CN110894477A - 一种用于降解餐厨垃圾的复配菌剂、应用及餐厨垃圾降解方法 - Google Patents

一种用于降解餐厨垃圾的复配菌剂、应用及餐厨垃圾降解方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于降解餐厨垃圾的复配菌剂、应用及餐厨垃圾降解方法。所述复配菌剂包括一种解淀粉芽孢杆菌、一种黑曲霉和一种枯草芽孢杆菌，其中，解淀粉芽孢杆菌命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZJB18046，保藏号为CCTCC NO：M2019423；黑曲霉命名为黑曲霉(Aspergillus niger)ZJB18045，保藏号为CCTCC NO：M2019422。本发明将三种降解菌株进行复配，能够对餐厨垃圾中的淀粉、蛋白质、油脂等有效降解，三种降解菌株能相互协同作用，提高对餐厨垃圾中各主要成分的降解率，且发酵处理周期较短，一般24～48小时即可完成。

Description

一种用于降解餐厨垃圾的复配菌剂、应用及餐厨垃圾降解 方法
技术领域
本发明涉及餐厨垃圾处理技术领域，特别是涉及一种用于降解餐厨垃圾的复配菌剂、应用及餐厨垃圾降解方法。
背景技术
餐厨垃圾指的是食物在加工处理(包括烹煮)后所剩的部分或是消费食物的过程中产生的食物废料、餐饮剩余物、食品加工废料以及各类油水混合物，是城市生活垃圾的主要组成部分之一。餐厨垃圾成分复杂，含水率高，主要由油、水、果皮、蔬菜、米面、鱼、肉、骨头以及废餐具、塑料、纸巾等多种物质的混合物组成。从化学组成上分析，餐厨垃圾由淀粉、蛋白质、纤维素、脂类和无机盐等组成，极易腐烂发臭，传播细菌和病毒，大量堆积不仅影响市容市貌，还污染环境和危害人们的健康。近年来，我国餐厨垃圾产生量惊人，环境处理负担日益加重，全国三分之二的城市面临垃圾围城现状，亟需要建立一种高效、可控的餐厨垃圾减量化、无害化处理技术。填埋法处理量大，工艺简单，成本较低，但处理过程中垃圾渗滤液污染环境，并且占用土地资源；焚烧法减量化程度高，但餐厨垃圾含水率高，焚烧热值低，并且产生二噁英等有害气体，极易形成二次污染；传统的微生物堆肥技术发酵周期长、腐熟度低；厌氧发酵处理量小、处理效率低，且处理过程受环境温度影响较大，在高海拨地区因微生物活性问题应用受限。此外，对餐厨垃圾产生密度低、集中处理成本高的农村、乡镇等地区适用性较差。
微生物好氧堆肥原位减量技术近年来成为餐厨垃圾高效减量化处理的新方法。微生物好氧堆肥处理技术是在有氧条件下，利用好氧微生物对餐厨垃圾进行氧化、分解代谢，是一种传统好氧堆肥技术与外源微生物强化结合的定向减量处理的现代堆肥技术。例如专利CN109182179A中基于一株枯草芽孢杆菌制备成菌剂，以1公斤降解菌剂加入餐厨垃圾降解机中，加入0.4公斤剩余的饭菜进行降解处理，48小时内餐厨垃圾减重率达到93.2％；专利CN107435032A中由解淀粉芽孢杆菌HQY-01、蔬菜芽孢杆菌HQY-02、特基拉芽孢杆菌HQY-03制成菌剂以冻干粉、菌液、菌泥等不同形式加入到餐厨垃圾中，降解反应的时间为1～3天，垃圾减量率达90％以上；在专利CN103121859B中采用将餐厨垃圾进行油水分离，将固体物质加入2‰固体菌剂并通过控制通风搅拌堆肥15～20天，得到初级有机肥料。总体而言，目前报道的有关餐厨垃圾减量处理的专利更专注于总重量的减少，所提供的菌剂组分较为复杂，制备成本较高，且降解效率较为有限，处理周期较长。此外，考虑到餐厨垃圾含有高达70～90％的含水率，因此单一的减重率并不能直观说明餐厨垃圾内有机物的降解情况。
发明内容
本发明根据我国餐厨垃圾的组成成分特点，筛选获得了针对不同餐厨垃圾组分具有较高降解效率的菌种，并利用微生物在有机质降解过程中的协同作用，开发了一种适合于餐厨垃圾主要成分降解需求的复合菌剂，并在好氧堆肥基础上，通过控制降解温度及通风搅拌，显著提升了降解速度，并通过连续补料策略，有效降低了菌剂的投放量，提高了餐厨垃圾减量化程度。
一种用于降解餐厨垃圾的复配菌剂，包括一种解淀粉芽孢杆菌、一种黑曲霉和一种枯草芽孢杆菌，其中，解淀粉芽孢杆菌命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZJB18046，保藏号为CCTCC NO：M2019423；黑曲霉命名为黑曲霉(Aspergillus niger)ZJB18045，保藏号为CCTCC NO：M2019422。
