CN110819637B - 一种海州香薷copt基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种海州香薷COPT基因及其应用，本发明首次在海州香薷(Elsholtzia splendens)中鉴定到一种Cu转运蛋白EsCOPT5并克隆了编码该分子的基因，通过构建表达载体并转化酵母，酵母互补实验表型证明了EsCOPT5基因增加细胞质中的Cu含量，增强细胞的缺Cu抗性，为抗铜植物分子育种提供了重要的基因资源。

Description

一种海州香薷COPT基因及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种海州香薷COPT基因及其应用。
背景技术
Cu是有机体正常发育不可缺少的微量元素之一，在生理条件下，Cu以还原态的Cu+和氧化态的Cu2+两种形式存在。通过在两种状态之间相互转变，使得Cu在多种植物蛋白中起氧化还原活性辅因子的作用，影响质体蓝素蛋白、细胞色素c、Cu/Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、漆酶以及乙烯受体ETR1(ethylene responsive 1)等的生物学活性，参与植物体内光合作用、呼吸作用、活性氧的消除、细胞壁合成及激素信号转导等多种重要的生物学过程。
COPT蛋白属于Cu转运蛋白Ctr(copper transporter)家族，在哺乳动物和酵母(Saccharomyces cerevisiae)中也有其成员。生物化学、遗传学和拓扑结构学研究表明，该家族蛋白包含3个保守的跨膜结构域(TMs)。这些结构与Cu离子的结合和转运有关；其N端具有富含Met的基序，且游离在细胞外间隙，能够与胞外Cu离子结合，介导Cu离子跨膜运输；C端具有富含半胱氨酸(Cys)的基序(CXC基序)，存在于细胞质内，能够与胞内Cu离子结合，并将Cu离子传递给胞内的Cu伴侣蛋白，在Cu过量的情况下能阻断Cu的转运。
通过序列比对及酵母Cu吸收缺陷突变体的功能互补实验，已在多种植物中发现COPT家族成员。例如，拟南芥中共有6个成员，COPT1–6；水稻(Oryza sativa)中有7个，OsCOPT1–7；小麦(Triticum aestivum)中有1个，TaCT1；绿藻(Chlamydomonasreinhardtii)中发现了4个，分别为CrCTR1、CrCTR2、CrCTR3和CrCOPT1；玉米(Zea mays)中有3个，ZmCOPT1–3。其中，对模式植物拟南芥中的COPT研究最多，其功能也最为清楚。
海州香薷(Elsholtzia splendens)属唇形科，多年生草本，高30～40cm，茎直立，通常呈棕红色，生于山野，分布于辽宁、山东、河北等地，素有“铜草”之称，有它的地方就有铜矿。作为铜矿地区的指示物以及吸附改善铜污染土壤优势植物之一的海州香薷，对铜、锌、铅复合污染土壤有较强的耐性，生物量较大，生长速度快，能够在严重重金属污染土壤中完成包括营养生长和生殖生长在内的整个生命史。对于海州香薷中COPT蛋白的功能缺乏相关研究，COPT基因的挖掘和蛋白功能的揭示对海州香薷耐受铜的机理的研究以及抗铜植物的分子育种具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种海州香薷COPT基因。
本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种海州香薷COPT基因的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：其特征在于：该海州香薷COPT基因为EsCOPT5，所述EsCOPT5的核苷酸序列如SEQ NO.1所示：
ATGATGCACATGACGTTTTACTGGGGCAGAAGCGTTACGATTCTCTTCGATTCATGGAAAACCGATTCATGGCTCAGCTACTTCCTCTCTCTCTTCGCCGTCTTCCTCTTCTCCGTCTTCTACCAGTACATGGAGGACCGCCGCCTCCGATTGAAGCTCCTCAAGCCCTCTCCGCCGCCGGAATCCTCCGCTCAGACCCCTCTCCTCTTCCACAAGCTGCGCGCCCGCAAGTGGGCCCCCCACCAGCTCGCTGGGGCGATCTTGTTCGGGGTCAACTCGGCGATCGGCTATTTCTTGATGCTCGCCGTGATGTCGTTCAACGCCGGCGTGTTCGTCGCGGTGGTGGTGGGGCTCGCCGTCGGCTACTTACTCTTCCGCGGCGACGACGAGGAGGTGGGGCTCGTTGATAATCCTTGCGCCTGCGCTTGA
