CN111455087B - 一种基于菜豆cacta转座子研发的新型分子标记、引物对、分子标记设计方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于菜豆CACTA转座子研发的新型分子标记、引物对、分子标记设计方法及应用，检索利用1645条CACTA序列随机设计得到11个能够在品种间产生清晰且具有多态性的分子标记pv_CACTA5、pv_CACTA7、pv_CACTA8、pv_CACTA10、pv_CACTA12、pv_CACTA18、pv_CACTA37、pv_CACTA40、pv_CACTA41、pv_CACTA46、pv_CACTA48。本发明的方法设计的基于菜豆CACTA转座子研发的新型分子标记具有理想分子标记的诸多优点：如多态性高、基因组中广泛随机分布、重复性好、技术要求较低和开发成本低等，可以加快推动菜豆分子育种的进程。

Description

一种基于菜豆CACTA转座子研发的新型分子标记、引物对、分 子标记设计方法及应用

技术领域

本发明属于分子生物学和生物信息学领域，具体涉及一种基于菜豆CACTA转座子研发的新型分子标记、引物对、分子标记设计方法及应用。

背景技术

菜豆(Phaseolus vulgaris)属于豆科菜豆属，是世界上种植面积最大的食用豆类，它们最早于8000年前在秘鲁和墨西哥栽培，形成了安第斯和中美洲两个基因库，我国菜豆于15世纪从美洲直接引入，但具体的基因库来源没有详细记载，现在主要分布在黑龙江、云南、贵州、山西等省区种植。我国的菜豆种植资源类型丰富，形态标记固然表现直观测定简单，但不足以完全满足对菜豆种类的鉴定、育种等研究。

分子标记技术是继形态学标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的，它是以DNA序列多态性为基础的遗传变异，能在DNA分子水平上检测生物间的差异，是生物遗传多样性的直观反映。分子标记技术的发展极大的助力了分子辅助育种、基因克隆、基因定位和植物遗传连锁图谱建立等技术的推进。

第一代分子标记技术是以Southern杂交为核心，常见的有限制性片段长度多态性RFLP、可变数目串联重复位点VNTR和染色体原位杂交CISH共3种。其中RFLP最具有代表性，该技术重复性好、稳定、标记数量多等优点，但DNA含量要求高，技术繁杂，同时有放射性危害的缺点。二代分子标记技术的基础是PCR扩增和电泳技术，分为基于PCR技术和基于PCR技术与限制性酶切相结合的分子标记技术。前者包含随机引物PCR标记和特异引物PCR标记，后者包括酶切扩增多态性序列CAPS和扩增片断的长度多态性AFLP。相对于第一代技术，第二代技术更先进，需要的DNA量更少，多态性更高，但是费用也相对较高。第三代分子标记技术是基于高通量测序和DNA芯片的技术，主要包含了DNA条形码技术、单链构象多态性SSCP和单核苷酸多态性SNPs。由于SNPs是建立在基因芯片和基因组大量测序的基础上的，因此，其研究成本和研究技术要求更高。另外，还有一些其他新型的分子标记例如以基于目的基因的如保守DNA衍生多态性CDDP；以mRNA为基础的ESTs表达序列标签分子标记技术；基于反转录转座子的反转录转座子位点间扩增多态性IRAP，基于DNA转座子的MITE位点间多态性IMP，及转座子显示TD等。

转座子(Transposon)又被称为跳跃因子，是基因组上可以从一个位置跳跃到另一个位置的DNA序列，广泛的存在于基因组中。由于转座子在宿主基因组中复制、移动，从而在基因组中产生了转座子***的多态性。这些***对基因组和基因产生巨大的影响，对物种、品种、亚种、品系的形成具有重要的意义。根据转座方式的不同，转座子可以分为以RNA为介导的逆转座子，和以DNA为媒介的DNA转座子。CACTA类转座子分布十分广泛，是基因组中DNA含量较高的DNA转座子，在一些禾本科基因组中甚至占到了10％。虽然菜豆基因组学研究开发了大量的数量性状变异的QTL，但是难以进行精细定位，进而难以开展有效的分子标记辅助选择。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种基于菜豆CACTA转座子研发的新型分子标记、引物对、分子标记设计方法及应用，具有理想分子标记的诸多优点：如多态性高、基因组中广泛随机分布、重复性好、技术要求较低和开发成本低等，可以加快推动菜豆分子育种的进程。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于菜豆CACTA转座子研发的新型分子标记，所述分子标记是编号为：pv_CACTA5、pv_CACTA7、pv_CACTA8、pv_CACTA10、pv_CACTA12、pv_CACTA18、pv_CACTA37、pv_CACTA40、pv_CACTA41、pv_CACTA46、pv_CACTA48的分子标记；

