CN110894525A - 从江香猪IFN-λ1基因的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从江香猪IFN‑λ1基因的检测方法。本发明属于核酸检测领域，特别是一种快速检测目的基因的方法。提供一种从江香猪IFN‑λ1基因扩增方法，旨在为后续研究IFN‑λ1的抗病毒活性以及抗病毒类药物研发奠定工作基础。本发明采用淋巴细胞分离法分离淋巴细胞，并提取细胞总RNA，通过RT‑PCR扩增出目的基因，克隆、测序完成以后对IFN‑λ1基因进行相关遗传进化分析，以探寻IFN‑λ1基因与其他哺乳动物之间的相关性，为进一步研究IFN‑λ1基因的抗病毒活性提供依据。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测领域，特别是一种快速检测目的基因的方 法。
背景技术
λ干扰素(interferon-λ，IFN-λ)是2003年由Sheppard等发现的一 种新的III型干扰素，其家族成员包括IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3和 IFN-λ4。在细胞中，由于不同IFN-λ基因结构和转录调节因子的差异， IFN-λ1比其他三种IFN-λ的表达要早，因此，IFN-λ1在早期抑制病 毒增殖过程中起了重要作用。目前的研究发现，IFN-λ1在抗病毒方 面有良好的疗效，如Ilyushina,Natalia A等发现在连续传代的人肺上 皮细胞系(Calu-3)中，增加IFN-λ1的表达量会强烈抑制甲型H1N1 流感病毒的增殖；中国农业科学院哈尔滨兽医研究所发现猪源III型 干扰素IFN-λ1对猪流行性腹泻病毒有较强的抑制作用，因为其作用 于肠粘膜上皮细胞，抗病毒作用比之前的Ⅰ型干扰素更具靶向优势， 为进一步开发新的抗病毒药物提供了新思路。
从江香猪是贵州省地方小型猪种，因其基因高度纯合，并且和人 类的基因组高度相似，因此在医学领域有较高的研究价值。
发明内容
本发明的目的是：提供一种从江香猪IFN-λ1基因扩增方法，旨 在为后续研究IFN-λ1的抗病毒活性以及抗病毒类药物研发奠定工作 基础。
本发明是这样实现的：从江香猪IFN-λ1基因扩增方法，包括以 下步骤：(1)确定待测的目标，进行序列的下载比对，设计特异性引 物，并在上游下游引物的5’端加入酶切位点；(2)将设计的分子标 记引物加入到PCR扩增体系中，混合PCR反应体系，置于PCR仪上，经过一定的循环后，得到扩增反应产物；(3)将PCR反应产物通过琼 脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察结果；所述的引物为：PoIFN-F： 5'-CCAAGCTTATGGCTACAGCTTGGATCGTGGTGC-3'，下游引物 PoIFN-R： 5'-CCCTCGAGTCAGATGTGCAAGTCTCCACTGGTAACAC-3'，下划 线处为Xho I、Hind III酶切位点。
所述的PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s， 56℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min， 4℃保存。
所述的琼脂糖凝胶电泳检测是应用体积百分比为1.2％的琼脂糖 凝胶电泳进行检测；1.2％琼脂糖凝胶配制：称量1.2g琼脂糖，加100mL 1×TBE缓冲液，加热溶解于250mL锥形瓶中，加入10μL GoldViewⅠ 型核酸染色剂摇匀，冷却待用。
将得到从江香猪IFN-λ1基因进行克隆、测序以及相关遗传进化 分析。
还包括对基因的蛋白结构预测、同源性分析。
