CN105602964B - 烟草Snakin2基因的新应用 - Google Patents

烟草Snakin2基因的新应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了烟草NtSnakin2蛋白和/或NtSnakin2基因在改良植物对重金属镉的耐受性或积累中的应用。通过构建NtSnakin2基因的酿酒酵母转基因超表达载体，将NtSnakin2基因在酵母中超表达，可以提高酵母对重金属镉的耐受性，并降低酵母中的镉含量，促进酵母体内镉的外排，同时该基因在酵母中的表达还可以提高酵母对过氧化氢的耐受性。该基因可应用于工程菌及植物针对体内镉含量改变的遗传工程育种，以及用于环境重金属镉污染的微生物和植物修复领域。

Description

烟草Snakin2基因的新应用
技术领域
本发明属于生物基因工程领域，具体涉及烟草Snakin2基因及其编码蛋白的新应用。
背景技术
重金属镉是一种植物生长非必需的毒性元素。随着环境污染越来越严重，由地壳释放到水、大气和土壤中的具有毒性的活性镉离子也越来越多。镉在土壤中易被植物吸收且经食物链富集危害人体，已成为对生态环境危害严重的重金属之一。烟草属于易富集镉的作物(富集系数5～10)，且吸收的镉主要分配积累于叶片中，烟叶中的镉可通过烟气进入人体，增加健康威胁的风险。因此，烟草的重金属安全性成为国内外烟草研究的热点。通常情况下，人体中的镉有两大来源：一是大米；二是烟草。相关研究显示，每一支香烟都含1-2微克的镉，其中约10％会被人体吸收。由种植在镉污染土壤的烟草所制的香烟对人体危害更大。
2010年10月8日，第九届亚太烟草健康会议在澳大利亚悉尼召开。会议发布的一项中国与其他国家烟草的对比研究表明：中国产的13个牌子卷烟检测出含有重金属。烟草中含有的铅、砷和镉等重金属成分，其含量与加拿大产香烟相比，最高超出三倍以上。该事件被称为烟草界的“三聚氰胺事件”。2014年4月，国土资源部和环境保护部公布数据表明，我国土壤中镉超标的土地已达我国国土总面积的7％。按照污染发生的地区来看，重金属污染则主要分布于我国的华中南地区、泛珠三角地区、长三角地区及东北地区。而我国烟草分布很广，其中河南、山东、云南、甘肃、湖南五省是我国重要的烤烟产地。在华南地区，粤北矿区重金属污染严重，该地区也种植了一定面积的烟草。由此可见，我国很多烟草种植区域均发生了严重的重金属污染，而这些污染地区种植的烟草业必然会出现重金属超标的现象。通过分离烟草中的镉胁迫应答或镉解毒基因，深入探讨镉-烟草的生物化学及分子生理机制研究，并将镉胁迫应答相关基因在生物体内调控表达，可获得影响生物体内镉积累的转基因后代。该发明具有重要的应用价值。
Snakin/GASA基因家族在植物体内广泛存在，编码一类小分子抗病及抗氧化蛋白。目前，该类基因已经在拟南芥、水稻、番茄、土豆、矮牵牛、草莓、花生、大豆等植物中均已克隆。Snakin/GASA蛋白由以下3个结构域组成：1.一个预测的含有18-29个氨基酸残基的信号肽，通常位于蛋白的N端；2.中间为一段具有成员特异性的高度可变的区域；3.以及一个C端高度保守的Snakin/GASA结构域，通常由60个氨基酸组成，其中的12个半胱氨酸残基高度保守。尽管已有的研究表明植物Snakin/GASA基因家族成员参与植物激素应答、抗病、细胞生长、清除细胞内活性氧生理生化过程，但由于并未获得该类蛋白的活性位点，其生化功能并未被明确阐述。目前，还没有报道该类蛋白能够参与重金属镉的解毒，以及影响生物体内重金属镉积累的报道。在本发明中，我们描述了烟草的Snakin/GASA基因NtSnakin2的表达能够影响重金属镉在生物体内的积累，提供了将该基因应用于烟草的低镉遗传育种技术的可能，本发明也可应用于工程菌——酿酒酵母的低镉遗传改造。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种烟草Snakin/GASA蛋白NtSnakin2及其编码基因NtSnakin2的应用。
实现上述目的的技术方案如下。
氨基酸序列如SEQ ID NO.2的烟草Snakin/GASA蛋白NtSnakin2和/或NtSnakin2基因在提高烟草对重金属镉的耐受中的应用，所述NtSnakin2基因的cDNA为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQ ID NO.2的核苷酸序列。