其核苷酸序列分别为：

pv_CACTA5如SEQ ID NO：1所示；

pv_CACTA7如SEQ ID NO：2所示；

pv_CACTA8如SEQ ID NO：3所示；

pv_CACTA10如SEQ ID NO：4所示；

pv_CACTA12如SEQ ID NO：5所示；

pv_CACTA18如SEQ ID NO：6所示；

pv_CACTA37如SEQ ID NO：7所示；

pv_CACTA40如SEQ ID NO：8所示；

pv_CACTA41如SEQ ID NO：9所示；

pv_CACTA46如SEQ ID NO：10所示；

pv_CACTA48如SEQ ID NO：11所示。

一种基于菜豆CACTA转座子研发的新型分子标记的扩增引物对，所述扩增引物对的序列如下：

pv_CACTA5F:ACGGTTCTTAATTGACCGCCA

pv_CACTA5R:AAGCATGGGGTTAGTGTACTG；

pv_CACTA7F:TCCACTTGGAACCGCCTTTA

pv_CACTA7R:TAACCACACGAAGCCACGTT；

pv_CACTA8F:TACACGCTTAAAACCGCCAC

pv_CACTA8R:GCAAACATGATCAGTGGCTCG；

pv_CACTA10F:ACTTATGGCAGAACGGACCAA

pv_CACTA10R:GGCACCCCGAGACAAATTCA；

pv_CACTA12F:GGCTGAAAATGGTGGTCGC

pv_CACTA12R:ATACTTCGCCTGAGCGAGATG；

pv_CACTA18F:CTTCGTGGGTTCTTGTGGGT

pv_CACTA18R:AGGAATGGAATGGAGGGCAC；

pv_CACTA37F:TATAACGAAGGTTCCAGAGGGA

pv_CACTA37R:ATTTTGAGTGGTGGTGTCCCA；

pv_CACTA40F:GCCATTGCTAAGGTCATGCT

pv_CACTA40R:ATCACAGAGGTGATCGTCGTG；

pv_CACTA41F:CGTCTGCTACAACGGTTCTCA

pv_CACTA41R:ACTGCGTCATCTCAGCCTTC；

pv_CACTA46F:CATTGAGCCTATGCCGGAGA

pv_CACTA46R:CATGCAGGCAAGTCCATCAAA；

pv_CACTA48F:TTAAAGTGACGGGTGTTGCG

pv_CACTA48R:ACGACCAACACCACATAGTC。

一种基于菜豆CACTA转座子研发的新型分子标记的设计方法，包括以下步骤：

步骤1)随机选取一条菜豆CACTA转座子3’端500bp核苷酸序列和3’端侧翼500bp基因组序列的组合作为参考序列，每一条参考序列获得一个***位点；

步骤2)根据步骤1)所获得的位点序列信息设计检测引物，作为待验证分子标记引物，其中使正向引物位于CACTA转座子3’端序列，使反向引物位于3’端侧翼基因组序列中；

步骤3)利用步骤2)所得到的待验证分子标记引物PCR扩增不同的菜豆品种，选取能清晰扩出条带、具有多态性能区分品种的引物组合，从而获得分子标记。

优选地，步骤3)所述PCR扩增的反应体系为：2.5μL的10×PCR buffer，2μL的2.5×10^-3mol/dNTP mixture，0.125μL的5U/μL Taq polymerase，上下游引物各1μL，1μL的DNA模板，添加ddH₂O到25μL；