由于采用了以上技术方案，本发明采用淋巴细胞分离法分离淋巴 细胞，并提取细胞总RNA，通过RT-PCR扩增出目的基因，克隆、 测序完成以后对IFN-λ1基因进行相关遗传进化分析，以探寻IFN-λ1 基因与其他哺乳动物之间的相关性，为进一步研究IFN-λ1基因的抗病毒活性提供依据。本研究首次成功克隆了从江香猪IFN-λ1基因， 序列比对分析发现从江香猪与野猪IFN-λ1基因的相似性最高(为 100.0％)，而与拉布拉多白足鼠的相似性最低(72.7％)，这与IFN-λ1 基因***进化树结果相一致，表明亲缘关系越近，其相似性越高。IFN-λ1氨基酸序列分析表明所选的物种完全相同的氨基酸位点为 P74，而其他位点有不同程度变异，可能是由于物种差异造成的，这 些变异是否对IFN-λ1蛋白功能产生影响有待研究。在从江香猪 IFN-λ1二级结构预测中，肽链中的α螺旋和无规则卷曲占了90.05％， 构成了该蛋白质二级结构的主要原件，推测这两种空间构象是从江香 猪IFN-λ1肽链中构成配体-受体结合的活性部位；而从江香猪IFN-λ1 蛋白质三级结构中包含6个α螺旋，与人的IFN-λ1蛋白质三级结构 α螺旋数一致。
附图说明
图1为从江香猪淋巴细胞分离结果；
图2为总RNA片段扩增结果；
图3为IFN-λ1基因RT-PCR扩增结果；
图4为从江香猪IFN-λ1蛋白三级结构预测图；
图5为从江香猪IFN-λ1基因同源性分析；
图6为从江香猪IFN-λ1遗传进化分析。
具体实施方式
本发明的实施例：从江香猪IFN-λ1基因扩增方法
1、淋巴细胞分离
取EDTA抗凝管采集从江香猪前腔静脉血液10mL，按照淋巴细 胞分离液操作说明进行分离，具体步骤如下：
(1)取2支10mL离心管(灭菌)，取EDTA新鲜抗凝血3mL 与PBS液(灭菌)按1:1加入离心管，轻轻吹吸，使其充分混匀。另 取干净无菌的4支10mL离心管，先加入3mL分离液，再吸取上述 混合液3mL沿管壁小心加于分离液之上，设置离心机温度为22℃， 以1500r/min离心15min。
(2)离心结束后，可看到细胞在离心管中分为四层(第二层为 淋巴细胞层或单核细胞层，呈乳白色环状)，用1mL/2.5mL注射器 小心吸取第二层转入新的离心管。
(3)向步骤(2)中收集的淋巴细胞层的离心管中加入无菌PBS 液5mL，反复吹打使其充分混匀后，以1500r/min离心10min，温度 为22℃，离心后弃去上清液。
(4)以同样方法取3mL无菌PBS液重复洗涤2次，以1500r/min 离心10min，温度22℃，弃去上清。
(5)弃尽上清后将离心管移到细胞培养室操作，无菌条件下加 入6mL含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基和终浓度为100 μg/mL青链霉素、20μg/mL ConA悬浮细胞，置于37℃含5％CO2培养箱中培养48h，收集淋巴细胞培养物。
2、引物设计与合成
根据Gen Bank中登录的猪IFN-λ1基因序列(FJ455508)，利用 Primer Premier5.0软件设计从江香猪IFN-λ1基因CDS区的特异性引 物，上游引物PoIFN-F： 5'-CCAAGCTTATGGCTACAGCTTGGATCGTGGTGC-3'，下游引物 PoIFN-R:5'-CCCTCGAGTCAGATGTGCAAGTCTCCACTGGTAACA C-3'，下划线处为Xho I、Hind III，退火温度为56℃，预期扩增片段 大小为576bp。引物由昆明硕擎生物技术有限公司合成。
3、猪淋巴细胞总RNA的提取
(1)取培养48h的淋巴细胞培养瓶，倒出培养液，用无菌1×PBS 缓冲液清洗。
(2)向瓶中加入3mL的RNA iso plus裂解液，均匀的晃动培养 瓶，以确保裂解液能在瓶底的细胞表面均匀分布。
(3)将瓶内裂解液移至1.5mL离心管中，用移液枪反复吹打至 裂解液中沉淀不明显为止。
(4)在室温下(15～30℃)静置5min。
(5)向上述步骤2.3.1中含匀浆裂解液的离心管中加入氯仿200 μL，盖紧离心管盖，充分混合均匀，使其管内溶液呈明显的乳白色。 并在室温下静置5min。
(6)启用冷冻离心机中，设置条件在12000×g、4℃下离心15min， 小心取出离心管，可见此时的匀浆分为三层，其中无色上清层为实验 所需的RNA层。
(7)用移液枪吸取无色上清层转移至另一新的无菌干净1.5mL 离心管中。