所述EsCOPT5的氨基酸序列如SEQ NO.2所示：
MMHMTFYWGRSVTILFDSWKTDSWLSYFLSLFAVFLFSVFYQYMEDRRLRLKLLKPSPPPESSAQTPLLFHKLRARKWAPHQLAGAILFGVNSAIGYFLMLAVMSFNAGVFVAVVVGLAVGYLLFRGDDEEVGLVDNPCACA
所述EsCOPT5基因的表达载体选用pAG413GAL-ccdB。
来自海州香薷的Cu转运蛋白EsCOPT5可应用于海州香薷耐受铜机理的相关研究。
来自海州香薷的Cu转运蛋白EsCOPT5可应用于植物抗铜基因工程领域。
本发明首次在海州香薷(Elsholtzia splendens)中鉴定到一种Cu转运蛋白EsCOPT5并克隆了编码该分子的基因，通过构建表达载体并转化酵母，酵母互补实验表型证明了EsCOPT5基因增加细胞质中的Cu含量，增强细胞的缺Cu抗性，为抗铜植物分子育种提供了重要的基因资源。
附图说明
图1为EsCOPT5基因的PCR产物验证电泳图。
图2为表达载体pAG413-EsCOPT5转化酵母的阳性克隆照片。
图3为EsCOPT5转基因酵母的表型对比照片。
对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。
具体实施方式
为了更好地描述本发明，下面通过实施例予以进一步说明，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1海州香薷总RNA提取
操作步骤参照Tiangen的RNA simple总RNA提取试剂盒：
(1)将新鲜海州香薷材料在液氮中磨碎，每50-100mg组织加1mL裂解液RZ，用涡旋仪迅速涡旋混匀；
(2)将匀浆样品在室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；
(3)4℃12000rpm离心5min，取上清，转入一个新的无Rnase的离心管中；
(4)加入200μL氯仿，盖好管盖(防止液体渗漏出)，剧烈振荡15sec，室温放置3min；
(5)4℃12000rpm离心10min，样品会分成三层，RNA主要在水相中，将上层的水相转移到新的离心管中；
(6)缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，将混匀后得到的溶液转入吸附柱中，4℃12000rpm，离心1min，弃掉收集管中的废液；
(7)向吸附柱中加入500μL去蛋白液RD(预先加入无水乙醇)，4℃12000rpm离心1min，弃掉废液，将吸附柱放回收集管中；
(8)向吸附柱中加入500μL漂洗液RW(预先加入无水乙醇)，室温静置2min后，4℃12000rpm离心1min，弃废液。重复该步骤；
(9)将吸附柱放回收集管中，4℃12000rpm离心2min，去除残余液体；
(10)将吸附柱转入新的1.5mL离心管中，在超净工作台中通风片刻以充分晾干；
(11)向吸附柱中加入40μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min后，4℃12000rpm离心2min。将收集的RNA保存在-80℃冰箱。
实施例2 cDNA第一链的合成
从上述实施例提取的海州香薷RNA中，取1μL样品电泳检测RNA的质量，另外取1μL检测RNA的浓度。cDNA的合成所用试剂为EasyScript First-Strand cDNA SynthesisSuperMix，反应体系如下：1μLAnchored Oligo(dT)(0.5μg/μL)；2μg RNA；10μL 2xESReaction Buffer；1μL EasyScript RT/RI Enzyme Mix；Rnase-free H2O补至20μL。在冰上配好反应体系后，按以下条件进行反转录反应：42℃，60min；85℃，60min；-20℃保存得到的cDNA。
实施例3 EsCOPT5基因的克隆
克隆基因片段时，以反转录的cDNA为模板，分别用下列引物进行PCR扩增。
EsCOPT5-F:5’-GCC TCTAGAATGATGCACATGACGTTTTACT-3’；
EsCOPT5-R:5’-TATGGTACCAGCGCAGGCGCAAGGATTATC-3’；