步骤3)所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，72℃终延伸3min，12℃保存。

一种基于菜豆CACTA转座子研发的新型分子标记在菜豆品种鉴定上的应用。

本发明的有益效果如下：

本发明主要是通过获取CACTA转座子***位点序列，设计各位点检测引物，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳等步骤获得CACTA转座子***情况，据此建立基于转座子***多态性检测方法，为菜豆的品种鉴定提供有用的分子标记。本发明的方法设计的基于菜豆CACTA转座子研发的新型分子标记具有理想分子标记的诸多优点：如多态性高、基因组中广泛随机分布、重复性好、技术要求较低和开发成本低等，可以加快推动菜豆分子育种的进程。

附图说明

图1为标记引物pv_CACTA5在24个不同菜豆品种中的扩增结果；

图2为标记引物pv_CACTA48在24个不同菜豆品种中的扩增结果；

图中：M为Marker是生兴生物的DL2000；1为红花白荚基因组；2为德蔬地豆王基因组；3为龙泉九粒白基因组；4为超级九粒白基因组；5为地豆王二号基因组；6为宁兴(81-6)基因组；7为中华一号基因组；8为浙青2号基因组；9为丽芸2号基因组；10为青芸直尚基因组；11为龙丰一号四季豆基因组；12为浓绿江户川青刀豆基因组；13为勾勾黄架豆基因组；14为雪莲架豆基因组；15为鞍纹大芸豆基因组；16为农家红芸基因组；17为翠芸十号基因组；18为奶花芸豆基因组；19为红宝石芸豆基因组；20为1901-本地四季豆基因组；21为1903-四季豆基因组；22为1904-邵店四季豆基因组；23为1905-叶海黑粒四季豆基因组；24为1906-仪征四季豆基因组。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明做进一步详细说明。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案，还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

实施例1

一种基于菜豆CACTA转座子研发的新型分子标记的设计方法，具体如下：

一、参考基因组中CACTA转座子***位点序列获取

以菜豆CACTA转座子为查询序列，随机选取50个***位点，从每个***位点的3’端侧翼延伸500bp，之后一起截取CACTA转座子元件3’端500bp和3’端侧翼500bp，获得设计引物的参考序列。

二、引物设计

根据所获得的参考序列，使用Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)设计引物，将正向引物设计在元件3’端，将反向引物设计在元件3’端侧翼的基因组序列中，其他要求为：扩增产物长度在100～800bp，引物长度18～24bp，GC含量40～60％，尽量避免引物二聚体(dimer)、发夹结构(hairp-in)、错配(false primer)等。利用1645条CACTA序列随机设计CACTA引物50对，分别编号pv-CACTA1～50，将设计好的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

三、分子标记在24个不同菜豆品种中的验证

1、基因组准备

使用翼飞雪生物科技公司提供的植物基因组DNA快速提取试剂盒提取24份不同菜豆品种的DNA，包括红花白荚、德蔬地豆王、龙泉九粒白、超级九粒白、地豆王二号、宁兴(81-6)、中华一号、浙青2号、丽芸2号、青芸直尚、龙丰一号四季豆、浓绿江户川青刀豆、勾勾黄架豆、雪莲架豆、鞍纹大芸豆、农家红芸、翠芸十号、奶花芸豆、红宝石芸豆、1901-本地四季豆、1903-四季豆、1904-邵店四季豆、1905-叶海黑粒四季豆、1906-仪征四季豆。植物基因组DNA快速提取试剂盒方法提取植物DNA操作步骤如下：

(1)平衡吸附柱

把YFX Mini Column(简称吸附柱)套入YFX Collection Tube(2mL，简称收集管)中，加入300μL YBS(Column Balance Solution)，室温13000rpm离心1min，弃去收集管中的滤液，重新将吸附柱套入收集管中。

(2)样品处理

用电子天平称取100mg的菜豆的叶片，置于2mL的灭菌离心管中，并加入两粒钢珠，液氮冷冻后约2min后，放在研磨仪中按照70Hz研磨1min将样品破碎成粉末。从研磨仪取出离心管后，用移液枪加入1mL的YLS(Lysis Solution)，上下颠倒，用涡旋仪进行震荡混匀。13000rpm离心2min，弃沉淀，保留上清液。

(3)DNA吸附

将样品裂解液离心后的上清液转移到平衡后的吸附柱内，13000rpm室温离心30s，弃去收集管中的滤液，将吸附柱重新套入收集管中，因上柱的裂解液体积不能超过700μL，此步需要分批上柱离心。