保藏号为CCTCC NO：M2019423的解淀粉芽孢杆菌ZJB18046，于2019年6月4号保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心；保藏号为CCTCC NO：M2019422的黑曲霉ZJB18045，于2019年6月4号保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。枯草芽孢杆菌为常规的菌株即可，具体实验过程中使用的为2019年3月从中国典型培养物保藏中心购买所得，保藏号为CCTCC NO：M2017387。
优选的，以湿菌体重量计，解淀粉芽孢杆菌ZJB18046占比10％～80％，黑曲霉ZJB18045占比10％～80％，枯草芽孢杆菌占比10％～80％。更优选的，以湿菌体重量计，解淀粉芽孢杆菌ZJB18046占比33.33％～70％，黑曲霉ZJB18045占比10％～45％，枯草芽孢杆菌占比10％～33.33％。最优选的，以湿菌体重量计，解淀粉芽孢杆菌ZJB18046占比70％，黑曲霉ZJB18045占比10％，枯草芽孢杆菌占比20％。
优选的，所述的复配菌剂，还包括用于菌剂固定的秸秆粉、草炭粉和硅藻土。其中秸秆粉、草炭粉和硅藻土重量比为50∶30∶20。制备复配菌剂时，将上述三种细菌按比例与秸秆粉、草炭粉和硅藻土混合均匀，然后在40℃下烘干，备用。其中三种细菌湿菌体加入量可以是占总质量的15％。
本发明又提供了所述复配菌剂在餐厨垃圾降解中的应用。
本发明还提供了一种餐厨垃圾降解方法，使用所述的复配菌剂对餐厨垃圾进行发酵降解。
优选的，所述复配菌剂的加入量至少为餐厨垃圾重量的1％。
优选的，所述餐厨垃圾的含水量为50％～60％。
优选的，发酵降解在发酵仓中进行，调节温度至35～40℃通风搅拌12小时，之后控制温度在50～55℃继续通风搅拌12小时，完成一次降解；完成一次降解后，继续投入与第一次降解等量的餐厨垃圾进行再次降解，分批次重复进行，直到发酵仓满仓时结束发酵降解。搅拌时采用间歇式搅拌方法，比如可以搅拌15～30min，静止5～10min。分批次连续补料式发酵，匹配降解菌株的生长与产酶过程的耦合，有效实现单批次菌剂投料连续降解工艺(一次投料连续一个月运行)，减少了菌剂的投料成本。
本发明用于降解餐厨垃圾的复配菌剂是通过筛选获得了解淀粉芽孢杆菌ZJB18046和黑曲霉ZJB18045，以这两株菌株为基础，再加入枯草芽孢杆菌，将三种降解菌株进行复配所得，能够对餐厨垃圾中的淀粉、蛋白质、油脂等有效降解，三种降解菌株复配后，能够产生相互协同作用，提高对餐厨垃圾中各主要成分的降解率，并且发酵处理周期较短，一般24～48小时即可完成。
具体实施方式
实施例1
适合餐厨垃圾组分降解菌株的筛选与鉴定
(1)取各地采集的土样10g加入到已灭菌的带有小玻璃珠和100mL无菌水的锥形瓶中，30℃，200r/min震荡30min，在超净台中进行菌悬液梯度稀释，浓度梯度为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，吸取200μL各浓度的菌悬液接种于LB平板上，用封口膜将平板封口后倒置，放于37℃恒温培养箱中培养24h，在菌落数合适的平板上，挑选典型菌落，经过分离纯化后，分别接种至淀粉选择培养基、油脂选择培养基、蛋白质选择培养基、纤维素选择培养基中，并用已灭菌过的涂布棒涂布均匀，将培养皿用封口膜封口后倒置放于37℃恒温培养箱中培养24h后，通过观察透明圈的直径和菌落直径比，取菌圈较大的菌株，分别接种至LB液体培养基，培养24h后，取适量菌液用30％的甘油保藏于-80℃冰箱里；取部分菌液进行生理生化和分子生物学鉴定。其中所述淀粉选择培养基成分为：蛋白胨10.0g/L，可溶性淀粉2.0g/L，牛肉膏5.0g/L，NaCl 5.0g/L，琼脂20.0g/L，pH7.0～7.2。其中所述蛋白质选择培养基成分为：脱脂奶粉50g/L，可溶性淀粉10g/L，酵母膏5g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，琼脂20g/L，pH7.0～7.2。其中所述脂肪选择培养基成分：(NH4)2SO4 2g/L，K2HPO41g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，琼脂20g/L，pH自然，橄榄油乳化液12mL(成分及制备方式比如：橄榄油20g与聚乙烯醇(PVA)60g混合，转速10000r/min，5min)，加溴甲酚紫。其中纤维素选择培养基组分为K2HPO40.5g/L，MgSO4 0.25g/L，CMC-Na 1.88g/L，刚果红0.2g/L，琼脂16g/L，明胶2.0g/L，pH7.0。各培养基除蛋白质选择培养基外的灭菌条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌20分钟。蛋白质培养基灭菌条件：脱脂奶粉单独灭菌115℃20min，其余121℃灭菌20min。
