CN105884875A

CN105884875A - 橡胶树铜离子转运蛋白及其编码基因

Info

Publication number: CN105884875A
Application number: CN201610400189.2A
Authority: CN
Inventors: 王聪; 魏芳; 校现周; 罗世巧; 仇键; 杨文凤; 吴明; 高宏华
Original assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2016-06-08
Filing date: 2016-06-08
Publication date: 2016-08-24
Anticipated expiration: 2036-06-08
Also published as: CN105884875B

Abstract

本发明提供了一段由序列表中SEQ ID NO：3所示氨基酸残基序列组成的蛋白质及其编码基因HbCOPT1，其开放阅读框核苷酸序列全长426bp，编码141个氨基酸，属于Ctr/COPT铜转运蛋白家族，含有3个跨膜结构域，不含信号肽序列；将HbcOPT1序列克隆到酵母表达载体中，构建***了该基因的酵母表达载体，通过酵母突变体的回复验证实验，验证该HbcOPT1编码的铜转运蛋白对铜离子有特异高亲和性，具有铜转运的功能，表明该基因是一种铜转运的基因；本发明对促进植物自身对铜离子的吸收和积累，特别是对橡胶树胶乳品质遗传改良和高产新品种培育具有重要意义。

Description

橡胶树铜离子转运蛋白及其编码基因

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特不是一种巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell.arg.)中铜离子转运蛋白及其编码基因HbcOPT1的分离、克隆、功能验证。

背景技术

橡胶树，学名:Hevea brasiliensis (Willd. ex a. Juss.)Muell. arg，大戟目大戟科橡胶树属植物，落叶乔木。原产于南美洲巴西亚马逊河流域,，该地区的气候条件具有温度高、温差小、湿度大、雨量充沛及雨日均匀等特点( 刘金河，“巴西橡胶树的水分状况与生长和产胶量的关系”，生态学报，1982) 。目前除原产地外，亚洲、非洲和大洋洲等多个国家和地区也广泛种植；橡胶树种植要求年平均降水量1150-2500毫米，适于在土层深厚、肥沃而湿润、排水良好的酸性砂壤土生长。我国植胶区主要分布于海南、广东、广西、云南等地区，其中海南为主要植胶区。

天然橡胶是产胶植物的一种次生代谢物，不仅是工业原料之一，更是我国重要的战略物资，被广泛应用于农业、医疗卫生及航空、军事等高科技特殊领域。作为重要的工业原料和战略物资之一，具有耐高温、耐磨、绝缘性好及高弹性等优点。自然界有2000多种植物可以合成橡胶，其中原产亚马逊河流域的巴西橡胶树是目前天然橡胶唯一的商业来源，我国于20世纪50年代开始在南部热带、亚热带地区大面积种植。橡胶树树皮内的乳管被割断时，胶乳就会从橡胶树上流出。从橡胶树上采集的乳胶，经过稀释后凝固、洗涤等一系列流程得到天然橡胶。橡胶树中胶乳的质量与产量直接关系到天然橡胶的品质，故在保证胶乳自身质量的前提下提高胶乳的产量具有重要的意义与价值。

铜离子是植物生长发育过程中所必须的一种微量元素，在植物生长发育过程中扮演中重要的角色。铜离子作为一种必须的微量元素是许多酶的组成成分，如细胞色素 C 氧化酶、Cu/Zn 超氧化物歧化酶（Cu /Zn SOD）、NADPH 氧化酶、乙烯受体、质体蓝素、漆酶、多酚氧化酶等，参与了植物生长发育进程中的各种生理过程，铜离子在一价和二价态之间的相互转换完成将电子传递给氧的功能。在植物中，铜离子参与了呼吸作用、光合作用、氧化胁迫清除、细胞壁重建、乙烯传导和对病原菌应答(Puig et al. 2007, Burkhead et al.2009, Yuan et al. 2010)等过程。铜离子缺乏会导致植物的多重化缺陷，包括植物体生长发育缓慢、畸变、和幼叶枯黄，种子和果实减少。提高浓度，铜离子可以代替其它金属辅酶因子在它们天然金属蛋白中或是发生活性氧胁迫在核酸、蛋白、脂质水平上导致对细胞产生氧化损害(Halliwell and Gutteridge 1984, Pena et al. 1999).因此，铜过量在植物生长发育的过程中会导致营养组织枯萎变黄、根部生长缓慢，花和芽有瑕疵并且铁的吸收率也会降低。因此，植物建立了复杂的机制来调节铜离子的浓度。