扩增片段使用的酶为PrimerSTAR HS DNAPloymerase(Takara公司)，PCR反应体系和程序如下：10μL 5xPS Buffer；4μL dNTP(2.5mM each)；1μL PrimerSTAR HS DNAPloymerase(2.5U/μL)；1.5μLForward Primer(10μM)；1.5μLReverse Primer(10μM)；2μLcDNA；30μL ddH2O；Total 50μL。PCR扩增程序：94℃1min；94℃10sec；55℃30sec；72℃60sec；72℃10min；其中，第二步到第四步重复30个循环。接着用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。如图1所示，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，切下含有目的条带的胶块，进行DNA片段回收。回收步骤参考北京索莱宝科技有限公司凝胶回收试剂盒的说明书。
实施例4 DNA片段与载体的连接反应
pAG413GAL-ccdB载体用XbaI和XhoI酶(Takara公司)进行酶切之后回收，将扩增得到的目的片与酶切后的质粒混到一起以重组的方法构建得到最终载体。SeamlessAssembly Cloning Kit试剂盒购于中美泰和生物技术(北京)有限公司。重组反应体系为：1.5μL DNA片段；1μL线性化载体；2.5μL Seamless Master Mix(2x)；Total 5μL。加入后混匀，50℃孵育15分钟，置于冰上2分钟，准备转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
实施例5大肠杆菌转化和鉴定
(1)从-80℃超低温冰箱中取出含DH5α感受态细胞的离心管，置于冰上自然融化；
(2)将连接产物全加入到感受态细胞中，轻轻混匀后，在冰里放置30min；
(3)将离心管放到42℃金属浴，热激90sec；
(4)快速将离心管转移到冰里，放置2min；
(5)每管中加约1mL不含抗生素的LB液体培养基，盖好管盖后放在37℃摇床上，180rpm复苏1h；
(6)复苏后的菌液8000rpm离心约1min，去掉上清留约100μL液体，重悬后，将菌液涂布于含相应抗生素的LB平皿上；
(7)倒置平皿，37℃培养18h左右；
(8)在1.5mL离心管中加入1mL含抗生素的LB液体培养基，挑取若干单克隆加入管中，37℃，220rpm培养约5h至液体变浑浊，用相应的引物做菌液PCR鉴定并送生工公司测序，将测序结果于NCBI比对后，结果显示该基因属于COPT家族的COPT5成员；
(9)选测序正确的菌液接种于20mL含100ug/L氨苄的LB液体培养基中大量培养，提取质粒。
实施例6大肠杆菌质粒的提取
提取步骤参考北京索莱宝科技有限公司质粒小量提取试剂盒的说明书。
实施例7酵母转化方法
(1)酵母菌种划线活化后，挑单克隆于装有5mL液体YPDA培养基的10mL离心管中，放置于摇床上30℃，220r/min振荡培养过夜；
(2)吸出1mL过夜培养的菌液重新接种于5mL液体YPDA培养基中，放置于摇床上30℃，200r/min振荡培养至至对数生长期。
(3)菌液2500r/min离心5min，弃上清；
(4)将细胞用5mL灭菌的蒸馏水重悬，2500r/min离心5min，弃上清；
(5)用1mL醋酸锂(100mmol/L)悬浮细胞，转移到经过灭菌的1.5mL离心管；
(6)2500r/min，离心1min沉淀细胞，吸出醋酸锂；
(7)重新悬浮细胞于400μL醋酸锂(1mol/L)中，振荡细胞悬浮液，分别取50μL样品加到新的1.5mL离心管中，离心沉淀细胞，除去醋酸锂；
(8)按以下顺序加入转化混合液：240μLPEG(50％w/v)；36μL醋酸锂(1mol/L)；5μL载体DNA；2μL质粒；68μL ddH2O。
(9)剧烈振荡直到细胞完全混匀(1min左右)；
(10)30℃放置30min，42℃热激20-25min；
(11)6000-8000r/min，离心15s，除去转化混合液；
(12)将200μL无菌水加到反应管中，悬浮沉淀，涂选择平板；
(13)倒置平皿，放在30℃培养箱中培养大约2天，挑取若干单克隆加入管中，做PCR鉴定，正确的克隆可接种于不同抗性的选择培养基上观察表型。
实施例8酵母互补实验表型分析
挑取经过鉴定的阳性克隆于筛选培养基(SD his-glu)的液体培养基(添加有葡萄糖)中，30℃，200r/min振荡培养至OD600＝0.8-1.2。离心收集酵母细胞，用无菌水梯度稀释酵母至OD600分别为1.0、0.1、0.01和0.001。将不同浓度的1μL细胞液依次接种于分别含梯度浓度的CuSO4和BCS的SD-his glu固体培养基和YPEG固体培养基上培养3-6天。SD his-glu平板及转空载体酵母(vector/ctr1Δctr3Δ)作为对照。
