CN109196123B

CN109196123B - 用于水稻基因分型的snp分子标记组合及其应用

Info

Publication number: CN109196123B
Application number: CN201780006971.9A
Authority: CN
Inventors: 黎志康; 王冰冰; 王文生; 王佳; 徐建龙; 傅彬英; 高用明; 张帆; 许娜; 熊艳文
Original assignee: Huazhi Rice Bio Tech Co ltd; Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Huazhi Biotechnology Co., Ltd; Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-09-06
Filing date: 2017-09-06
Publication date: 2022-03-08
Anticipated expiration: 2037-09-06
Also published as: WO2019047074A1; CN109196123A

Abstract

本发明提供用于水稻基因分型的SNP分子标记组合，由56606个SNP标记组成，所述SNP标记的编号分别为SNP1～SNP56606，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1‑56606所示。利用本发明的SNP分子标记组合可以对水稻品种资源进行分子标记指纹分析、对杂交群体后代进行基因型鉴定、对品种真实性进行鉴定、对育种材料遗传背景进行分析和筛选、对农艺性状进行关联分析，具有广阔的应用前景。

Description

用于水稻基因分型的SNP分子标记组合及其应用

技术领域

本发明涉及基因组学、分子生物学、生物信息学和分子植物育种领域，具体地说，涉及用于水稻基因分型的SNP分子标记组合及其应用。

背景技术

分子标记技术(Molecular marker technologies)是分子育种中的重要工具。传统分子标记技术，如RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)和SSR(Simple Sequence Repeat，简单序列重复)技术曾在功能基因组研究中发挥着重要作用。但是，传统的分子标记技术存在许多局限性，如通量低、数量少、操作过程繁琐，不能满足大规模商业化育种的需求。为了对目标基因进行精确控制，对遗传背景进行有效选择，对育种品种进行准确分析和鉴定，需要开发和利用高通量分子标记技术。目前，高通量分子标记技术平台主要包括：第二代测序技术，基因芯片技术，以及单一SNP标记检测***，例如Taqman和KASP标记。

发明内容

本发明的目的是提供用于水稻基因分型的SNP分子标记组合及其应用。

本发明的另一目的是提供一种水稻全基因组育种芯片。

为了实现本发明目的，本发明提供用于水稻基因分型的SNP分子标记，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-56606任一所示，每条序列第36位碱基为SNP突变位点。

继而本发明提供用于水稻基因分型的SNP分子标记组合，所述SNP分子标记组合为上述SNP分子标记中的任意两个或多个组合。优选该组合由56606个SNP标记组成。

本发明利用二代DNA测序技术，对来自全球89个国家和地区的3024份水稻样本进行了全基因组重测序，得到17T的测序数据，最低测序深度为4×，达到10×的样本为2322份，平均测序深度为14×。以日本晴MSU7.0为参考序列，利用BWA软进行比对，平均覆盖度为94％，平均比对率为92.5％。使用GATK流程(图1)对3024份样品进行SNP检测，得到18.9M高质量的SNP及Indel，构建了3024份水稻的***发育树(图2)，将水稻分为17个group：Group1(421份)，Group2(454份)，Group3(250份)，Group4(331份)，Group5(310份)，Group6(221份)，Group7(223份)，Group8(145份)，Group9(266份)，Group10(171份)，Group11(101份)，Group_Africa_cultivation(5份)，Group_aro_G10_Ind(30份)，Group_aro_G10_Jap(36份)，Group_aus_aro(46份)，Group_near7(7份)，Group_near8(7份)。基于3K水稻500份典型材料的SNP多态性位点筛选(水稻功能基因组育种数据库(RFGB)：3K水稻SNP与InDel子数据库)，并选择了有代表性的192个水稻品种对高质量SNP位点做进一步筛选，从中挑选出56606个核心SNP位点，对192份水稻材料进行聚类分析的结果表明，仅用这56606个SNP位点的基因型信息足以区分出上述192份水稻种质资源。