(4)DNA漂洗

①加入700μL YWB(Wash Buffer)，室温13000rpm离心30s，弃去滤液，保留吸附柱。

②加入700μL YWS(Wash Solution)，室温13000rpm离心30s，弃去滤液，保留吸附柱。

③加入700μL 70％乙醇,室温12000rpm离心1min。

④弃去收集管中的滤液，将吸附柱重新套回收集管中，室温13000rpm离心2min。

(5)DNA洗脱

将吸附柱重新转入一个洁净的1.5mL离心管中，加入50μL YES(ElutionSolution)，放入65℃水浴锅中5min，13000rpm离心1min洗脱DNA。

(6)DNA质量及浓度检测

采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测DNA的纯度和浓度。取3μL DNA样品和2μLLoading buffer混匀，缓冲液1×TAE，1％的琼脂糖凝胶，电压120V，15min，用凝胶成像记录电泳条带的亮度、整齐度估计DNA提取效果。采用紫外吸光法检测DNA的纯度和浓度，置于-20℃冰箱保存备用。

2、PCR扩增

设计如下PCR反应体系：

(1)在灭菌PCR管中配置25μL反应体系，具体如下表1所示。

表1 PCR扩增反应体系

(2)将PCR管置于PCR仪中，进行如下表2所示的反应程序，循环次数为30。

表2 PCR扩增反应程序

3、琼脂糖凝胶检测

(1)制作1％的琼脂糖凝胶

称取1g琼脂糖放入三角烧瓶中，加入100mL 1×TAE溶液，微波炉加热煮沸3次，使琼脂糖完全融化，摇匀，即成1％琼脂糖凝胶液。

(2)制备胶板

将制胶槽清洗干净、晾干，放入制胶玻璃板，并在固定位置放好胶梳，待琼脂糖凝胶室温自然冷却到60℃左右，加入2μL绿如蓝核酸染料摇匀，小心倒入玻璃板上，使胶液慢慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层，检查有无气泡的形成，室温放置直至凝胶完全凝固，垂直拔出胶梳，将凝胶及玻璃板浸没加有1×TAE的电泳槽中。

(3)PCR产物电泳

加样完毕后立即电泳，150V恒压，15～20min，电泳结束后，将凝胶取出放到凝胶成像仪下观察并拍照保存。

四、结果分析

图1为标记引物pv_CACTA5在24个不同菜豆品种中的扩增结果，图2为标记引物pv_CACTA48在24个不同菜豆品种中的扩增结果。图1、2中：M为Marker是生兴生物的DL2000；从左到右1～24分别是红花白荚、德蔬地豆王、龙泉九粒白、超级九粒白、地豆王二号、宁兴(81-6)、中华一号、浙青2号、丽芸2号、青芸直尚、龙丰一号四季豆、浓绿江户川青刀豆、勾勾黄架豆、雪莲架豆、鞍纹大芸豆、农家红芸、翠芸十号、奶花芸豆、红宝石芸豆、1901-本地四季豆、1903-四季豆、1904-邵店四季豆、1905-叶海黑粒四季豆、1906-仪征四季豆的基因组。图1中A箭头所指表示此标记位置上有CACTA转座子的***，B箭头所指表示此标记位置上没有CACTA转座子的***，图1、2中其它部位的相同表示意义一致。

图1，图2所示基于CACTA***多态性的分子标记在不同品种间存在良好的多态性，可以为品种鉴定提供鉴定方法。

五、结论

对菜豆基因组所鉴定的CACTA转座子进行整理，挖掘位点信息，依据CACTA位点3’端序列和侧翼序列进行引物设计、合成与引物筛选。从鉴定的1645个CACTA位点所对应序列中随机选择50条，最终获得11个扩增条带清晰，多态性良好的CACTA标记，编号分别为pv_CACTA5、pv_CACTA7、pv_CACTA8、pv_CACTA10、pv_CACTA12、pv_CACTA18、pv_CACTA37、pv_CACTA40、pv_CACTA41、pv_CACTA46、pv_CACTA48。具体如下表3所示。