对于橡胶树而言，开割的伤害会诱导内源乙烯的生成，内源乙烯又会诱导橡胶树产生愈伤和应对伤害的反应,增强胶乳再生（郑杰.乙烯利在橡胶树上应用的研究进展[J].安徽农业科学.2007,35(19):5686-5688.）。铜离子也可以诱导胶树产生内源乙烯，改变橡胶树的品质，增加胶乳中铜离子的浓度会抑制2-核苷酸酶的活性，激活NADP的合成而有利于橡胶的合成（d'Auzac J, Jacob J-L, Chrestin H. Physiology of rubber treelatex. The laticiferous cell and latex-a model of cytoplasm[M]: CRC PressInc, 1989），因此铜离子的吸收、分布和螯合对橡胶树中胶乳的品质和产量有重要的作用。

铜离子最初依赖铜转运蛋白（copper transporter, COPT）转运蛋白摄入细胞，在对铜离子吸收缺陷型酵母突变体功能互补的实验中发现了COPT家族（Sancenón V, PuigS, Mira H, Thiele DJ, Pearrubia L (2003). Identification of a coppertransporter family in Arabidopsis thaliana. Plant Mol Biol, 2003,51,: 577-587.），在哺乳动物、酵母、植物中均有存在。其中拟南芥（Arabidopsis thalianaz）中的AtCOPTs研究最为广泛。铜转运家族成员含有3个推测的跨膜区域，其中一些成员可在膜中形成便于铜离子穿过的孔道（Puig S, Thiele DJ (2002). Molecular mechanisms ofcopper up-take and distribution. Curr Opin Chem Biol, 2002, 6: 171-180.），模式植物拟南芥中鉴定得到6个COPT成员。

目前，铜转运蛋白的研究主要集中于哺乳动物、酵母及模式植物拟南芥，铜离子转运蛋白的研究主要集中于酵母和双子叶植物拟南芥中，综合已有的文献可见，铜离子转运蛋白的研在巴西橡胶树中尚未见报道。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明首次公开了一种巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell. arg.)中的铜转运蛋白编码基因HbCOPT1，并获得了该基因编码的蛋白氨基酸序列。同时运用分子生物学及基因工程技术证实，该基因编码的蛋白对铜离子具有特异高亲和性，可以提高植物自身对铜离子吸收和积累。本发明是这样实现的：

一种橡胶树铜离子转运蛋白HbCOPT1，是由序列表中SEQ ID NO：3所示氨基酸残基序列组成的蛋白质，该蛋白有一个保守结构域，以及3个跨膜结构域，不存在信号肽序列，如图2所示。

序列表中SEQ ID NO：3所示氨基酸残基序列组成的蛋白质的编码基因。

序列表中SEQ ID NO：3所示氨基酸残基序列组成的蛋白质的编码基因，具体为下列脱氧核苷酸序列之一：

1）铜转运蛋白编码基因HbCOPT1，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；

2）铜转运蛋白编码基因HbCOPT1，其编码序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，即自SEQID NO：1 5'末端第138-564位核苷酸所示的DNA分子。

含有序列表中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示基因序列的重组表达载体PDR196-HbCOPT1、转基因细胞系或重组工程菌ctr1Δctr3Δ-HbCOPT1和ctr1Δctr2Δctr3Δ-HbCOPT1。

扩增序列表中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示基因序列的引物对。

本发明使用的ctr1Δ ctr3Δ和ctr1Δctr2Δctr3Δ 两个酵母缺陷型突变体由Dennis J. Thiele教授馈赠，使用酵母作为外源***来分析铜转运功能，缺陷型酵母突变体细胞的线粒体呼吸链中缺乏细胞色素c氧化酶，因而无法提供铜离子，阻碍了突变体在非发酵的以甘油和乙醇作为碳源的YPEG介质中的生长，除非高浓度外源铜添加到培养基中。利用ctr1Δ ctr3Δ和ctr1Δctr2Δctr3Δ 两个酵母缺陷型突变体完成了功能互补实验，证明HbcOPT1对铜离子具有特异高亲和性，能够转运铜离子，并且对铜离子的转运能力强。