氨基酸序列如SEQ ID NO.2的烟草Snakin/GASA蛋白NtSnakin2和/或NtSnakin2基因在降低烟草对重金属镉的积累中的应用，所述NtSnakin2基因的cDNA为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQ ID NO.2的核苷酸序列。
本发明的烟草Snakin/GASA蛋白NtSnakin2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因NtSnakin2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。
本发明的第二个目的是公开一种酿酒酵母重组表达载体以及相应的酿酒酵母，该重组载体***了NtSnakin2基因。将该重组载体转化进入酿酒酵母中，通过半乳糖诱导该基因在酵母中的超表达，能够在镉胁迫下，提高酵母对重金属镉的耐受，并降低酵母细胞内镉积累。同样，该基因在酵母中的表达也可以提高酵母对氧化胁迫的耐受性，提高转基因酵母对H2O2的抗性。
***有NtSnakin2基因的阅读框序列的酿酒酵母重组表达载体，所述NtSnakin2基因的cDNA为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQ ID NO.2的核苷酸序列。
一种工程菌株酿酒酵母，其转入有上述的酿酒酵母重组表达载体。
本发明还提供了上述酿酒酵母重组表达载体的应用。
上述酿酒酵母重组表达载体在提高工程菌株酿酒酵母对重金属镉的耐受性中的应用。
上述酿酒酵母重组表达载体在降低工程菌株酿酒酵母对重金属镉的积累中的应用。
本发明的另一目的是提供一种改良烟草中重金属镉的耐受性的生物制剂。
实现上述目的的技术方案如下。
一种提高烟草中重金属镉耐受性的生物制剂，其活性成份来源于上述酿酒酵母重组表达载体，或其活性成份含有调控NtSnakin2基因表达的生物制品，所述NtSnakin2基因的cDNA为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQ ID NO.2的核苷酸序列。
一种降低烟草中重金属镉积累的生物制剂，其活性成份为上述酿酒酵母重组表达载体，或其活性成份含有调控NtSnakin2基因表达的生物制品，所述NtSnakin2基因的cDNA为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQ ID NO.2的核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供一种调控烟草中重金属镉的积累的方法。
实现上述目的的技术方案如下。
一种调控烟草中重金属镉耐受性或重金属镉积累的方法，其步骤包括调控NtSnakin2基因的表达，所述NtSnakin2基因的cDNA为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQ ID NO.2的核苷酸序列。
本发明的有益效果如下：
在本发明中，我们通过对筛选文库获得的NtSnakin2基因的进行应用性探索，发现该基因以下应用方式：(1)该基因在酿酒酵母中的超量表达能够提高酵母对重金属镉的耐受性；(2)在酿酒酵母中的超量表达能够降低酵母细胞对重金属镉的积累，促进酵母体内镉的外排。(3)该基因在酿酒酵母中的超量表达能够提高酵母对H2O2的耐受性。
本发明描述了NtSnakin2基因在生物工程方面的应用。将本基因在酿酒酵母中诱导表达，可以提高酵母对重金属镉的耐受性；同时在添加镉的培养基中生长，能够降低酵母中的镉含量，减少镉在酵母细胞中的积累。依次列推，由于该基因来源于烟草，通过控制该基因在烟草中的表达，也可将该基因应用于烟草基因工程育种，用于培育耐镉或低镉的烟草转基因品种。
附图说明
图1示烟草NtSnakin2基因应答重金属镉胁迫及其他逆境和激素胁迫的qRT-PCR检测。
图2示构建完成的酿酒酵母重组表达载体NtSN2-pYES260示意图。
图3示转化NtSN2-pYES260的转基因酵母对镉胁迫的耐受性提高。