(8)向离心管中加入1mL异丙醇，上下颠倒1.5mL离心管进 行充分混匀后，室温静置10min。
(9)设置条件在12000×g、4℃下离心10min，此时可见管底部 出现RNA沉淀。
(10)弃掉管中上清，勿触及沉淀，加入75％的乙醇1mL，轻 轻上下颠倒以洗涤离心管壁，在7500×g、4℃条件下离心5min，小 心弃掉上清，勿触及沉淀。
(11)在室温下静置5min干燥管内沉淀，向管内加入1mL的 RNA se free水溶解沉淀。
4、猪IFN-λ1基因的RT-PCR扩增
4.1cDNA链合成
取提取的淋巴细胞总RNA为模板，采用HiFiScript cDNA Synthesis试剂盒两步法RT-PCR合成cDNA第一条链，具体操作如下：
(1)将RNA模板、Primer mix、dNTP mix、DTT、RT Buffer、 HiFisript和RNA-Freewater溶解置于冰上，建立20μL反应体系(见 表1)。
表1反转录第一步反应体系
Table1 Reverse transcription reaction system
(2)预先调至70℃的恒温水浴锅，将其孵育10min后迅速冰浴 2min，瞬时离心，再继续向上述反应中加入以下试剂，建立20μL 反应体系(见表2)。
表2反转录第二步反应体系
Table2 Reverse transcription reaction system
将上述反应管置于50℃恒温水浴中孵育30min，80℃孵育5min， 反应结束后短暂离心，置于冰上冷却后，合成cDNA第一链，可直接 使用或-80℃保存备用。
4.2猪IFN-λ1基因的PCR扩增
以合成的cDNA为模板，设置PCR扩增的反应体系和反应参数 (见表3)，PCR扩增产物吸取10μL用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检 测。
表3猪IFN-λ1基因PCR扩增的反应体系和反应参数
Table3 PCR amplification of pig IFN-λ1 gene and its reactionparameters
4.3琼脂糖凝胶电泳
(1)1.2％琼脂糖凝胶配制：称量1.2g琼脂糖，加100mL 1×TBE 缓冲液，加热溶解于250mL锥形瓶中，加入10μL GoldViewⅠ型核 酸染色剂摇匀，冷却待用。
(2)将琼脂糖凝胶倒入胶槽，冷却凝固后将PCR扩增产物点入 加样空，倒上1×TBE缓冲液，以110V，80mA的条件电泳40min， 在凝胶成像***观察结果。
5、目的基因DNA纯化
(1)在紫外灯下把含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，吸 干凝胶表面的液体，装入1.5mL离心管中，并称量其重量，按 100mg＝100μL的重量作为一个凝胶体积。
(2)在上述离心管中加3倍凝胶体积的Buffer ED-A，充分混合 均匀后，置于75℃恒温水浴锅中进行加热，在每隔2min拿出上下混 合一次，使胶块完全熔化。
(3)再向离心管中加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B， 混合均匀。
(4)吸取步骤(3)中的液体转移到胶回收试剂盒内提供的DNA 制备管(置于2mL离心管)中，在离心机中12000×g离心1min。弃 去滤液。
(5)将制备管重新置回离心管，加入500μl Buffer W1，于离心 机中12000×g离心30s，弃去滤液。
(6)将制备管再置回离心管中，加入700μl Buffer W2，于离心 机中12000×g离心30s，弃去滤液。以同法再加700mLBuffer W2洗 涤，12000×g离心1min。
(7)再将制备管置回离心管中，空管以12000×g离心1min。
(8)将制备管置于新的1.5mL灭菌离心管中，在制备膜的中央 加25μL加热至65℃的去离子水，室温静置1min。12000×g离心1min 洗脱DNA。重复将1.5mL离心管中的去离子水吸取加入制备膜中， 室温静置1min。12000×g离心1min洗脱收集DNA。
