真皮层胶原细胞的增生，对术后肌肤可加速修复，对一般肌肤并具有抚平细纹，延缓皮肤老化、美白肌肤等功能。包含脐带间充质干细胞外泌体提取液，可以通过脐带间充质干细胞进行培养，收集培养液后对培养液进行分离提纯处理后而得到。
外泌体的冷冻干燥过程是一个多步骤过程，会产生低温、冻结和脱水等多种效应，因此需要有效、严格的控制冷冻条件；
冻结效应包括：
1、外泌体提取液的冻干过程中，不断结晶会导致溶液的浓度快速升高， 当溶液浓度发生变化时，离子浓度增加，促进化学反应；
2、包含外泌体的混合液在冻干过程中，会产生大量的冰-水界面，生物活性因子可能会被吸附到界面上，从而可能破坏生物活性因子的天然结构，导致外泌体变性；
3、在外泌体的混合液冻干过程中，混合液的pH值也会发生变化，导致外泌体发生物理聚集和化学变性。
脱水效应：
在冻干过程中一部分结合水被除去的现象。结合水的去除能破坏外泌体的天然结构，导致外泌体变性。这是因为富含结合水的外泌体在冻干过程中暴露在乏水环境中，将质子转化为带电羧酸基团，破坏了生物活性因子中电荷平衡，电荷密度的降低可能促进外泌体之间的疏水作用，从而使外泌体发生聚集。
本发明冻干过程采用多步骤进行，其中，在预冻阶段，外泌体以溶于混合液(物料)的状态存在，由于温度一直降低，物料过冷产生冰，在加强预冻阶段，物料将沿着平衡的熔融线不断析出冰晶，冰晶周围剩余的未冻混合液随温度下降，浓度不断升高，一直到物料中剩余的水分将不再结晶，此时的物料达到最大冻结浓缩状，浓度较高以非晶态的形式包围在冰晶周围，形成镶嵌着冰晶的玻璃体。玻璃体是指物质以非晶态形式存在的一种状态，其粘度极大，分子的能动性几乎为零，这种非晶体结构的扩散系数很低，故在这种结构中分子运动和分子变性反应非常微弱，不利的化学反应能够被抑制，从而提高复合生物活性因子的稳定性。并且通过本发明实施例的预冻和加强预冻阶段，所得玻璃体结晶均匀、晶核数量合适，利于后续的升华干燥过程中，维持通畅的升华通道，使升华速度加快；
升华干燥阶段分成三个温度梯度进行加热，因为随着水分的升华，使外泌体的浓度升高，玻璃化转变温度也会提高，通过适当逐渐提高温度，既可以加快升华进行，又可以节约能源，同时用真空泵抽真空，使其中被冻结成冰的自由水直接升华成水蒸气，使得最初水分的90％以上被除去。
在升华干燥阶段，如果温度过高，会使外泌体出现软化、塌陷，甚至喷液现象，造成冻干失败；如果温度过低不仅给制冷***提出了过高的要求，而且大大降低了升华过程的速率，费时又耗能；
升华干燥阶段真空度的控制也非常重要，本发明真空度也采用三个梯度，既能形成恰当的对流传热，又能使物料表面始终处于匀速干燥的压力状态，使得在保证升华干燥不同阶段对真空度的需要的同时，提高干燥速度。
在解析干燥阶段重新进行升温，在较高的温度下对物料加热，使部分结合水解析，再吸热蒸发成水蒸气，以进一步去除水分。
即使成功完成冷冻干燥，在后续保存过程中要保证外泌体冻干粉的稳定性也很关键，因此保护剂的选取和比例尤为重要；
保存过程中影响外泌体变性的主要因素有：由于物理 (非共价) 相互作用或者化学凝集 (共价) 造成的蛋白质凝聚；氧化反应；水解作用等，虽然冻干的生物活性因子中含有极少量的水分，但在保存过程中仍然会发生水解作用；
所以，为了防止外泌体在冷冻干燥和保存过程中变性或者失活，需要添加有效的保护剂，以稳定外泌体的活性。冻干保护剂的种类繁多，机制复杂，如果保护剂添加不当，不仅不能有效对外泌体进行保护，甚至在外泌体冻干粉的后期使用中会产生毒性等较大负面影响。而且，保护剂添加的浓度也对保护剂的保护效果起着非常重要的作用，通常，在某个浓度范围内,保护剂的保护作用随着浓度的升高而增大，当达到某一浓度时,保护作用达到最大值,而此后再增大保护剂的浓度，则保护剂的保护效果不再显著增加，过高的浓度甚至会使得冷冻干燥过程中外泌体发生变性；但是不同保护剂的保护机制不一样，呈现最大保护作用的浓度也不同，实际使用时，需要考虑多种保护剂的综合效果。