图4示转化NtSN2-pYES260的转基因酵母在含镉培养基中生长后镉积累降低。
图5示转化NtSN2-pYES260的转基因酵母对H2O2的耐受性提高。
具体实施方式
本发明以前期构建的烟草幼苗根的cDNA表达文库在酵母中的筛选结果为基础，获得了能够提高酵母对镉的耐受性的烟草cDNA，通过测序分析，该基因编码一个烟草Snakin/GASA蛋白基因，该基因编码一个包含315个核苷酸的开放阅读框，其cDNA全长序列如SEQ IDNO.1所示。其编码蛋白具有104个氨基酸残基，其序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.1
cDNA序列(下划线部分为cDNA阅读框，上游为5’非翻译区，下游为3’非翻译区)>NtSnakin2
AAACAAATTTCCATTACTTCTAAAGAATTTCAAACTTCCAATGGCCATTTCTAAAACTCTCTTTGTTTC ATTAGTTCTCTCCTTGCTCCTCCTCGATCAAGTTCAATCCATTCAAACTGATCAAGTGACCAGCAATGCTATTTCTG AAGCCGCTTATTCCTACCCGAAAATCGATTGTGGGGGAGCATGTAAAGCAAGGTGCCGTTTATCATCAAGGCCAAGA TTGTGTAAGAGAGCATGTGGAACTTGTTGTGCTAGATGTAACTGTGTTCCTCCTGGCACTTCTGGCAACACTGAAAC TTGCCCTTGCTATGCAAATATGACTACTCACGGCAACAGACGCAAATGCCCTTAATTTATTAATCTTCTTTTTAAAATCTTCTGCTACTTATTGTTTTCCTCAGACTATACTATATGGTCCTGTCCATATTGTATCAATAAACAAAATGTAGTAAATGTTTTTACGATATTTGTTTTTGTGTCTTTTCTTTTTGAGGAATTGTGTCCTCTCCTCTTGGTGAGTTAATACATTTGTAATGCTTTGTATTCTTGTTTGTATTATATGAGATGTGGAATAAATGAAGTTTTGTATGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO.2
氨基酸序列
>NtSnakin2protein
MAISKTLFVSLVLSLLLLDQVQSIQTDQVTSNAISEAAYSYPKIDCGGACKARCRLSSRPRLCKRACGTCCARCNCVPPGTSGNTETCPCYANMTTHGNRRKCP。
本发明以红花烟草(Nicotiana tabacum L.cv.SR1)幼苗为材料提取RNA，并将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板，设计引物NtSN2YEF：5’-TTTCAGGGCGCCATGGCCATTTCTAAAACTCTCTTTG-3’和NtSN2YER：5’-CGTTACTAGTGGATCTTAAGGGCATTTGCGTCTGTTG-3’(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)，并采用高保真的Taq酶扩增NtSnakin2基因的cDNA阅读框全长，回收得到的片段连接于酵母表达载体pYES260，形成重组载体NtSN2-pYES260，并测序。
采用醋酸锂的方法将重组载体NtSN2-pYES260转化进入酿酒酵母中，采用诱导的极限培养基(添加半乳糖)培养酵母转化子克隆，以转化pYES260空载体的酵母菌株为对照，30℃培养酵母至OD600为1.5-2，用于检测转基因酵母菌对重金属镉胁迫和H2O2的耐受性以及对镉积累的变化。
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1：NtSnakin2基因的表达受重金属镉的诱导及其他胁迫因素和激素调控