6、猪IFN-λ1基因的克隆
6.1感受态细胞DH5α的制备(CaCl2法)
(1)菌种活化：从-80℃冰箱中取一管母液DH5α置于冰上溶解， 无菌条件下，用接种针划线接种于LB琼脂平板上，于37℃恒温培养 12h，活化菌种。
(2)菌种前培养：从LB琼脂平板上挑取单一菌落，接种于5mL 不含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜(12h)至细菌对 数生长期。
(3)菌种的准备：吸取500μL过夜的菌悬液加入到50mL不含 Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养3h，测OD600的值为0.5左 右为宜。
(4)感受态细胞的制备：将测得OD600值的菌悬液分装于10mL 离心管，冰浴30min，期间间断轻轻摇动。待冷却后，以3000r/min， 4℃条件下离心10min，弃去上清。
(5)向管内加入提前预冷的ddH2O，用移液枪轻轻吹吸混匀沉 淀。在水上静置10min后，以3000r/min，4℃离心10min，弃去上清。
(6)向管内加入提前预冷的0.1mol/L CaCl24mL，轻轻吹吸重 悬沉淀，在冰浴10min后在冷冻离心机上以3000r/min，4℃离心 10min，弃去上清。
(7)每10mL离心管中加入1mL含15％甘油CaCl2(0.1mol/L)， 重悬沉淀，在冰上以每管200μL分装于1.5mL离心管中，先放置于 -20℃冷冻，再转入-70℃长期保存。
6.2目的基因的连接
将目的基因的纯化产物与pMD-19T载体进行连接，建立连接体 系为10μL(见表4)，充分混合均匀，立即瞬时离心，在16℃恒温仪 中连接12h。
表4连接反应体系
Table 4Connection reaction system
6.3目的基因的转化
取出E.coil DH5α感受态细于冰浴中溶解，吸取50μL加入10μL 连接产物中轻轻混匀，冰浴30min后在42℃的恒温水浴中热激90s， 再迅速放回冰浴5min，并加入800μL不含Amp的液体LB培养基。 置于37℃恒温条件下200r/min振荡培养2h，以利于细菌抗性蛋白 的表达。取出振荡培养后的菌液，以6000r/min离心8min，用移液 枪吸取500μL上清弃掉，将菌液吹打混匀后吸取100μL涂布于含 Amp(100μg/mL)的LB固体平板上，在37℃的恒温培养箱中培养 12h，取出观察有无阳性菌落。
6.4质粒DNA的提取
无菌条件下，挑取单个的白色菌落接种于含有Amp的LB液体 培养基中，37℃振荡培养12h后，按照Axy质粒DNA提取试剂盒的 操作说明进行质粒提取。具体步骤如下：
(1)取2mL在LB液体培养基中培养12h的菌液，于离心机 12000×g离心1min，弃掉上清。
(2)加入250μL Buffer S1，均匀悬浮细菌沉淀(确认Buffer S1中已加RNaseA)。
(3)再加入250μl Buffer S 2，上下翻转6次，此过程要温和并 充分，混合菌液使菌体充***解，直至形溶液透亮(此步骤不宜超过 5min，避免剧烈摇晃导致DNA污染)。
(4)向菌液加入350μL Buffer S 3，温和地上下翻转菌液8次， 12000×g离心10min。
(5)转移上清液至制备管(置于2mL离心管)中，12000×g离 心1min，弃掉滤液。
(6)将制备管置回离心管中，加入500μL Buffer W 1，12000×g 离心1min，弃掉滤液。
(7)将制备管置回离心管中，加入700μL Buffer W 2，12000×g 离心1min，弃掉滤液；以同样的方法用700μl Buffer W2再洗涤一次， 弃掉滤液。
(8)将制备管置回2mL离心管中，12000×g离心1min。
(9)将制备管置于新的1.5mL离心管中，在制备膜的中央加70μl 加热至65℃的去离子水，室温静置1min，12000×g离心1min。重新 将1.5mL离心管中的液体吸取加入制备膜中央，室温静置1min， 12000×g离心1min。