蔗糖和海藻糖作为非还原性二糖，非常稳定，能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣的条件下在细胞表面形成特殊的保护膜，有效地保护生物活性因子结构不被破坏，从而维持生物活性因子的活性。
右旋糖苷是若干葡萄糖分子脱水的聚合产物。右旋糖苷40为低分子，分子量区间为25000~50000。右旋糖苷40可以抑制冰晶的长大，所以能有效对生物活性因子起到保护作用。
聚乙二醇(PEG) 在生物活性因子的冷冻干燥过程中， 可以防止外泌体发生变性。
发明保护剂的配方，不仅能够在整个冻干过程中对外泌体起到良好的保护作用,而且能够对保存期内外泌体的变性起到抑制作用，所以，本发明实施例中保护剂的配方极大的改善了外泌体的保存条件，能够在冷藏或常温下保存1~2年，有效降低了外泌体保存的成本。
本实施例所采用的冻干设备为冻干机。
实施例1
外泌体冻干粉的制备方法：
步骤1、称取如下原料：外泌体提取液40份、山梨醇8份、右旋糖苷1份和超纯水51份，混合并搅拌均匀，得到混合液；
步骤2、将步骤1所得混合液置于冻干机中预冻，温度为-45℃，冷冻时间为2.5h，继续加强预冻，温度为-45℃，冷冻时间为1h，然后预抽真空，温度为-45℃，时间为0.5h，真空度为15Pa，得到冷冻混合料；
步骤3、将步骤2所得冷冻混合料继续进行升华干燥，首先降温至-10℃，真空度为15Pa，保温7h，继续升温至0℃，真空度降至5Pa，保温1h，然后继续升温至10℃，真空度降至0.1Pa，保温1.5h，最后进行解析干燥，即升温至40℃，真空度升至20Pa，保温4h，即得到外泌体冻干粉。
图1为实施例1的冻干曲线图，如图1所示，在预冻阶段，外泌体以溶于混合液(物料)的状态存在，物料的初始温度为20℃，经过2.5h预冻，物料降至-45℃，形成玻璃体。再通过加强预冻阶段，所得玻璃体结晶更均匀、晶核数量合适，在升华干燥阶段，分三个阶段把上述玻璃体进行加热，使其温度从-45℃升至10℃，同时用真空泵抽真空，使其中被冻结成冰的自由水直接升华成水蒸气，使得最初水分的90％以上被除去；
在解析干燥阶段，通过将温度从 10℃升至 40℃，在较高的温度下对物料加热，使部分结合水解析，再吸热蒸发成水蒸气，以进一步去除水分。
将上述外泌体冻干粉的制备方法步骤3所得外泌体冻干粉制备成外泌体精华：
步骤1、制备透明质酸原液：
称取0.1份透明质酸钠、0.05份水解透明质酸钠和99.85份超纯水，在80℃下充分搅拌溶解，冷却至25℃，灌装成6mL/支，在121℃下高压蒸汽灭菌5min，冷却，得到透明质酸原液；
步骤2、称取6mL步骤1所得透明质酸原液，倒入0.2g外泌体冻干粉中，搅拌至完全溶解，得到外泌体精华液，可通过微针导入或者直接涂抹于面部。
实施例2
步骤1、称取如下原料：外泌体提取液45份、甘露醇9份、乳糖1份和超纯水39份，混合并搅拌均匀，得到混合液；
步骤2、将步骤1所得混合液置于冻干机中预冻，温度为-40℃，冷冻时间为2h，继续加强预冻，温度为-40℃，冷冻时间为1.5h，然后预抽真空，温度为-40℃，时间为0.7h，真空度为15Pa，得到冷冻混合料；
步骤3、将步骤2所得冷冻混合料继续进行升华干燥，首先降温至-15℃，真空度为15Pa，保温6h，继续升温至-5℃，真空度降至5Pa，保温2h，然后继续升温至8℃，真空度降至0.1Pa，保温1h，最后进行解析干燥，即升温至35℃，真空度升至20Pa，保温3h，即得到外泌体冻干粉。