本发明还提供所述SNP分子标记组合在制备水稻全基因组育种芯片中的应用。

本发明还提供水稻全基因组育种芯片(水稻56K芯片)，包含56606个SNP位点，其具有SEQ ID NO：1-56606所示的核苷酸序列。

本发明还提供所述SNP分子标记/组合或所述水稻56K芯片在水稻品种鉴定中的应用。

本发明还提供所述SNP分子标记/组合或所述水稻56K芯片在检测水稻育种材料中的应用。

本发明还提供所述SNP分子标记/组合或所述水稻56K芯片在水稻全基因组关联分析中的应用。

本发明还提供所述SNP分子标记/组合或所述水稻56K芯片在水稻分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供所述SNP分子标记/组合或所述水稻56K芯片在水稻种质资源基因指纹分析中的应用。

本发明还提供所述SNP分子标记/组合或所述水稻56K芯片在水稻杂交后代基因型鉴定中的应用。

与其他分子标记检测***相比，本发明具有以下优点和效果：

(一)与传统分子标记如SSR标记相比，具有通量高、单个标记数据成本低等优势。

(二)基因分型数据准确可靠，遗传稳定性和重复性好。

(三)容易实现自动化检测，减少人力成本。

(四)可以满足多次基因分型数据结果的整合。

附图说明

图1为本发明水稻56K芯片的筛选基本流程图。

图2为本发明192个测试样品的籼粳类型。

图3为本发明192个测试样品的地理来源分布图。

图4为本发明水稻56K芯片的分布和来源。

图5为本发明SNP位点在染色体上的分布(10Kb区间内SNP探针的数目)。

图6为本发明SNP位点在12条染色体上的数目分布。

图7为本发明SNP功效注释(采用snpeff工具)。

图8为本发明192个测试样品的聚类分析图；其中，A：用通过QC的1100K SNP进行聚类分析；B：用筛选出的53K SNP进行聚类分析。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 用于水稻基因分型的SNP分子标记组合的开发

一、3024份水稻种质资源的重测序和SNP位点的获得

1、3024份水稻种质资源的文库构建和测序：

将24个随机样本的DNA序列分别加上6个bp的接头序列，并且混合在一起构建混合index文库，接头序列用来区分每个样本的DNA序列。构建好的文库在HiSeq2000机器上进行PE90测序，每个文库至少测6个lane，以确保每个样本可以得到足够的数据。然后根据接头序列拆分数据，每个样本可以拆分后的read读长是83bp(83＝90-6-1，1是连接碱基“T”)。最后去掉被接头污染的reads和低质量的reads(碱基质量值≤5)，得到高质量的cleanreads.

2、比对和SNP/Indel检测

2.1使用BWA软件将clean reads比对到日本晴(IRGSP-1.0)基因组上得到sam文件，比对参数为“aln -m 10000 -o 1 -e 10 -t 4”，其他默认。使用samtools将每个样本的sam文件合并，加上index得到bam文件。使用Picard软件对bam文件进行排序，去除没有比对上的reads，同时标记重复的reads。使用GATK软件包的IndelRealigner命令进行重比对，BaseRecalibrator进行碱基质量值校准。

2.2使用GATK软件包的UnifiedGenotyper命令检测每个样本的基因型和Indel，使用参数为：-stand_call_conf 50.0，-stand_emit_conf 10.0，-dcov 50；使用如下参数对数据进行过滤：Mapping_quality＞20，Variant quality＞50，Read supported for everybase＞2。

2.3使用GATK软件包的UnifiedGenotyper命令检测群体SNP和Indel，使用参数为：-stand_call_conf 50.0，-stand_emit_conf 30.0，-dcov 50；进一步使用Mapping_quality＞20，Depth＞2和MAF＞0.001对群体SNP数据进行过滤，最后得到18.9M高质量的SNP及Indel。