本发明中所用的烟草品种为红花烟草SR1(Nicotiana tabacum L.cv.SR1)，种子由中科院华南植物园保存提供。采用1/2液体MS培养基萌发烟草种子，两周后长成小苗，将烟草幼苗转移1/2MS液体培养基继续培养2周。然后分别用含有CdCl2(50μM)、GA(100μM)、JA(90μM)和甘露醇(300mM)的1/2MS液体培养基处理烟草幼苗，收集胁迫处理0h、6h和24h后的烟草幼叶和幼根各0.5g，用于提取总RNA。RNA的提取依照Magen公司HiPure Plant RNAKits(R4151)的说明书进行。采用两步法以总RNA为模板逆转录cDNA。cDNA链的合成依照全式金公司TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix的说明书进行。
通过网站QuantPrime(http://www.quantprime.de/)在线设计real-time RT-PCR引物。引物序列如下所示。NtSnakin2RTF：5’-GCCGCTTATTCCTACCCGAA-3’和NtSnakin2RTR：5’-GAAGTGCCAGGAGGAACACA-3’(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)。参考BIO-RAD公司iTaqTMUniversal SYBR Green Supermix的说明书配制real time RT-PCR反应体系(冰上操作)。选用的烟草内参基因为烟草核糖体蛋白基因NtEF-1a/NtL25(NCBI Accessionnumber:L18908)，引物如下：NtL25F(5’-CCCCTCACCACAGAGTCTGC-3’)和NtL25R(5’-AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT-3’)(SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8)。采用两步法PCR反应，扩增标准程序如下：
所有检测均采用两个生物学样本重复，每个生物学样本进行三次重复检测反应。引物第一次使用时添加程序Stage3检测溶解曲线，确认引物的特异性。
如图1所示，在镉胁迫处理下，无论在烟草幼苗的根或者叶中，NtSnakin2基因的表达都受到镉的诱导，其最大诱导量均可达到2-3倍；同样，在赤霉素GA处理下，NtSnakin2基因在根和叶中的表达都受到了诱导。此外，NtSnakin2基因在叶中的表达还受到了茉莉酸(JA)和渗透压(甘露醇Mannitol)的诱导，但在根中的表达却没有很大变化。以上公开的内容表明了NtSnakin2基因是一个广泛的胁迫应答基因，除了参与烟草体内重金属镉胁迫应答之外，还参与其他胁迫及激素应答。该基因具备应用于针对重金属镉胁迫和富集的烟草和其他作物遗传工程改良的潜力；也具备针对其他胁迫如高渗透压和抗病作物遗传工程改良的潜力。
实施例2：NtSnakin2基因的克隆和酵母重组表达载体NtSN2-pYES260的构建
取烟草为红花烟草SR1(Nicotiana tabacum L.cv.SR1，华南植物园保存)的幼苗叶片，提取幼叶的RNA，并逆转录成cDNA，以cDNA为模板，设计引物NtSN2YEF：5’-TTTCAGGGCGCCATGGCCATTTCTAAAACTCTCTTTG-3’和NtSN2YER：5’-CGTTACTAGTGGATCTTAAGGGCATTTGCGTCTGTTG-3，(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)，采用高保真的T aq酶PCR扩增NtSnakin2基因的cDNA阅读框全长。采用的PCR体系参考TaKaRa公司Pri meSTAR HS DNA Polymerase说明书。扩增的DNA片段依照Magen公司HiPure Gel Pure DNA Kits说明书。回收得到的片段用于***至酵母表达载体pYES60中。酿酒酵母表达载体pYES260经NcoI和BamHI双酶切处理，回收线性化质粒。回收后的NtSnakin2片段和线性化pYES260质粒经Nanodrop公司紫外分光光度计测定浓度，采用TaKaRa(Clontech)公司的In-HD Cloning Kit进行DNA片段和载体的同源重组连接。按照说明书的方法将反应产物转化大肠杆菌JM109感受态菌株。挑取单克隆，提取质粒，经测序鉴定为正确的阳性克隆后，保存质粒备用。经测序分析后，NtSnakin2的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。构建好的酿酒酵母重组表达载体NtSN2-pYES260如图2所示。