表3引物特性表

表3中：(+)代表正链，(-)代表负链。

经过两轮实验验证，获得表3所示的11个基于CACTA转座子***多态性的分子标记，能够在品种间产生清晰且具有多态性的检测结果，可以为品种鉴定提供鉴定方法。同时，该方法具有检测成本较低，重复性好，结果清晰，检测手段简单迅速，技术要求较低等优点。在植物生长的不同阶段、不同组织的DNA都可以应用这种方法来开发分子标记。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

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<160> 33

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<210> 1

<211> 1000

<212> DNA

<213> 菜豆(Phaseolus vulgaris)

<400> 1

atattatgaa acttaattgt gtattgaaat ttaattataa tatgaaatta aataataata 60

tgaaatttaa ttgtaatatg aaatttaatt ataatatgaa attaaattat aaaacataat 120

taaataaatt attataaata ttaaaaataa aattaaatat ttaatatttg aattatgaca 180

gtcataaagg ttatcataaa tgccatacta tattgtatta agtgacgttt ataactgcca 240

caatttacgt tggaattggt ttatcagttt gaaaattacg acatttataa ctaacgtaaa 300

ttacatgctt aaaaccgcca ctttatacaa tgcataatat ggcgtatgct acaacggttc 360

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cacagacgta taatgcggcg gttaaaaacg tcagttttta cgaaaataac cgccgcatta 480

tacacgtttt ttttgtagtg agtctctaat ttagttacta ttgcaactaa ttattttgga 540

ctctaaaaat tggtttttat ttcatgattt tcttatagtg tatctcggtt catacagtac 600

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<211> 1000

<212> DNA

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<400> 6

ttcctcttca acttcacaaa tatatgcata gatgttttcg tttttcttat atatgttttt 60

ttccttgcat tggtggtctc gaagcactgt ttcgttggtt gacattcatt tttcttacat 120

tgtttggttt cttgcattgc tcagtacact ttcattgtct tcgtgggttc ttgtgggttt 180

tttggtttgc tccattgctg cttccctgtc cgtcgtcgct tctgctgtcg ccaccgttgt 240

tggcgctccc gtgactcatc atcaacgttg ccttcacaca agattgacga tgttttaaaa 300

tttttaattt tttttaatga tttggcatat acaagtgcgg ctaaagcaaa tagccgcact 360

tgtaaatggt atttataaat gcggctatat agccgcattt atatttcttg atttacaagt 420

gcgtgttgat caaatgcggt tataaagccg catttataaa ttcgaaatag ccgcacttgt 480

tttatgtttc tgcaccagtg tattctcgac atgtgtcact tactgagcgg tttcatggtt 540

ttacattttt taaaacatca cgcccctctc tccttttctt ttctaccctt cactcatttt 600

gccttccaag tcactccttc ctatataaag ggtgtcttca tccacgtatt gtcacattga 660

attttgaata gtaaagaaac tctgtatgag tgattttgtg agacttgtga gctctcattt 720

ttaggtctta tcttgggtgg gtaacatctc aagtggcgac tctttgcacc actcatcttg 780

gagtcctctt ttctccaaga gtgacgtgac atctttcttt cttccataag ctctctttat 840

gtcttcctct ttttatcttt ctttgtgccc tccattccat tcctttttat actttcatgt 900

ttgtctctta aattgttggt tatctttgcc ttattctctt caattccgca ccattgcatc 960

attgtcacca tataattgtg tttttctctt tgctttctag 1000

<210> 7

<211> 1000

<212> DNA

<213> 菜豆(Phaseolus vulgaris)

