CN110812489B - 治疗急性肾损伤的双级靶向高分子前体药物及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗急性肾损伤的双级靶向高分子前体药物及制备方法，属于药物领域。该高分子前体药物由(4‑羧丁基)三苯基溴化膦、姜黄素和不同聚合度的低分子量壳聚糖嫁接而成。该高分子前体药物通过低分子量壳聚糖与肾小管上皮细胞表面特异性表达的Megalin受体结合，增加姜黄素在靶细胞内的分布；进入细胞的高分子前体药物在线粒体靶向分子(4‑羧丁基)三苯基溴化膦的介导下，进一步增加姜黄素在靶细胞线粒体中的分布，通过降低线粒体产生的ROS，有效逆转肾小管上皮细胞的氧化应激损伤，实现对肾缺血再灌注损伤的靶向治疗。

Description

治疗急性肾损伤的双级靶向高分子前体药物及制备方法
技术领域
本发明属于药物新型给药***研究领域，特别涉及一种治疗急性肾损伤的双级靶向高分子前体药物及制备方法。
背景技术
急性肾损伤是指一种由多种侵袭因素(如缺血再灌注损伤、内毒素、药物等) 造成肾功能在短期内急性减退的临床综合征，包括肾功能从微小改变到最终肾衰竭整个过程，其发病迅猛，死亡率高达60.3％(其中52％死于ICU)。尽管急性肾损伤的药物治疗和血液净化治疗的手段在不断地改进，但疾病的发病率和死亡率仍然很高，这使得全世界的临床医师越来越多地关注急性肾损伤，旨在寻找有效治疗手段干预和遏制急性肾损伤的疾病进展。因此如何从急性肾损伤的发病机制出发来探求一个新的治疗途径变得越来越受到关注。
近年研究发现，肾小管上皮细胞是急性肾损伤发生及发展的主要靶细胞。急性肾损伤可引起肾小管上皮细胞损伤、凋亡、坏死以及脱落，而肾小管内脱落的细胞易与尚未脱落的受激细胞通过粘附分子的相互作用，粘附成团，堵塞管腔，使管内压升高，进一步造成肾小球滤过率下降。其病理生理机制存在损伤级联反应，主要包括氧化应激、炎症反应、凋亡、细胞内钙超载等，其中氧化应激及其所诱导的细胞损伤、凋亡在急性肾损伤中的作用尤为瞩目。当呼吸链被抑制后再次恢复氧供时，线粒体会快速产生大量的ROS，过度氧化应激和细胞内钙超载是导致线粒体通透性转换孔大量开放的主要原因。线粒体通透性转换孔的大量开放易引起线粒体外膜破裂，继而形成线粒体水肿，并且释放大量的促调亡因子，如细胞色素C。外渗的细胞色素C与Caspase 9和Apaf1形成复合物，同时被激活。激活的Caspase9可激活凋亡执行蛋白Caspase 3，并最终导致细胞凋亡。
线粒体是ROS产生和清除的主要场所，同时也是ROS损伤的主要作用靶点。由于线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)缺乏保护性组蛋白，DNA修复机制不完善，又紧邻呼吸链，对ROS极其敏感，容易引起突变。而mtDNA 突变可引起氧化磷酸化功能受损产生大量ROS，进一步促进mtDNA突变，形成恶性循环，进而导致细胞氧供不足，出现线粒体功能障碍，而采用抗氧化剂预处理可提供肾缺血再灌注损伤的保护作用。因此，从逆转肾小管上皮细胞线粒体的氧化应激损伤过程入手，寻找一种有效的治疗RIRI的手段具有十分重要的研究价值与临床意义。
目前临床上抗氧化剂的品种很多，如姜黄素、维生素、氨基酸及其衍生物、ω-3多不饱和脂肪酸、褪黑素等，但总体疗效往往不尽如人意，这主要是由于所用药物均存在不同程度的肾外效应，进入机体后不能集中作用于受损靶细胞线粒体，即药物浓度过低，无法达到有效治疗浓度。因此，如何使尽可能多的抗氧化药物分布于肾脏组织，实现肾小管上皮细胞及胞内线粒体的主动靶向递送，提高治疗药物浓度，是急性肾损伤抗氧化治疗的关键。
姜黄素是是从姜黄属植物姜黄、郁金、羲术等活血化癖药物中提出的中药单体，具有抗炎、抗氧化、清除体内氧自由基等作用，研究证实姜黄素可直接清除机体内ROS，且多余的姜黄素可用于支持线粒体的能量代谢。但但它水溶性差、稳定差、生物利用度低，大大限制了其临床应用。因此，有必要采用制剂手段从改善药物水溶性、改变药物体内分布等方面出发提高姜黄素生物利用度。