附图说明

图1 HbCOPT1基因克隆琼脂糖凝胶电泳图。

图2 HbCOPT1蛋白跨膜结构域预测和信号肽预测示意图。

图3 HbCOPT1基因的组织特异性表达示意图。

图4 功能互补实验菌液点样示意图。

图5为酵母缺陷型突变体功能互补实验结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制的目的，本发明的实质性的保护范围由权利要求所界定，这些实施例仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供的HbCOPT1基因结构特性为，基因的ORF序列全长为426bp，该基因编码141个氨基酸。推导的蛋白有一个结构域，以及3个跨膜结构域，不含有信号肽序列。

实施例涉及的序列如下：

SEQ ID NO：1：

gtactacaca accttacatt tcaatgcctt ttcaactccg tcattgcatt gatactttac 60

ttggcagctg agttttctct ctctaaaaaa ctcgttcatt ttttcttgtt aattcttcaa 120

ctcagtgagt catcaaagat gatgcacatg accttttact ggggccgcca ggtgactctc 180

ctggtggact cgtggcgcac cacgacatgg ctgggttacg ctctgactct tctcgtttgt 240

gtagttgcct ccgccttgta ccaattccta gagaatctcc gcgtccgcat gcgcttcaaa 300

cttgtcgtgg gcactggcgg ctcagcagca gaagagcctt tgcttcaatc caagacgggt 360

agagggaaat tgtcggcggc gagggtagcg caagcagtgc ttttcggggt gaactcggcg 420

atcgggtact tgttgatgct tgcagtgatg tcgtttaacg gaggggtgtt tgtggcgatc 480

gtaatggggc tgggtattgg gtatttgttg tttagtgagg atgagaattt cgcgcttgtg 540

gatagcccct gtgcctgtgc ttagacacag acagagacaa gaaaaataaa caaagtatgt 600

atttctgtgt ttttttcctt tttgggtttt ggttgtacgt ttcttttacc tgtaaaaatc 660

tcatctttgt ctcatgtaat ttgggaactg aaccaaagat accattgggt tcttctatta 720

cctgtaaaaa tctgatcttt gtcttgtgta atttgggaac tgagccgaag agacaattgg 780

gttcttcttt tacctgtaaa aatctgatcc ttgtctcgtg taatttggga actgagccga 840

agagacaatt gggttcttct tttacctgta aaaatctgat ccttgtctc 889；

SEQ ID NO：2：

atgatgcaca tgacctttta ctggggccgc caggtgactc tcctggtgga ctcgtggcgc 60

accacgacat ggctgggtta cgctctgact cttctcgttt gtgtagttgc ctccgccttg 120

taccaattcc tagagaatct ccgcgtccgc atgcgcttca aacttgtcgt gggcactggc 180

ggctcagcag cagaagagcc tttgcttcaa tccaagacgg gtagagggaa attgtcggcg 240

gcgagggtag cgcaagcagt gcttttcggg gtgaactcgg cgatcgggta cttgttgatg 300

cttgcagtga tgtcgtttaa cggaggggtg tttgtggcga tcgtaatggg gctgggtatt 360

gggtatttgt tgtttagtga ggatgagaat ttcgcgcttg tggatagccc ctgtgcctgt 420

gcttag 426；

SEQ ID NO：3：

Met Met His Met Thr Phe Tyr Trp Gly Arg Gln Val Thr Leu Leu Val

1 5 10 15

Asp Ser Trp Arg Thr Thr Thr Trp Leu Gly Tyr Ala Leu Thr Leu Leu

20 25 30

Val Cys Val Val Ala Ser Ala Leu Tyr Gln Phe Leu Glu Asn Leu Arg

35 40 45

Val Arg Met Arg Phe Lys Leu Val Val Gly Thr Gly Gly Ser Ala Ala

50 55 60

Glu Glu Pro Leu Leu Gln Ser Lys Thr Gly Arg Gly Lys Leu Ser Ala

65 70 75 80

Ala Arg Val Ala Gln Ala Val Leu Phe Gly Val Asn Ser Ala Ile Gly

85 90 95

Tyr Leu Leu Met Leu Ala Val Met Ser Phe Asn Gly Gly Val Phe Val

100 105 110

Ala Ile Val Met Gly Leu Gly Ile Gly Tyr Leu Leu Phe Ser Glu Asp

115 120 125

Glu Asn Phe Ala Leu Val Asp Ser Pro Cys Ala Cys Ala；

130 135 140

SEQ ID NO：4：