将上述外泌体冻干粉的制备方法步骤3所得外泌体冻干粉制备成外泌体精华：
步骤1、制备透明质酸原液：
称取0.2份透明质酸钠、0.1份水解透明质酸钠和99.5份超纯水，在82℃下充分搅拌溶解，冷却至25℃，灌装成4mL/支，在121℃下高压蒸汽灭菌5min，得到透明质酸原液；
步骤2、称取4mL步骤1所得透明质酸原液，倒入0.1g外泌体冻干粉中，搅拌至完全溶解，得到外泌体精华液，可通过微针导入或者直接涂抹于面部。
实施例3
步骤1、称取如下原料：外泌体提取液50份、山梨醇2份、甘露醇8份和超纯水38份，混合并搅拌均匀，得到混合液；
步骤2、将步骤1所得混合液置于冻干机中预冻，温度为-43℃，冷冻时间为3h，继续加强预冻，温度为-43℃，冷冻时间为2h，然后预抽真空，温度为-43℃，时间为1h，真空度为15Pa，得到冷冻混合料；
步骤3、将步骤2所得冷冻混合料继续进行升华干燥，首先降温至-12℃，真空度为15Pa，保温8h，继续升温至-3℃，真空度降至5Pa，保温3h，然后继续升温至0℃，真空度降至0.1Pa，保温2h，最后进行解析干燥，即升温至30℃，真空度升至20Pa，保温6h，即得到外泌体冻干粉。
将上述外泌体冻干粉的制备方法步骤3所得外泌体冻干粉制备成外泌体精华：
步骤1、制备透明质酸原液：
称取0.15份透明质酸钠、0.08份水解透明质酸钠和99.6份超纯水，在85℃下充分搅拌溶解，冷却至25℃，灌装成10mL/支，在121℃下高压蒸汽灭菌20min，冷却，得到透明质酸原液；
步骤2、称取10mL步骤1所得透明质酸原液，倒入0.4g外泌体冻干粉中，搅拌至完全溶解，得到外泌体精华液，可通过微针导入或者直接涂抹于面部。
实施例4
步骤1、称取如下原料：外泌体提取液45份、甘露醇9份、乳糖1份和超纯水39份，混合并搅拌均匀，得到混合液；
步骤2、将步骤1所得混合液置于冻干机中预冻，温度为-40℃，冷冻时间为2h，继续加强预冻，温度为-40℃，冷冻时间为1.5h，然后预抽真空，温度为-40℃，时间为0.7h，真空度为15Pa，得到冷冻混合料；
步骤3、将步骤2所得冷冻混合料继续进行升华干燥，首先降温至-15℃，真空度为15Pa，保温6h，继续升温至-5℃，真空度降至5Pa，保温2h，然后继续升温至8℃，真空度降至0.1Pa，保温1h，最后进行解析干燥，即升温至35℃，真空度升至20Pa，保温3h，即得到外泌体冻干粉。
将上述外泌体冻干粉的制备方法步骤3所得外泌体冻干粉制备成外泌体精华：
步骤1、制备透明质酸原液：
称取0.2份透明质酸钠、0.1份水解透明质酸钠和99.5份超纯水，在82℃下充分搅拌溶解，冷却至25℃，灌装成8mL/支，在121℃下高压蒸汽灭菌15min，冷却，得到透明质酸原液；
步骤2、称取6mL步骤1所得透明质酸原液，倒入0.25g外泌体冻干粉中，搅拌至完全溶解，得到外泌体精华液，可通过微针导入或者直接涂抹于面部。
实施例5
步骤1、称取如下原料：外泌体提取液50份、山梨醇2份、甘露醇8份、右旋糖苷1份、聚乙二醇1份和超纯水45份，混合并搅拌均匀，得到混合液；
步骤2、将步骤1所得混合液置于冻干机中预冻，温度为-43℃，冷冻时间为3h，继续加强预冻，温度为-43℃，冷冻时间为2h，然后预抽真空，温度为-43℃，时间为1h，真空度为15Pa，得到冷冻混合料；
步骤3、将步骤2所得冷冻混合料继续进行升华干燥，首先降温至-12℃，真空度为15Pa，保温8h，继续升温至-3℃，真空度降至5Pa，保温3h，然后继续升温至0℃，真空度降至0.1Pa，保温2h，最后进行解析干燥，即升温至30℃，真空度升至20Pa，保温6h，即得到外泌体冻干粉。