6.5重组质粒双酶切鉴定
将提取的质粒溶液进行PCR和双酶切鉴定，PCR扩增的反应体 系和反应参数可参照2.4.2步骤进行，同时根据pMD-18T载体上的酶 切位点，筛选XhoⅠ、HindIII对质粒进行双酶切鉴定，建立酶切反应 体系20μL(见表6)，将酶切体系混合均匀后瞬时离心，置于37℃恒温水浴中孵育3h，之后将PCR产物和酶切产物用1.2％琼脂糖凝胶 电泳检测。并挑选5个阳性克隆质粒送上海Invitrogen公司测序。
表5BamHⅠ和HindIII双酶切反应体系
Table 5 BamH I and Hind III Double Enzyme Reaction Systems
7、从江香猪IFN-λ1的遗传进化分析
利用生物信息学软件ProtParam对从江香猪IFN-λ1基因编码的蛋 白质进行理化性质分析；利用SOPMA软件对蛋白质二级结构进行预 测分析；用swissmodel对蛋白质三级结构进行分析；从GenBank下 载已知各物种的IFN-λ1基因，用MegAlign软件进行核苷酸同源性分 析；用BioEdit7.0对氨基酸序列进行比对；经序列比对后用MEGA5.0 软件对IFN-λ1基因构建分子***进化树。
序列表
<110> 贵州大学
<120> 从江香猪IFN-λ1基因的检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 猪(Bos taurus)
<400> 1
ccaagcttat ggctacagct tggatcgtgg tgc 33
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 猪(Bos taurus)
<400> 2
ccctcgagtc agatgtgcaa gtctccactg gtaacac 37
Claims (4)
1.一种从江香猪IFN-λ1基因的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)确定待测的目标，进行序列的下载比对，设计特异性引物，并在上游下游引物的5’端加入酶切位点；(2)将设计的分子标记引物加入到PCR扩增体系中，混合PCR反应体系，置于PCR仪上，经过一定的循环后，得到扩增反应产物；(3)将PCR反应产物通过琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察结果；其中，所述的引物包括上游引物PoIFN-F：5'-CCAAGCTTATGGCTACAGCTTGGATCGTGGTGC-3'，下游引物PoIFN-R：5'-CCCTCGAGTCAGATGTGCAAGTCTCCACTGGTAACAC-3'，下划线处为XhoI、Hind III酶切位点。
2.根据权利要求1所述的从江香猪IFN-λ1基因的检测方法，其特征在于：所述的PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
3.根据权利要求1所述的从江香猪IFN-λ1基因的检测方法，其特征在于：所述的PCR扩增体系为：15μL的2xTaq PCR masterMix，2μL的PoIFN-F，2μL的PoIFN-R，5μL的cDNA模板，8μL的ddH2O，反应总体系30μL。
4.根据权利要求1所述的从江香猪IFN-λ1基因的检测方法，，其特征在于：所述的PCR仪为可进行温度循环控制的基因扩增仪。
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| CN103757041A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-04-30 | 广东省农业科学院动物卫生研究所 | 一种制备猪源干扰素-λ3的方法和应用 |
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