用试剂盒提取菌株基因组DNA，以此为模板，进行PCR扩增，真菌通用引物：
ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，
细菌通用引物：
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'，
1492R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。
PCR程序：在95℃进行预变性5min；95℃40s，55℃30s，72℃2min，30个循环延伸；72℃10min。PCR产物测序后将获得的DNA序列输入GenBank，用Blast程序与数据库中的所有序列进行比对，选择合适的DNA序列建立***发育树，确定筛选获得菌株的种属。
(3)筛选获得34株菌株，将分离得到的单一菌落接种到PDA液体培养基中，于30℃摇床振荡培养48小时，发酵液4℃，8000r/min离心10min，取上清液测定淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶酶活。其中，淀粉酶活性测定采用DNS法，活力定义：1mL上清液每分钟水解淀粉生成1μg还原糖，即为1个酶活单位，以“U/mL”表示。蛋白酶活性测定用福林酚法，酶活定义：1mL上清液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量，即为1个酶活单位，以“U/mL”表示。脂肪酶活性测定用酸碱滴定法，酶活定义：1mL上清液每分钟水解油脂产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活力单位，以“U/mL”表示；纤维素酶活性测定用DNS法，1mL上清液每分钟水解纤维素生成1μg还原糖所需的酶量，即为1个酶活单位，以“U/mL”表示。其中反应温度为55℃，pH为7.0。根据各菌株淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶的活力及其对餐厨垃圾的总体减量率指标。筛选过程中，部分菌株酶活如表1所示。
表1
Figure BDA0002206192170000041
Figure BDA0002206192170000051
最终从34株菌株中筛选得到一株解淀粉芽孢杆菌、一株黑曲霉，分别进行命名并进行保藏，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZJB18046，保藏时间为2019年6月4号，保藏号为CCTCC NO：M2019423。黑曲霉(Aspergillusniger)ZJB18045，保藏时间为2019年6月4号，保藏号为CCTCC NO：M2019422；再加入一株枯草芽孢杆菌(2019年3月从中国典型培养物保藏中心购买所得，保藏号为CCTCC NO：M2017387)，酶活如表1所示。以下实施例使用的菌株为这三株降解菌株。
实施例2
餐厨垃圾高效降解微生物菌剂的制备与复配
餐厨垃圾模拟培养基：淀粉5g，酪蛋白5g，豆油6.5g，羧甲基纤维素1.0g，水80g，K2HPO4 0.2g，KCl 0.1g，MgSO4 0.05g，FeSO4·7H2O 0.01g。
其中
Figure BDA0002206192170000052
A为某一成分初始含量，B为某一成分剩余含量。
(1)用平板活化LB培养基将冻存的解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌甘油管平板划线，37℃培养12小时。将生长良好的菌落挑到2L摇瓶中含有700mL的LB发酵培养基中，200r/min，37℃培养12小时。24小时后将发酵培养基8000r/min离心10min，得到解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌菌泥。