将上述外泌体冻干粉的制备方法步骤3所得外泌体冻干粉制备成外泌体精华：
步骤1、制备透明质酸原液：
称取0.15份透明质酸钠、0.08份水解透明质酸钠和99.6份超纯水，在85℃下充分搅拌溶解，冷却至25℃，灌装成6mL/支，在121℃下高压蒸汽灭菌5min，冷却，得到透明质酸原液；
步骤2、称取6mL步骤1所得透明质酸原液，倒入0.2g外泌体冻干粉中，搅拌至完全溶解，得到外泌体精华液，可通过微针导入或者直接涂抹于面部。
实施例6
步骤1、称取如下原料：外泌体提取液50份、甘露醇8份、聚乙二醇0.5份、海藻糖1份和超纯水50份，混合并搅拌均匀，得到混合液；
步骤2、将步骤1所得混合液置于冻干机中预冻，温度为-45℃，冷冻时间为3h，继续加强预冻，温度为-45℃，冷冻时间为2h，然后预抽真空，温度为-45℃，时间为1h，真空度为15Pa，得到冷冻混合料；
步骤3、将步骤2所得冷冻混合料继续进行升华干燥，首先降温至-12℃，真空度为15Pa，保温8h，继续升温至-3℃，真空度降至5Pa，保温3h，然后继续升温至0℃，真空度降至0.1Pa，保温2h，最后进行解析干燥，即升温至30℃，真空度升至20Pa，保温6h，即得到外泌体冻干粉。
将上述外泌体冻干粉的制备方法步骤3所得外泌体冻干粉制备成外泌体精华：
步骤1、制备透明质酸原液：
称取0.15份透明质酸钠、0.05份水解透明质酸钠和99.7份超纯水，在85℃下充分搅拌溶解，冷却至25℃，灌装成6mL/支，在121℃下高压蒸汽灭菌5min，冷却，得到透明质酸原液；
步骤2、称取6mL步骤1所得透明质酸原液，倒入0.2g外泌体冻干粉中，搅拌至完全溶解，得到外泌体精华液，可通过微针导入或者直接涂抹于面部。
实施例7
步骤1、称取如下原料：外泌体提取液50份、山梨醇2份、甘露醇8份、乳糖1份、海藻糖1份和超纯水45份，混合并搅拌均匀，得到混合液；
步骤2、将步骤1所得混合液置于冻干机中预冻，温度为-45℃，冷冻时间为3h，继续加强预冻，温度为-45℃，冷冻时间为2h，然后预抽真空，温度为-45℃，时间为1h，真空度为15Pa，得到冷冻混合料；
步骤3、将步骤2所得冷冻混合料继续进行升华干燥，首先降温至-12℃，真空度为15Pa，保温8h，继续升温至-3℃，真空度降至5Pa，保温3h，然后继续升温至0℃，真空度降至0.1Pa，保温2h，最后进行解析干燥，即升温至30℃，真空度升至20Pa，保温6h，即得到外泌体冻干粉。
将上述外泌体冻干粉的制备方法步骤3所得外泌体冻干粉制备成外泌体精华：
步骤1、制备透明质酸原液：
称取0.15份透明质酸钠、0.05份水解透明质酸钠和99.7份超纯水，在85℃下充分搅拌溶解，冷却至25℃，灌装成6mL/支，在121℃下高压蒸汽灭菌5min，冷却，得到透明质酸原液；
步骤2、称取6mL步骤1所得透明质酸原液，倒入0.2g外泌体冻干粉中，搅拌至完全溶解，得到外泌体精华液，可通过微针导入或者直接涂抹于面部。
外泌体精华液使用效果实验：
上述实施例1得到的外泌体精华液进行使用测试，使用方法：选取年龄为23~43岁的志愿者30名，将外泌体精华液每天早晚涂抹于面部，连续使用15天。
结果：志愿者经过15d的外泌体精华液涂抹，痘痘少了，痘印淡化了，皮肤更加光滑细腻、更加白嫩，眼周细纹、干纹明显减少，面部皮肤更加饱满、白皙、水润。