FP-5'-ATGATGCACATGACCTTTTACTG-3'；

SEQ ID NO：5：

RP-5'-CTAAGCA CAGGCACAGGG GCTA-3'；

SEQ ID NO：6：

FP-5'：-CTTCAATCCAAGACGGGTAGAG-3'；

SEQ ID NO：7：

RP-5'：-GACATCACTGCAAGCATCA AC-3'；

SEQ ID NO：8：

FP-5'：-GGTCGCAAGGCTGAAACT-3'；

SEQ ID NO：9：

RP-5'：-AC GGGCGGTGTGTACAAA-3'；

SEQ ID NO：10：

FP-5'：-GGGAAGCTTGTAAAAGAAATGATGCACATGACCTT TTACTG-3'；

SEQ ID NO：11：

RP5'：-GTCGACCTAAGCACAGGCACAGG GGCTA-3'；

实施例中所用试剂如下：

BioTeke公司的通用植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）、OMEGA公司的Gel ExtractionKit和Plasmid Mini KitI、 Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit、TaKaRa公司的SYBRpremix Ex TaqII、primeSTARHSpremix、10xT4 DNALigase Buffer、T4 DNA Ligase、pMD 18-T vector、TaKaRa公司的SalI内切酶、杰美基因的酵母转化试剂盒、TAE电泳缓冲液、感受态细胞Trans5α、PDR196酵母表达载体、LB 培养基、含有抗生素（Amp）的LB 琼脂平板培养基、含有SD-Ura的YEB培养基、YPEG培养基、 PCR 反应体系。

实施例1 橡胶树中铜离子转运相关的基因HbCOPT1及其编码序列的获得

1.1橡胶树热研7-33-97总RNA的提取及cDNA的反转录

利用BioTeke公司的通用植物总RNA（离心柱型）提取试剂盒提取幼龄树根、茎、叶、木质部和胶乳的RNA，测定RNA的浓度，并进行1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。经过完整性和浓度测定后，取总量为1μg的RNA利用反转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit（Fermentas）将RNA反转录为cDNA。

1.2目的基因的筛选及克隆

在本研究对橡胶树气刺长流胶转录组和橡胶树基因组中的铜转运蛋白COPT进行了筛选，得到铜转运蛋白相关基因完整的开放阅读框序列，根据得到的开放阅读框序列利用Primer5.0生物学软件设计上游引物SEQ ID NO：4和下游引物SEQ ID NO：5，以橡胶树的根、茎、叶、木质部、胶乳的混合cDNA为模板，在PrimeSTARR HS premix的作用下进行PCR扩增，扩增条件为98℃变性3min，98℃变性10s，58℃复性15s，72℃延伸1min，一共进行35个循环，最后再72℃延伸10min。

PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示，并进行回收，胶回收使用OMEGA公司的Gel Extraction Kit试剂盒。将得到的片段与pMD18-T载体连接16℃过夜，再转化DH5α大肠杆菌感受态，在LB抗性的平板上37℃过夜生长，挑取单菌落进行PCR验证后，挑取阳性单克隆进行测序，送到上海英潍捷基贸易有限公司测序，测序结果与SEQ IDNO：1比对一致，测序后在NCBI上进行鉴定比对（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），将新发现的核苷酸序列命名为HbCOPT1。

实施例2 HbCOPT1基因序列及编码产物结构预测分析

2.1 HbCOPT1基因的序列分析

对实施例1获得的HbCOPT1基因进行分析，其开放阅读框核苷酸序列含有426bp，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，一共编码141个氨基酸，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.2 HbCOPT1基因编码产物结构预测分析

运用ExPASy-Prot -Param Tool（http://web.expasy.org/protparam/）对HbCOPT1编码的铜转运蛋白的理化性质进行分析与预测，结果显示， HbCOPT1推导的铜转运蛋白含有较多的氨基酸为Leu、Val和Ala，等电点为 8.53，不稳定系数为28.76，总平均亲水性系数为0.691 ，预测HbCOPT1编码的铜转运蛋白属于稳定的疏水性蛋白。

分别利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.ht ml）、TMH MM Serverv.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和SignalP 4.1Server（http:// www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/），对HbCOPT1推导的铜转运蛋白进行分析与预测，预测结果表明，HbCOPT1推导的铜转运蛋白含有一个CtrSuperfamily保守结构域，位于第2到126个氨基酸。还含有三个跨膜结构域（如图2A所示），分别处于氨基酸22-44、78-100、104-126的位置。如图2B所示该蛋白不存在信号肽序列。

实例3 HbCOPT1基因的组织特异性表达分析

经过引物的PCR分析和标准曲线的测定，并利用primer 5生物学软件确定荧光定量PCR引物，上游引物SEQ ID NO：6和下游引物SEQ ID NO：7；内参基因选择为18s rRNA，上游引物序列为SEQ ID NO：8，下游引物序列为SEQ ID NO：9。