实施例3：NtSnakin2基因在酿酒酵母中的表达提高酵母对重金属镉耐受性
培养酿酒酵母菌株WT和Δycf1(购自欧洲酵母研究中心Euroscarf,http://web.uni-frankfu rt.de/fb15/mikro/euroscarf/,菌株编号Y00000和Y04069)，用pYES260质粒和重组的NtSN2-pYES260对上述酵母进行转化。由于NtSnakin2基因是置于酵母半乳糖诱导的启动子PGAL1调控之下(见图2所示)，将NtSN2-pYES260转化酿酒酵母并置于添加半乳糖的生长选择合成培养基(Selective Growth Synthetic Medium,SD medium)上生长，即可诱导NtSnakin2在酵母中异源超量表达。
酵母转化采用的方法为醋酸锂转化法，具体步骤如下：
1)接种待转化的酵母菌株WT和Δycf1的单菌落于5mL YPD液体培养基中，于30℃恒温摇床(200rpm)，培养过夜达到饱和。
2)按照1:100比例转移上述培养物到20mL YPD液体培养基中于30℃恒温摇床(200rpm)继续培养，摇3-5h至菌液OD600值达0.4-0.6。
3)培养液在室温条件下4000g离心5min，收集细胞。细胞用10mL无菌超纯水重悬，再于室温下5000-6000g离心5min，沉淀细胞。
4)细胞用2mL锂盐溶液重悬，锂盐溶液按照下表配制(现配现用)：
5)将2μL待转化质粒和10μL变性鲑鱼精一起加入1.5mL离心管中混匀。
6)往每个离心管中加入200μL用锂盐溶液重悬的细胞悬液，再加入1mL新鲜配制的PEG溶液。PEG溶液的配方为：
30℃摇荡温育30min。
7)于42℃热激15min，室温下离心5s，细胞沉淀用200μL-1mL 1×TE缓冲液(从10×储液新鲜配制)重悬，并取其中200μL涂布在添加了2％半乳糖的SD固体培养基平板上。30℃培养2-5天，直到出现转化子。
挑取酵母菌株WT和Δycf1转化空载体pYES260和NtSnakin2基因超表达载体NtSN2-p YES260的单克隆，接种于2ml添加了半乳糖的SD液体培养基中，30℃恒温摇床(200rpm)培养至菌液OD600值达2。按照1:1、1:10、1:100、1:1000将菌液进行逐级稀释，分别吸取2μl逐级稀释的菌液滴至无添加和添加有75μM Cd的SD(添加半乳糖)固体培养基平板上。30℃培养7天，观察酵母生长情况。
如图3所示，WT示酿酒酵母野生型菌株，Δycf1示酿酒酵母对镉敏感的突变体菌株，该菌株突变了一个镉转运蛋白(yeast cadmium factor1)，体内易富集镉并产生毒性，在添加了75μM Cd的培养基上不能生长，即该菌株对镉敏感，耐受性较低。酵母菌株野生型WT作为对照，则可以在添加了75μM Cd的培养基上正常生长。很显然，超表达NtSnakin2基因的转基因酵母相比较于转化空载体pYES260的Δycf1酵母突变株而言，能够在添加75μM Cd的培养基中生长，而未表达NtSnakin2基因的酵母(转化空载体pYES260)则不能生长，表明NtSnakin2基因在酵母中的表达能够降低镉对酵母菌株的毒害，提高酵母对重金属镉的耐受性。
实施例4：NtSnakin2基因在酿酒酵母中的表达降低酵母体内镉的积累
培养酿酒酵母菌株野生型WT和Δycf1(购自欧洲酵母研究中心Euroscarf,http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/,菌株编号Y00000和Y04069)，采用实施例3的方法转化酵母表达载体空载体pYES260和NtSnakin2基因超表达载体NtSN2-pYES260。在超净台中用无菌牙签挑取四种酵母转化子(酵母菌株野生型WT和Δycf1分别转化pYES260和NtSN2-pYE S260)到2mL添加了半乳糖的生长选择合成培养基(SelectiveGrowth Synthetic Medium,SD medium)液体培养基中，30℃恒温摇床(200rpm)培养至菌液OD600值达2。之后将两种酵母按照1：500的体积比接种于600ml添加了半乳糖的SD液体培养基中，30℃摇床(200-250rpm)培养约12小时至OD600值达2，之后分别添加CdCl2至终浓度15μM。继续培养24小时后离心收集菌体。采用双蒸水清洗菌体3遍后，将菌体65℃干燥3-5天，干燥的酵母块进行微波消解后，采用火焰法原子吸收光谱测定酵母细胞中镉的积累。