综上，本发明外泌体冻干粉的制备方法，将保护剂与外泌体提取液混合后依次经过预冻、加强预冻、预抽真空、升华干燥和解析干燥处理，所得外泌体冻干粉蛋白活性可以保持 90％以上，可冷藏或是室温保存1~2年，整个生产周期仅需要 15~25小时，极大改善保存条件的要求同时便于运输；外泌体冻干粉的应用，在促血管形成、促进细胞新生及免疫调节方面有重要作用；将外泌体冻干粉应用在美容行业，有效与皮肤细胞发生作用，促进上皮细胞的营养代谢，减少皮肤受到紫外线、自由基等侵害，减少黑色素的生成，促使真皮层胶原细胞的增生，具有抚平细纹，延缓皮肤老化、美白肌肤的效果。
Claims (10)
1.一种外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，将外泌体提取液、保护剂、添加剂和超纯水混合，搅拌均匀，得到混合液，将混合液依次经过预冻、加强预冻、预抽真空、升华干燥和解析干燥处理，得到外泌体冻干粉。
2.根据权利要求1所述的外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，所述混合液由以下重量份数的组分制成：外泌体提取液40~50份、保护剂8~10 份、添加剂0~2份和超纯水38~52份。
3.根据权利要求1或2所述的外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，所述保护剂为多元醇；所述添加剂为聚合物、糖中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，所述多元醇为山梨醇、甘露醇中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，所述聚合物为右旋糖苷、聚乙二醇中的至少一种；所述糖为乳糖、海藻糖中的至少一种。
6.根据权利要求1~5任一项所述的外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，所述预冻的温度为-40~-50℃，冷冻时间为2~3h。
7.根据权利要求1~5任一项所述的外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，所述加强预冻的温度为-40~-50℃，冷冻时间为1~2h。
8.根据权利要求1~5任一项所述的外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，所述预抽真空温度为-40~-50℃，时间为0.5~1h，真空度为15Pa。
9.根据权利要求1~5任一项所述的外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，所述升华干燥包含三个阶段，其中，
第一阶段的温度为-15℃~-10℃，时间为 6~8h，真空度为15Pa；
第二阶段的温度为-5℃~0℃，时间为1~3h，真空度为5Pa；
第三阶段的温度为0℃~10℃，时间为1~2h，真空度为0.1Pa；
所述解析干燥的温度为30℃~40℃，时间为3~6h，真空度为20Pa。
10.根据权利要求1~9任一项所述的外泌体冻干粉的制备方法得到的外泌体冻干粉的应用，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1、制备透明质酸原液：
称取0.1~0.2份透明质酸钠、0.05~0.1份水解透明质酸钠和99.5~99.85份超纯水，在80℃~85℃下充分搅拌溶解，冷却至35℃以下，灌装，在121℃下高压蒸汽灭菌5min~20min，冷却，即得到透明质酸原液；
步骤2、称取20~30份步骤1所得透明质酸原液，倒入0.5~1份外泌体冻干粉中，摇晃至完全溶解，得到外泌体精华液，可通过微针导入或者直接涂抹于面部。
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