基因的相对表达水平以18s rRNA基因为内参进行归一化，用2^ΔΔCT法表示基因的相对定量，运用 Excel、SPSS软件进行结果的统计分析。利用荧光定量PCR对HbCOPT1基因序列进行组织表达的分析，如图3所示，根据荧光定量PCR结果显示，以树叶中基因的表达量为1计算，HbCOPT1在橡胶树的根、茎、叶、木质部和胶乳均有表达，在根和叶片中的表达水平显著，HbCOPT1在胶乳中表达量是叶片中表达量的五分之一。

实施例4 HbCOPT1基因功能验证

4.1遗传转化酵母表达载体载体的构建

本发明所用的酵母介导的遗传转化载体PDR196。是常用的酵母遗传转化载体，长为6406bp，载体抗性Ampicillin，筛选标记为URA3。根据PDR196图谱添加SalI酶切位点GTCGAC设计引物，上游引物序列SEQ ID NO：10和下游引物序列SEQ ID NO：11；

克隆构建酵母表达载体载体的HbCOPT1基因，PCR产物进行胶回收，将胶回收后的PCR产物和196载体利用SalI酶进行酶切，37℃酶切20小时后电泳回收。将回收后的目的片段和载体进行16℃过夜连接，再转化DH5α大肠杆菌感受态，在LB抗性的平板上37℃过夜生长，挑取单菌落进行PCR验证后，挑取阳性单克隆进行测序。将目的基因克隆到载体中，重组载体命名为PDR196-HbCOPT1，转入重组载体的大肠杆菌为重组细胞系。

4.2 缺陷型酵母突变体的转化

将测序后比对正确的大肠杆菌菌落进行扩摇并提取其质粒，将提取的质粒利用杰美基因酵母转化试剂盒转入到缺陷型酵母突变体中，操作流程具体参考杰美基因酵母转化试剂盒附带说明书。将转入质粒的菌液均匀涂于含有SD-Ura的YEB固体培养基上，放置于30℃培养箱中培养2-3天。重组酵母缺陷型突变，分别命名为ctr1Δctr3Δ-HbCOPT1和ctr1Δctr2Δctr3Δ -HbCOPT1。

4.3 基因功能验证

挑取在含SD-Ura的YNB固体培养基上长出的ctr1Δctr3Δ-HbCOPT1和ctr1Δctr2Δctr3Δ -HbCOPT1单菌落，在YNB-Ura液体培养基中震荡培养至OD600=1.0左右，取菌液稀释10倍和100倍。另选取WT（SEY6210）、ctr1Δctr3Δ和ctr1Δctr2Δctr3Δ酵母单菌落，在YPDA液体培养基中培养至OD₆₀₀=1.0左右，进行同样的稀释。

取OD₆₀₀=1.0的WT、ctr1Δctr3Δ、ctr1Δctr2Δctr3Δ、ctr1Δctr3Δ-HbCOPT1和ctr1Δctr 2Δctr3Δ-HbCOPT1菌液以及稀释后的菌液各1μ，在含SD-Ura的YNB培养基和含0μMCu²⁺、10μMCu²⁺、100μMCu²⁺的YPEG固体培养基上进行点样，点样示意图为图4所示，点样结果如图5所示。

HbCOPT1基因功能验证结果显示：WT、ctr1Δctr3Δ、和ctr1Δctr2Δctr3Δ因为本身不含有URA3筛选标记，故在含SD- Ura的YNB固体培养基上均未生长。ctr1Δctr3Δ和ctr1 Δctr2Δctr3Δ缺陷型突变体在含低浓度铜离子的YPEG培养基上均未生长，但ctr1Δctr2Δctr3Δ突变体可在含100μMCu²⁺的YPEG培养基上生长。

HbCOPT1回复的突变体都能在标准培养基SD- Ura的YNB和以乙醇和甘油为碳源的YEPG上添加100μMCu²⁺条件下生长，故具有铜转运蛋白功能。HbCOPT1在0μMCu²⁺浓度下，能够与野生型一样行使功能，说明其对铜离子不仅具有吸收和积累的功能还具有特异的高亲和性。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国热带农业科学院橡胶研究所