(2)用平板活化PDA培养基将冻存的黑曲霉甘油管划线，28℃培养24小时，将生长良好的菌落挑到2L摇瓶中含有700mL的发酵培养基，200r/min，28℃培养48小时，发酵培养基配方：葡萄糖22g/L，玉米浆固体粉20g/L，pH6.5。48小时后将发酵培养基过滤得到黑曲霉菌丝体。
(3)在模拟餐厨垃圾培养基中以2％比例分别接种3株降解菌，于45℃培养，结果如表2所示。
表2
24h淀粉降解率 24h蛋白降解率 96h油脂降解率
解淀粉芽孢杆菌 82.25％ 75.81％ 40.85％
枯草芽孢杆菌 58.62％ 81.19％ 22.46％
黑曲霉 55.20％ 71.59％ 32.62％
其中24小时内淀粉降解率最高是解淀粉芽孢杆菌，降解率为82.25％，蛋白降解率最高为枯草芽孢杆菌，降解率为81.19％，油脂降解率最高为解淀粉芽孢杆菌，96h降解率为40.85％。
实施例3
混菌最适比例选择
(1)按一定比例混合3种菌，将湿菌体与秸秆粉、草炭粉和硅藻土混合，其中秸秆粉、草炭粉和硅藻土比例为50∶30∶20。将混合物置于40℃烘干，得到菌剂。其中菌体(以单菌培养后，去除培养基所得的湿菌体计算)占菌剂重量15％。
(2)将菌剂以1％投入量(质量比)接入模拟餐厨垃圾培养基，于45℃培养，结构如表3所示。
表3
Figure BDA0002206192170000061
由表3可知，其中解淀粉芽孢杆菌∶枯草芽孢杆菌∶黑曲霉以70∶10∶20比例复配时测得淀粉24小时降解88.9％，蛋白24小时降解率91.2％，油脂96h降解率57.3％。混合菌剂的处理相较于单菌对餐厨垃圾各成分降解具有显著的促进作用。因此选择以解淀粉芽孢杆菌∶枯草芽孢杆菌∶黑曲霉以70∶10∶20比例复配，将湿菌体与秸秆粉、草炭粉和硅藻土混合，其中秸秆粉、草炭粉和硅藻土比例为50∶30∶20，其中菌体占菌剂重量的15％，将混合物置于40℃烘干，得到微生物降解菌剂。
实施例4
菌剂投入量的选择
将得到的微生物降解菌剂以不同投入量投入餐厨垃圾模拟培养基中进行效果检测，结果如表4所示。
表4
菌剂投入量 24h淀粉降解率 24h蛋白降解率 96h油脂降解率
0.10％ 45.69％ 56.65％ 11.36％
0.50％ 65.69 82.69％ 41.99％
1％ 88.91％ 91.25％ 57.36％
5％ 90.35％ 90.65％ 59.69％
10％ 92.95％ 95.69％ 58.64％
根据成本选择1％投入量能够在投入较少的菌剂下获得良好的降解效果，再增加菌剂的投入比例，对餐厨垃圾中淀粉、蛋白和油脂的降解率提升比较有限。
实施例5
复合菌剂在餐厨垃圾降解中的应用
(1)将餐厨垃圾挑出骨头、塑料等难降解的固体垃圾，含水率为70％～75％收集5kg装入发酵仓内；
(2)然后加入300g微生物降解菌剂(实施例3中制备的菌剂，解淀粉芽孢杆菌∶枯草芽孢杆菌∶黑曲霉以70∶10∶20比例复配)混匀，调节温度至55℃继续通风搅拌12小时，完成一次发酵，称取剩余物质重量1.5kg。
其中步骤(1)到步骤(3)中餐厨垃圾组分降解前后成分变化结果如表5所示。
表5
Figure BDA0002206192170000071
Figure BDA0002206192170000081
其中步骤(3)中减重率75.11％。
其中步骤(3)中测定剩余样品中活菌数达到6.3×106cfu/g。
其中步骤(3)中淀粉降解率51.59％，蛋白质降解率61.45％，油脂降解率8.74％。
实施例6
工艺含水率控制
(1)将餐厨垃圾挑出骨头、塑料等难降解的固体垃圾，然后收集5kg装入发酵仓内；
(2)使用锯末调节发酵仓内餐厨垃圾的含水量，使其比例为20％～70％；
(3)然后加入300g微生物降解菌剂(实施例3中制备的菌剂，解淀粉芽孢杆菌∶枯草芽孢杆菌∶黑曲霉以70∶10∶20比例复配)混匀，调节温度至55℃继续通风搅拌12小时，完成一次发酵，称取剩余物质重量。结果如表6所示。
表6
Figure BDA0002206192170000082
从表6可以看出，餐厨垃圾含水率过高和过低均不利于处理，当含水率达到50％～60％时，效果较好。
实施例7
工艺温度变化策略
(1)将餐厨垃圾挑出骨头、塑料等难降解的固体垃圾，然后收集5kg装入发酵仓内；