在本发明中，转化NtSN2-pYES260的两种酵母菌株(WT和Δycf1)在添加有15μM的CdCl2的培养基中，体内积累的镉均显著低于转化pYES260空载体的酵母菌株(见图4所示)，这表明NtSnakin2基因在酵母体内的表达降低了酵母细胞对重金属镉的富集，促进了酵母体内镉的外排。
实施例5：NtSnakin2基因在酿酒酵母中的表达提高酵母对H2O2的耐受性
培养酿酒酵母菌株野生型WT、Δyap1和Δskn7(购自欧洲酵母研究中心Euroscarf,http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/,菌株编号Y00000、Y00569和Y02900)，采用实施例3的方法转化酵母表达载体空载体pYES260和NtSnakin2基因超表达载体NtSN2-pYES260。之后，挑取转化子单克隆，采用实施例3的方法接菌于添加了半乳糖的SD液体培养基中并培养。30℃恒温摇床(200rpm)培养至菌液OD600值达2。按照1:1、1:10、1:100、1:1000将菌液进行逐级稀释，分别吸取2μl逐级稀释的菌液滴至无添加和添加有0.5mM的H2O2和0.75mM的H2O2的SD(添加半乳糖)固体培养基平板上。30℃培养7天，观察酵母生长情况。
如图5所示，WT示酿酒酵母野生型菌株，Δyap1和Δskn7分别示酿酒酵母对H2O2敏感的突变体菌株。表达了NtSnakin2基因的转基因酵母相比较于转化空载体pYES260的Δyap1和Δskn7酵母突变株而言，能够在添加0.5mM的H2O2和0.75mM的H2O2的培养基中生长，而未表达NtSnakin2基因的酵母Δyap1和Δskn7(转化空载体pYES260)则不能生长，表明NtSnakin2基因在酵母中的表达能够降低H2O2对酵母菌株的毒害，提高酵母对氧化胁迫的耐受性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的烟草NtSnakin2蛋白和/或NtSnakin2基因在提高烟草对重金属镉的耐受中的应用，所述NtSnakin2基因的cDNA为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQ IDNO.2的核苷酸序列。
2.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的烟草NtSnakin2蛋白和/或NtSnakin2基因在降低烟草对重金属镉的积累中的应用，所述NtSnakin2基因的cDNA为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQ IDNO.2的核苷酸序列。
3.***有NtSnakin2基因的cDNA阅读框序列的酿酒酵母重组表达载体在提高工程菌株酿酒酵母对重金属镉的耐受性中的应用，其特征在于，所述NtSnakin2基因的cDNA为如SEQID NO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQ ID NO.2的核苷酸序列。
4.***有NtSnakin2基因的cDNA阅读框序列的酿酒酵母重组表达载体在降低工程菌株酿酒酵母对重金属镉的积累中的应用，其特征在于，所述NtSnakin2基因的cDNA为如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQ ID NO.2的核苷酸序列。
5.一种调控烟草中重金属镉耐受性或重金属镉积累的方法，其特征是，该方法步骤中包括调控NtSnakin2基因的表达，所述NtSnakin2基因的cDNA为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQ IDNO.2的核苷酸序列。
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