将酵母表达载体pAG413-EsCOPT5转入酵母ctr1Δctr3Δ突变体株系中。该菌株缺少高亲和Cu吸收蛋白Ctr1和Ctr3，不能在以甘油为碳源的YPEG培养基上正常生长，在培养基中添加足够的Cu可恢复其生长。如图3所示，转化空载体(EV)或EsCOPT5的酵母菌株均可在以葡萄糖为碳源的培养基(Glu)上正常生长，而在以甘油为碳源的培养基(YPEG)上，转化空载体(EV)的酵母不能生长，而EsCOPT5的酵母能够正常生长，说明EsCOPT5能够增加细胞质中的Cu含量，增强细胞的缺Cu抗性。由于COPT5家族蛋白被认为定位于液泡，其功能为将液泡中的Cu转运到细胞质中，供生命活动所需，另外还能够促进Cu向地上部运输。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津师范大学
<120> 一种海州香薷COPT基因及其应用
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 429
<212> DNA
<213> Elsholtzia splendens
<400> 1
atgatgcaca tgacgtttta ctggggcaga agcgttacga ttctcttcga ttcatggaaa 60
accgattcat ggctcagcta cttcctctct ctcttcgccg tcttcctctt ctccgtcttc 120
taccagtaca tggaggaccg ccgcctccga ttgaagctcc tcaagccctc tccgccgccg 180
gaatcctccg ctcagacccc tctcctcttc cacaagctgc gcgcccgcaa gtgggccccc 240
caccagctcg ctggggcgat cttgttcggg gtcaactcgg cgatcggcta tttcttgatg 300
ctcgccgtga tgtcgttcaa cgccggcgtg ttcgtcgcgg tggtggtggg gctcgccgtc 360
ggctacttac tcttccgcgg cgacgacgag gaggtggggc tcgttgataa tccttgcgcc 420
tgcgcttga 429
<210> 2
<211> 142
<212> PRT
<213> Elsholtzia splendens
<400> 2
Met Met His Met Thr Phe Tyr Trp Gly Arg Ser Val Thr Ile Leu Phe
1 5 10 15
Asp Ser Trp Lys Thr Asp Ser Trp Leu Ser Tyr Phe Leu Ser Leu Phe
20 25 30
Ala Val Phe Leu Phe Ser Val Phe Tyr Gln Tyr Met Glu Asp Arg Arg
35 40 45
Leu Arg Leu Lys Leu Leu Lys Pro Ser Pro Pro Pro Glu Ser Ser Ala
50 55 60
Gln Thr Pro Leu Leu Phe His Lys Leu Arg Ala Arg Lys Trp Ala Pro
65 70 75 80
His Gln Leu Ala Gly Ala Ile Leu Phe Gly Val Asn Ser Ala Ile Gly
85 90 95
Tyr Phe Leu Met Leu Ala Val Met Ser Phe Asn Ala Gly Val Phe Val
100 105 110
Ala Val Val Val Gly Leu Ala Val Gly Tyr Leu Leu Phe Arg Gly Asp
115 120 125
Asp Glu Glu Val Gly Leu Val Asp Asn Pro Cys Ala Cys Ala
130 135 140

Claims (2)

1.一种海州香薷COPT基因，其特征在于：其DNA序列如SEQ ID No:1所示。
2.一种海州香薷COPT基因编码的蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
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