(2)使用1.54kg锯末调节发酵仓内餐厨垃圾含水量为55％；
(3)然后加入300g微生物降解菌剂(实施例3中制备的菌剂，解淀粉芽孢杆菌∶枯草芽孢杆菌∶黑曲霉以70∶10∶20比例复配)混匀，调节不同温度分别为35℃反应24h、55℃反应24h、35℃搅拌反应12小时，之后控制温度在50℃继续通风搅拌12小时、40℃搅拌反应12小时，之后控制温度在55℃继续通风搅拌12小时，完成一次发酵，测定剩余物质。结果如表7所示。
表7
Figure BDA0002206192170000091
由表7可以看出，在设备温度较低时如35℃，菌能够生长，但减重率较低，温度较高如55℃，减重率高，但菌较难生长，实际组分降解率低，因此选择前期以较低温度，后期较高温度实现菌体生长与餐厨垃圾组分降解的协同。
实施例8
工艺连续补料策略
(1)将餐厨垃圾挑出骨头、塑料等难降解的固体垃圾，然后收集5kg装入发酵仓内；
(2)使用1.54kg锯末调节发酵仓内餐厨垃圾含水量为55％；
(3)然后加入300g微生物降解菌剂(实施例3中制备的菌剂，解淀粉芽孢杆菌∶枯草芽孢杆菌∶黑曲霉以70∶10∶20比例复配)混匀，调节温度至40℃，搅拌反应12小时，之后控制温度在52℃继续通风搅拌12小时，完成一次发酵；
(4)24小时后继续投入5kg餐厨垃圾，控制相同反应条件，之后间隔24小时添加餐厨垃圾，25d后发酵仓接近溢出，剩余18.5kg残留物。从发酵仓取出降解后的餐厨垃圾，加入餐厨垃圾继续反应；
其中步骤(4)中平均每天减重率86.43％；接近溢出时测定的样品中活菌数达到9.0×108cfu/g；淀粉平均降解率81.5％，蛋白质平均降解率83.4％，油脂平均降解率55.74％。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种用于降解餐厨垃圾的复配菌剂、应用及餐厨垃圾降解方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agagtttgat cctggctca 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaggaggtga tccagccgca 20

Claims (10)

1.一种用于降解餐厨垃圾的复配菌剂，其特征在于，包括一种解淀粉芽孢杆菌、一种黑曲霉和一种枯草芽孢杆菌，其中，解淀粉芽孢杆菌命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZJB18046，保藏号为CCTCC NO：M2019423；黑曲霉命名为黑曲霉(Aspergillus niger)ZJB18045，保藏号为CCTCC NO：M2019422。
2.如权利要求1所述的复配菌剂，其特征在于，以湿菌体重量计，解淀粉芽孢杆菌ZJB18046占比10％～80％，黑曲霉ZJB18045占比10％～80％，枯草芽孢杆菌占比10％～80％。
3.如权利要求1所述的复配菌剂，其特征在于，以湿菌体重量计，解淀粉芽孢杆菌ZJB18046占比33.33％～70％，黑曲霉ZJB18045占比10％～45％，枯草芽孢杆菌占比10％～33.33％。
4.如权利要求1所述的复配菌剂，其特征在于，以湿菌体重量计，解淀粉芽孢杆菌ZJB18046占比70％，黑曲霉ZJB18045占比10％，枯草芽孢杆菌占比20％。
5.如权利要求1所述的复配菌剂，其特征在于，还包括用于菌剂固定的秸秆粉、草炭粉和硅藻土。
6.如权利要求1～5任一所述复配菌剂在餐厨垃圾降级中的应用。
7.一种餐厨垃圾降解方法，其特征在于，使用如权利要求1～6任一所述的复配菌剂对餐厨垃圾进行发酵降解。
8.如权利要求7所述的餐厨垃圾降解方法，其特征在于，所述复配菌剂的加入量至少为餐厨垃圾重量的1％。
9.如权利要求7所述的餐厨垃圾降解方法，其特征在于，所述餐厨垃圾的含水量为50％～60％。
10.如权利要求7所述的餐厨垃圾降解方法，其特征在于，发酵降解在发酵仓中进行，调节温度至35℃～40℃通风搅拌12小时，之后控制温度在50℃～55℃继续通风搅拌12小时，完成一次降解；完成一次降解后，继续投入与第一次降解等量的餐厨垃圾进行再次降解，分批次重复进行，直到发酵仓满仓时结束发酵降解。
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