<400> 7

tcggaagcat tgaagtatgt gagaacaaca tggtcaaatt aatttgtaac catgtataac 60

accttaggat agataaatca ttacaatgac atactttttc atatattagc aaaacttttt 120

gtataatgtt ataatttgtt gtatgtattt ttcatattta aattataatt ttaaatattt 180

taattttctg gaattggaaa ttttatgcag gtttatgatt ttttaaaaaa caattttttt 240

taaaaaaaaa acttagatat aacgaaggtt ccagagggaa ccgtctttaa aagtcattta 300

ttttttttaa aaaaaaacta attaacagcc atttataacg acaattgaag aaccgtcgtt 360

aaaaacacgc cttttaacaa cggtttaaga accatcgtta aaaatcacca ctttataaca 420

atgcccgcaa taacgacagt tcaggaaccg tctttatgtg ttatttttaa ccgtcgttaa 480

tttacctttt tgtactagtg tctgccaatt attttaacac atataattgg gacaccacca 540

ctcaaaatat tagaatacaa tcttactaaa attgcaatgc atgcaacatt ttgagttgcg 600

cttcctctat atccaacctt gcgctcatat agacaatccc tttccattga tcgcatgaac 660

acctaactac aactatccac atccctccct atccagatcc tattttctac cccattcaat 720

tgaagaatgc taaactatgt agaaaatgta gactaggttg acaatgttgc ataatgctca 780

cccctatcca aatcttagac gtgttccaaa ctttaacaaa aaatttatat gtaatggaaa 840

gatgattact cgcattactc cttccttcca tacataacac gtactatttt gaaaatggac 900

ttatgaagca caaatataga tatgatgcgg gcacagacac ggagatacca ctaaattgaa 960

aattatagaa cacaggatac aaatatatat atatatatat 1000

<210> 8

<211> 1000

<212> DNA

<213> 菜豆(Phaseolus vulgaris)

<400> 8

gcgtttctct tatgttttgt tttatgccat tgctaaggtc atgcttggga aggtttttgt 60

ttgcgctttc tgctgtgcct tcctcgtcgt tgttgccgcc ttgcttcgtc atatatttgc 120

gtttcattgg agaattttat ttgcgttttc tggacttcca ttgggatgaa taacgaagat 180

gtataatatg gatgcaccaa gagattaaaa gaaatgataa aataatgacc atgttcttcg 240

taaaagatca aagttgagaa cattgattag aaatccaatc aacaacgaaa aagaaaagaa 300

accctaaacg cctctcgtaa attcgattta taaatgcatc tatgtaaata gccgttttat 360

taatcgaatt tacgaatgcg gctatatata gtcgccttct tatctcttcc atttacaaat 420

gcgtgctcat caaatgcggt tatatagccg cccttataaa tgtaaaatag ccgcattcgt 480

tttgcttttt tgcaccagtg tgtgtagcga agaaagaaga gtaaagaaag tgcgtgtgag 540

acaaaatgag agtaaataat ataatattaa taaattatat aagtagattg acgaattaat 600

atgcaagtct catttcatcc ctgacatttg cattacgaat tatatgagtt gaattcatct 660

tatttatttt tattgtgtaa aagagaacca cgacgatcac ctctgtgatt ttgattcatc 720

catggtttgg ttgatgtagg gtttgcggtt gccaagaagc agttgaaaaa tgtgcttgaa 780

caatactaga attcaacaaa cgatgtttgt caaaacgttc ctcttgagca agcagaagag 840

cctcaatgtc atcaacccta tatggatcga cgcgagaggt gacgaaagta atgaaactgt 900

catattcgtc aggtaagtcg tccagaatag cttcgatttg atcatcgatc gagattgaag 960

caccaacaac ggcaatggta tccacaattt tcttttaatc 1000

<210> 9

<211> 1000

<212> DNA

<213> 菜豆(Phaseolus vulgaris)