利用二代DNA测序技术对来自全球89个国家和地区的3024份水稻样本进行了全基因组重测序，得到17T的测序数据，最低测序深度为4×，达到10×的样本为2322份，平均测序深度14×。以日本晴MSU7.0为参考序列，BWA软进行比对，平均覆盖度为94％，平均比对率92.5％。使用GATK流程对3024份样品进行SNP检测，得到18.9M SNP位点，构建了3024份水稻的***发育树，将水稻分为17个group：Group1(421份)，Group2(454份)，Group3(250份)，Group4(331份)，Group5(310份)，Group6(221份)，Group7(223份)，Group8(145份)，Group9(266份)，Group10(171份)，Group11(101份)，Group_Africa_cultivation(5份)，Group_aro_G10_Ind(30份)，Group_aro_G10_Jap(36份)，Group_aus_aro(46份)，Group_near7(7份)，Group_near8(7份)。

二、SNP位点的初步筛选

基于3K水稻500份典型材料的SNP多态性位点筛选(水稻功能基因组育种数据库(RFGB)：3K水稻SNP与InDel子数据库)，设计的标准与条件如下：

1、基于3K水稻的遗传背景和进化树信息，挑选500份典型材料来代表水稻群体的多态性。

2、以粳稻品种Nipponbare为参考序列，根据每个个体的VCF文件，计算每个位点的allele frequency，低质量位点和缺失位点。对于SNP位点，要求Variant quality＞＝50，mapping quality＞＝20；2＜＝read depth＜＝200；genotype quality＞＝20；对于genotype位点，要求reference allele quality＞＝30；mapping quality＞＝20。

3、以籼稻品种9311为参考序列，按照步骤2中的条件，同样计算每个位点的allelefrequency，低质量位点和缺失位点。

4、基于步骤2的统计结果，把低质量位点和缺失位点都归为missing data，选择missing data＜0.2，MAF＞0.05的多态性位点作为粳稻的多态性位点，共获得粳稻SNP多态性位点2910585个。

5、基于步骤3的统计结果，把低质量位点和缺失位点都归为missing data，选择missing data＜0.2，MAF＞0.05的多态性位点作为籼稻的多态性位点。提取籼稻多态性位点上下游250bp(共501bp＝250+1+250)序列比对到Nipponbare基因组上，挑选unpmap的位点作为籼稻特有的(uniq)SNP多态性位点，共获得这样的位点4107个。

6、提取SNP位点上下游35bp的侧翼序列用来设计芯片的探针，SNP位点保留Major和minor碱基型。

共获得高质量的2.9MSNP多态性位点信息，以粳稻的遗传背景为主，同时加入了籼稻特有的多态性位点。

三、Affymetrix基因分型芯片的筛选

Affymetrix基于芯片的基因分型产品为从全基因组分析到常规筛查的各种应用提供了完整的解决方案，且准确性和重复性最高，流程简单，成本最低。

Affymetrix公司的GeneTitan基因芯片的用途和独特优势主要体现在：

在SNP领域(单核苷酸多态性)分析领域，GeneTitan平台可以方便地定制不同种子的基因SNP分型芯片，数目从1500 SNP/样品，到67万SNP/样品均可以灵活定制，适合不同的研究领域。例如500 SNP/样品的规格适合种子的筛选，转基因的鉴定等应用；5,000 SNP/样品的规格适合分子育种以及优良性状的鉴定；50,000 SNP/样品的规格适合基因的定位和性状位点的确认；500,000 SNP/样品到67万SNP/样品适合特点位点的定位以及新型性状相关基因的发现。综上所述，各种规格的基因芯片有不同的应用领域、终端客户和市场，而Affymetrix公司的GeneTitan平台都可按照上述规格要求进行芯片的定制。并且Affymetrix采用的是光刻技术，即使用激光光栅确保每张同类芯片的所有位点的均一性，避免批间差造成芯片数据丢失，这在基因芯片平台方面是独一无二的。

水稻56K芯片的筛选基本流程如下：

根据前期从3K SNP中筛选获得的2.9MSNP位点，经过初步的筛选，获得2.5M的SNP位点用于前期的screening，选择有代表性的192个水稻品种对这2.5M的位点进行筛选，以获得高质量的SNP位点(图1)。