<120> 橡胶树铜离子转运蛋白及其编码基因

<130> 11

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 889

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gtactacaca accttacatt tcaatgcctt ttcaactccg tcattgcatt gatactttac 60

ttggcagctg agttttctct ctctaaaaaa ctcgttcatt ttttcttgtt aattcttcaa 120

ctcagtgagt catcaaagat gatgcacatg accttttact ggggccgcca ggtgactctc 180

ctggtggact cgtggcgcac cacgacatgg ctgggttacg ctctgactct tctcgtttgt 240

gtagttgcct ccgccttgta ccaattccta gagaatctcc gcgtccgcat gcgcttcaaa 300

cttgtcgtgg gcactggcgg ctcagcagca gaagagcctt tgcttcaatc caagacgggt 360

agagggaaat tgtcggcggc gagggtagcg caagcagtgc ttttcggggt gaactcggcg 420

atcgggtact tgttgatgct tgcagtgatg tcgtttaacg gaggggtgtt tgtggcgatc 480

gtaatggggc tgggtattgg gtatttgttg tttagtgagg atgagaattt cgcgcttgtg 540

gatagcccct gtgcctgtgc ttagacacag acagagacaa gaaaaataaa caaagtatgt 600

atttctgtgt ttttttcctt tttgggtttt ggttgtacgt ttcttttacc tgtaaaaatc 660

tcatctttgt ctcatgtaat ttgggaactg aaccaaagat accattgggt tcttctatta 720

cctgtaaaaa tctgatcttt gtcttgtgta atttgggaac tgagccgaag agacaattgg 780

gttcttcttt tacctgtaaa aatctgatcc ttgtctcgtg taatttggga actgagccga 840

agagacaatt gggttcttct tttacctgta aaaatctgat ccttgtctc 889

<210> 2

<211> 426

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgatgcaca tgacctttta ctggggccgc caggtgactc tcctggtgga ctcgtggcgc 60

accacgacat ggctgggtta cgctctgact cttctcgttt gtgtagttgc ctccgccttg 120

taccaattcc tagagaatct ccgcgtccgc atgcgcttca aacttgtcgt gggcactggc 180

ggctcagcag cagaagagcc tttgcttcaa tccaagacgg gtagagggaa attgtcggcg 240

gcgagggtag cgcaagcagt gcttttcggg gtgaactcgg cgatcgggta cttgttgatg 300

cttgcagtga tgtcgtttaa cggaggggtg tttgtggcga tcgtaatggg gctgggtatt 360

gggtatttgt tgtttagtga ggatgagaat ttcgcgcttg tggatagccc ctgtgcctgt 420

gcttag 426

<210> 3

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Met Met His Met Thr Phe Tyr Trp Gly Arg Gln Val Thr Leu Leu Val

1 5 10 15

Asp Ser Trp Arg Thr Thr Thr Trp Leu Gly Tyr Ala Leu Thr Leu Leu

20 25 30

Val Cys Val Val Ala Ser Ala Leu Tyr Gln Phe Leu Glu Asn Leu Arg

35 40 45

Val Arg Met Arg Phe Lys Leu Val Val Gly Thr Gly Gly Ser Ala Ala

50 55 60

Glu Glu Pro Leu Leu Gln Ser Lys Thr Gly Arg Gly Lys Leu Ser Ala

65 70 75 80

Ala Arg Val Ala Gln Ala Val Leu Phe Gly Val Asn Ser Ala Ile Gly

85 90 95

Tyr Leu Leu Met Leu Ala Val Met Ser Phe Asn Gly Gly Val Phe Val

100 105 110

Ala Ile Val Met Gly Leu Gly Ile Gly Tyr Leu Leu Phe Ser Glu Asp

115 120 125

Glu Asn Phe Ala Leu Val Asp Ser Pro Cys Ala Cys Ala

130 135 140

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atgatgcaca tgacctttta ctg 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctaagcacag gcacaggggc ta 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cttcaatcca agacgggtag ag 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gacatcactg caagcatcaa c 21

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ggtcgcaagg ctgaaact 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

acgggcggtg tgtacaaa 18

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gggaagcttg taaaagaaat gatgcacatg accttttact g 41

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gtcgacctaa gcacaggcac aggggcta 28

Claims

1.一种橡胶树铜离子转运蛋白，是由序列表中SEQ ID NO：3所示氨基酸残基序列组成的蛋白质。

2.如权利要求1所述蛋白质的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的序列是下列脱氧核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA序列；

2）序列表中SEQ ID NO：2所示的DNA序列。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组工程菌。

5.扩增权利要求2或3所述编码基因的引物对。