<400> 9

tatcaacttt gttctctcaa tgaatgaatg aagtcatctt ttgattatta tattatgaag 60

tataattata ttatgaaatt agtttatgtt ataatttaat tatattatga aaatatgaaa 120

ttaaataata ttatgaaatc aaattataaa atataattaa ataaattatt ataaatatta 180

aaaataaaat taaatattta atattcgaat tacgatatta agtggcggtt aaaactgcca 240

ctatttacgt tagaattgat ttacccagtt ttaaaattac gacatttata actgacgcta 300

attacacgct taaaactgcc actttatacc atgcataata tggcgtctgc tacaacggtt 360

ctcaattgac cgccacatta aactttgtgg cggcaagaat tctggcggta cgcggtaccg 420

ccagagacgt ataatgcggc ggttaaaaac gtcaactttt gcgaaaataa ccgccgtatt 480

atacacgttt ttttgtagtg aaacctttaa ttaaattgtt tttgttaatt attttttaaa 540

tggatttaat tatattgaat atatacaaat tttatattag gatcgaggag aacttaactt 600

ggtatcccac ggtaggaaat tagtaaattt gggatgcttc atgttgatat tgagcttctt 660

gtacaaaatt ctggattgtt tagtttgtgc aatataagtt atgaggtaag ggacaagggg 720

ctgatttcag cctttgtcga aaggtagcat ggggagacga actccttcca ccttcccgta 780

agtgagatga ccatcacact tgatgatgtg tcatctcttt tacacctccc tattttgggt 840

caatttctac atatgtgccc ttagagtaca acggagttgc gacaatttta gctgatttac 900

taggggtgga ggaggctcgt gggaaggctg agatgacgca gtgtcgaggc gcccacgtac 960

aattgagtta gctccaagat atatacgagg gatgttccgc 1000

<210> 10

<211> 1000

<212> DNA

<213> 菜豆(Phaseolus vulgaris)

<400> 10

cttatttgct attttttctc cttagatata atagatataa gtgtggctta attgtgattc 60

cttgttagga ctgtcgtcgg tggccattga gcctatgccg gagagtagtg tgtttatggt 120

ggaagagaga agttaggagg atccttagag atggtggaaa acggggttga aggttatttt 180

agacgacaag tcattttacg gacattttga aactcatggt atttaatgga ggttcttaac 240

ccatggtatt ttacggaggt tcttaaccca tggtatttta cggaggtttt taaacccatg 300

atattttacg aaggttctta aacccatggt atttaacaga ggctctgaaa ttttcctaag 360

gtttaggaaa atcctaagga acacattccc cagggatggt ttagggagaa aactgtaacc 420

ctgggtaaat gacttaatag aggttttaac cctggataat gtaaaaataa gcccctttaa 480

aaccattttt tcttgtagtg atatcgttga tatttttggg tgattgctga tgaatttgga 540

tgaacatgtt taaagagtta gtgggataag agtaactcca ggcaactatt tttggtcttt 600

tataatctag gtttgttaat tctaatgtgc tattatagat atttagtttg atggacttgc 660

ctgcatgtat tggcacatat ctctcttgtg tttttcagct tatggatctt ttagtgccgc 720

aaaaatgttt actgaaaaat tactttcctg gtattaacaa gttctccatg ggttttattg 780

tttttaattt attgttatgg tttttaattt tttttttcat ggaaacttat ctcgttgcct 840

ctgattgtca ttgataacaa tgttatgtct atgctctatt catttatctt gtgatcctag 900

atgcttgcta tttatgatgt tctaaaggac tgaaccaata acaataaata tttcagttat 960

gatttgttta tttgctttca cgttttactt aaggtattat 1000

<210> 11

<211> 1000

<212> DNA

<213> 菜豆(Phaseolus vulgaris)

<400> 11

ataaactttt tgaacattat tatgtgtgct ttaattttca atgaaatgaa tggatggtta 60

taactttata cattatttta tttaattatg aaaaaatggt ggttaaattt tataattgta 120

taaaattata aaaaagtggt ggttaaatta taattgtata aaacagatta caaaaagggg 180

ttaaatttta tttattcagt attaaaatta cgtcagttaa aaacgccact acttacgtat 240

attatggtgt tagaattttt ttcaatcatt gtaaattgcg acagttataa ctgacactac 300

ttacatatga aaaccgtcac tatttacact atgtttaaag tgacgggtgt tgcgacgggt 360

aacataaaac cgccacatta aactttgtgg cggccagttc tatggcggtt tgggaaaccg 420

ccaaaaatgt atattatggc ggttataaac gccactttat acggaaaaaa ccgtcacaat 480

atacactttt ttttgtagtg ttttaaagta attagttcac ccttatgtgt gtgcatgtaa 540

aattttctat catcatacta tacaaaagca tatgatgttg taggtagtaa tgaatgagct 600

acctagagat agtcagatat tttaattttt tttgttctag actttatggt gtataattgt 660

atatcgtttt gggaactttg tgttcaaatg gtttgatata aattattata tataggtgct 720

ttagtagata tatgctatag ttaaattaaa tgtaacatta atatatatat atatatatat 780

atatatatat atatatatat gaggtatatg caagctcaag aagagaggtg aatagagtac 840

aaaactaact tcttcttttt ttgtgagaac aatagactat gtggtgttgg tcgtttataa 900

ataagtataa cacagagaat tataaggttt ctcttcccca actatgcaat gactaatgat 960

agagaatatt gcaatataag ttttttttta agaatataga 1000

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acggttctta attgaccgcc a 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aagcatgggg ttagtgtact g 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tccacttgga accgccttta 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

taaccacacg aagccacgtt 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tacacgctta aaaccgccac 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcaaacatga tcagtggctc g 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

acttatggca gaacggacca a 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggcaccccga gacaaattca 20