Screening芯片的作用：①找出最高质量的SNP位点；②筛除测序得来的假阳性和单态性的位点；③估算SNP位点的MAF/LD值等，找出更高遗传力的位点，使最终设计的芯片性价比更高；④前期只需192个样本做扫描，后期可以在同样的成本下做更多样本；⑤更快地得到结果，节约时间和成本。

四、Screening所用192个水稻样品的基本信息

在芯片screening过程中选择了有代表性的192个水稻品种，其中籼稻类型的133个，粳稻类型的47个，Aus/boro类型的5个，Basmati和中间类型各3个(图2)。从地理分布来看：192份材料来自于全球33个国家，主要以来源于中国的品种为主，来自于东南亚国家的品种次之，同时兼顾美洲、非洲、欧洲和大洋洲(图3)。来自于中国的品种中包括大面积推广品种、杂交稻亲本、分子育种亲本和微核心种质等。

五、192个水稻样品的Screening结果

Axiom_Rice3K55定制项目共包含4种不同的设计，2,467,017个探针组，通过affy检测的探针组有1,142,678个(46.3％)，其中811为9311特异参考基因组来源SNP位点，其它均为日本晴作为参考基因组的SNP位点(表1)。

表1 Affy四张芯片上探针数量及通过质量控制情况

Affy 3K2MAX芯片的4种不同的设计共包含约2500K SNP位点，其中192个样品最终共有178个样品在所有4种设计中都通过了QC检测(表2)。

表2 Affy四张芯片上192个样品通过质量控制情况

六、水稻56K芯片的最终筛选和SNP位点的确定

Affy 3K2MAX芯片的4种不同的设计共包含约2500K SNP位点，约1100K SNP位点通过affymetrix SNP质量控制。目标是从这4张芯片中所有的推荐SNP检测探针中筛选满足条件的56K探针。

1、筛选标准

1)已验证或公开的SNP位点

①华智实验室验证过的SNP位点

②其它公开数据/芯片中的SNP位点

③已克隆水稻基因(图位克隆、正向遗传学、反向遗传学等手段)的SNP位点

④来源于水稻9311的SNP位点

2)其它通过质量控制的SNP位点

①创建打分***，对所有通过质量控制的SNP进行综合评分：

a)碱基突变类型

b)PIC值(位点信息含量)

c)SNP注释信息

②LD block分析，去除冗余SNP

③加入其它SNP，使整体SNP位点在基因组均匀分布

2、详细筛选过程

1)已验证或公开的SNP位点

①华智实验室验证的SNP标记(3.1K)

a)2021通过affy质量测试

b)1085未被测试或未通过测试，加到最终芯片设计中。

②其它公开数据/芯片中的SNP位点

a)公开SNP数据集1∶3000个位点中2161通过affy测试

b)公开SNP数据集2∶6000个位点中3506通过affy测试

c)公开SNP数据集3∶9000个位点中6251通过affy测试

以上数据合并后，共计获得10790个已验证或公开的SNP位点，这些位点都将入选芯片设计最终方案。

2)其它通过质量控制的SNP位点

对于其它通过质量控制的SNP位点，我们创建了一个打分***，对所有通过质量控制的SNP进行综合评分：

①碱基突变类型

a)A/G；A/C；T/G；T/C之间的突变(权重20)；

b)A/T；G/C突变(权重0)，因为A/T，C/G使用相同的荧光信号，所以affy探针杂交如果要区分A/T；G/C之间的突变必须要放置2个探针组，因此其权重不同。

②PIC值(多态性信息含量，权重40)。

虽然检测样品192份，但4种芯片质检都通过的样品只有179个，最终根据这179个样品计算SNP的PIC值。该值类似于稀有等位基因频率MAF。

③SNP注释信息--SNP注释根据SNP所处的基因组位置给予权重：

基因间区(2)

内含子(3)

启动子(15)

5`-UTR(15)

3`-UTR(15)

如果SNP位于基因外显子区：

同义突变(4)

非同义突变(10)

无义突变(20)。

3、重要农艺基因SNP位点

我们筛选了近60个重要农艺性状基因，在其上下游2k与基因区选择得分最高20个SNP，不够20的则全部选择。按照该标准最终入选SNP位点940个(表3)。

表3重要农艺性状基因SNP探针数量

4、已克隆的功能基因SNP位点

我们收集了通过图位克隆、正向遗传学和反向遗传学等手段克隆发表的基因约2372个。从每个基因(包括上下游2k)的SNP位点中选择得分最高的2个SNP位点，总计获得4729个SNP位点。

5、来源于9311的SNP位点

这些位点存在于最初的设计中，总计811个SNP通过质量控制，全部入选。

6、LD block区间内标签SNP筛选

1)为去除冗余SNP，我们用178份检测材料分型结果对通过质量检测的SNP探针进行了LD block计算，共获得1,012,772个与其相邻SNP存在LD的SNP位点。如果LD block区间小于10kb，我们将在其内部选择得分最高的SNP作为标签SNP；如果LD block大于10k，将在其内部每10kb选择一个得分最高的SNP作为这个区间的标签SNP。按照这种方法，总共选择了43005个位于LD block中的SNP位点。

2)通过分析每10Kb区间内SNP分布，我们发现有2312个区间＞2个SNP。为了平衡芯片位点总量、基因组平均分布、LD block区间信息。我们将在2312个区间内每5kb选择一个得分高的SNP位点作为代表。所以最终获得LD区间内36510个SNP位点。

7、基因组均匀分布SNP筛选

为确保SNP芯片设计在水稻全基因组范围内均匀分布，从128,620个未划入任何LDblock的SNP位点进行了补缺筛选。通过将染色体分成10k的区间，如果该区域内不含有任何1-5步筛选出的SNP，则在该区域内选择得分最高的一个非LD block的SNP位点。这样可以保证每10Kb区间将会有至少一个SNP入选(前提是1M SNP库在该区间有SNP的存在)。按照该标准共补缺选择1736个SNP位点。

七、水稻56K芯片设计结果

1、56K芯片SNP位点的来源分布

通过以上各种方法，我们总共筛选到55,312个SNP位点，各步骤所贡献的SNP位点及比例情况如图4所示。

2、56K芯片SNP位点的染色体分布

对筛选到的56K芯片在12条染色体上的分布进行了统计，发现56K的SNP位点均匀的分布在水稻12条染色体上，SNP位点在染色体上间距平均值为6.84K，中位值为5.3K，重要农艺基因位点附近设计的SNP位点数较多(图5)。

对筛选到的56K芯片在12条染色体上的数目进行了统计，发现56K的SNP位点在第一和第三染色体上的位点较多，分别为6833个和6082个；在第9、10和12染色体上的数目较少，分别为3148、3214和3329个(图6)。

3、56K芯片SNP位点在不同基因区域的分布见图4。采用snpeff工具对SNP进行功效注释，结果见图7。

4、筛选前后SNP位点聚类分析

用筛选前(1.1M)和筛选后(56K)的SNP位点对192个测试样品进行聚类分析，发现筛选前后得到的结果非常相似。选择K＝5，均可将测试样品分为5个亚群，2个粳稻(温带和热带)和3个籼稻群。表明筛选出的56K的SNP位点具有较高的代表性(图8)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

工业实用性

利用本发明的SNP分子标记组合可以对水稻品种资源进行分子标记指纹分析、对杂交群体后代进行基因型鉴定、对品种真实性进行鉴定、对育种材料遗传背景进行分析和筛选、对农艺性状进行关联分析，具有广阔的应用前景。

Claims

1.水稻全基因组育种芯片，其特征在于，包含检测56606个SNP位点的探针，其中56606个SNP具有SEQ ID NO:1-56606所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述芯片在水稻品种鉴定中的应用。