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggctgaaaat ggtggtcgc 19

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atacttcgcc tgagcgagat g 21

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cttcgtgggt tcttgtgggt 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aggaatggaa tggagggcac 20

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tataacgaag gttccagagg ga 22

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

attttgagtg gtggtgtccc a 21

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gccattgcta aggtcatgct 20

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

atcacagagg tgatcgtcgt g 21

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cgtctgctac aacggttctc a 21

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

actgcgtcat ctcagccttc 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cattgagcct atgccggaga 20

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

catgcaggca agtccatcaa a 21

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ttaaagtgac gggtgttgcg 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

acgaccaaca ccacatagtc 20

Claims (3)

1.一种基于菜豆CACTA转座子研发的新型分子标记组合，其特征在于，所述分子标记组合是由编号为pv_CACTA5、pv_CACTA7、pv_CACTA8、pv_CACTA10、pv_CACTA12、pv_CACTA18、pv_CACTA37、pv_CACTA40、pv_CACTA41、pv_CACTA46和pv_CACTA48的分子标记组成；

各分子标记的核苷酸序列如下：

pv_CACTA5如SEQ ID NO：1所示；

pv_CACTA7如SEQ ID NO：2所示；

pv_CACTA8如SEQ ID NO：3所示；

pv_CACTA10如SEQ ID NO：4所示；

pv_CACTA12如SEQ ID NO：5所示；

pv_CACTA18如SEQ ID NO：6所示；

pv_CACTA37如SEQ ID NO：7所示；

pv_CACTA40如SEQ ID NO：8所示；

pv_CACTA41如SEQ ID NO：9所示；

pv_CACTA46如SEQ ID NO：10所示；

pv_CACTA48如SEQ ID NO：11所示。

2.权利要求1所述的一种基于菜豆CACTA转座子研发的新型分子标记组合的扩增检测引物对组合，其特征在于，所述扩增检测引物对组合的序列如下：

pv_CACTA5F:ACGGTTCTTAATTGACCGCCA

pv_CACTA5R:AAGCATGGGGTTAGTGTACTG；

pv_CACTA7F:TCCACTTGGAACCGCCTTTA

pv_CACTA7R:TAACCACACGAAGCCACGTT；

pv_CACTA8F:TACACGCTTAAAACCGCCAC

pv_CACTA8R:GCAAACATGATCAGTGGCTCG；

pv_CACTA10F:ACTTATGGCAGAACGGACCAA

pv_CACTA10R:GGCACCCCGAGACAAATTCA；

pv_CACTA12F:GGCTGAAAATGGTGGTCGC

pv_CACTA12R:ATACTTCGCCTGAGCGAGATG；

pv_CACTA18F:CTTCGTGGGTTCTTGTGGGT

pv_CACTA18R:AGGAATGGAATGGAGGGCAC；

pv_CACTA37F:TATAACGAAGGTTCCAGAGGGA

pv_CACTA37R:ATTTTGAGTGGTGGTGTCCCA；

pv_CACTA40F:GCCATTGCTAAGGTCATGCT

pv_CACTA40R:ATCACAGAGGTGATCGTCGTG；

pv_CACTA41F:CGTCTGCTACAACGGTTCTCA

pv_CACTA41R:ACTGCGTCATCTCAGCCTTC；

pv_CACTA46F:CATTGAGCCTATGCCGGAGA

pv_CACTA46R:CATGCAGGCAAGTCCATCAAA；

pv_CACTA48F:TTAAAGTGACGGGTGTTGCG

pv_CACTA48R:ACGACCAACACCACATAGTC。

3.权利要求1所述的一种基于菜豆CACTA转座子研发的新型分子标记组合在菜豆品种鉴定上的应用。

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