高分子前体药物属于聚合物疗法的范畴，其主要特征是将治疗药物通过共价键与亲水性大分子聚合物载体相连，这样会极大地改变原形药物的理化性质和体内行为。相比于游离药物，高分子前体药物能显著延长了血液循环间、改善组织分布和累积、提高药物的生物利用度。该类药物的设计一般需要遵循以下几个原则：1、化学键在细胞外应有足够的稳定性，以延长前药***在体内的半衰期；2、一旦进入细胞内，化学键(在酸、碱、酶等条件下不稳定)应迅速被破坏降解，释出完整的药物分子；3、作为载体的聚合物应在血液循环中有足够的稳定性。基于高分子前体药物的上述特性，通过将姜黄素与亲水性大分子聚合物相连，改善药物体内半衰期和分布，实现姜黄素的肾小管上皮细胞主动靶向递送。
已有研究指出，肾小管上皮细胞高度表达Megalin受体，该受体是由4600 个氨基酸构成的跨膜糖蛋白，其结构由一个长的细胞外区、一个单独跨膜区以及一个短的细胞质尾部三部分构成。Megalin受体可与多种配体结合并通过胞吞作用介导吸收，其配体包括血浆蛋白、维生素结合蛋白、载脂蛋白、激素、药物与毒素等。有研究发现，低分子量壳聚糖可与肾小管上皮细胞的Megalin受体特异性结合，且其具有良好的水溶性、无免疫原性、分子中众多可供药物连接的功能基团等。
本发明首先合成了(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物；其次，在该聚合物上连接姜黄素，构建三苯基磷-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物，使其在实现肾小管上皮细胞的药物主动靶向转运的基础上，进一步增加抗药化剂在靶细胞线粒体中的分布，有效清除并抑制病理条件下线粒体中的ROS、改善线粒体通透性和肿胀，有效逆转肾小管上皮细胞的氧化应激损伤，实现对肾缺血再灌注损伤的高效靶向治疗。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种治疗急性肾损伤的双级靶向高分子前体药物，该药物为(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物，由(4-羧丁基)三苯基溴化膦、姜黄素和壳聚糖嫁接而成，其化学结构式如下：
Figure BDA0002311113350000031
其中，n为正整数。
优选的，n代表低分子量壳聚糖的聚合度，取值范围为6～40。
本发明的第二个目的是提供上述双级靶向高分子前体药物的制备方法，其步骤如下：
1)将(4-羧丁基)三苯基溴化膦加入到二氯亚砜中，再加入N,N-二甲基甲酰胺，加热搅拌使反应物完全溶解并冷凝回流，使(4-羧丁基)三苯基溴化膦上的羧基活化，再通过旋转蒸发除去溶剂，并加入低分子量壳聚糖和无水二甲基亚砜溶液，继续反应使(4-羧丁基)三苯基溴化膦与低分子量壳聚糖嫁接；反应结束后，纯化得到(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物；
2)将姜黄素加入无水二甲基亚砜中，再加入丁二酰氯和N,N-二异丙基乙胺，加热搅拌使反应物完全溶解，继续反应使姜黄素上的羟基活化，再加入所述的(4- 羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物，在氮气保护下继续反应使姜黄素与(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物进一步嫁接；反应结束后，纯化得到(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物。
优选的，所述低分子量壳聚糖的聚合度n为6～40。
优选的，所述的步骤1)中，取0.8866g(4-羧丁基)三苯基溴化膦加入到10mL 二氯亚砜中，再加入50μLN,N-二甲基甲酰胺，90℃搅拌使反应物完全溶解并冷凝回流，反应4h，活化(4-羧丁基)三苯基溴化膦上的羧基，旋转蒸发除去溶剂后，再加入0.966g低分子量壳聚糖，并加入10mL无水二甲基亚砜溶液，继续反应 48h，完成(4-羧丁基)三苯基溴化膦与低分子量壳聚糖的嫁接。
进一步的，所述的步骤1)中，(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物的纯化方法为：待反应结束后，将反应产物置于截留分子量为1000的透析袋中，去离子水透析48h，收集透析袋中的混悬液，于14000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物。
优选的，所述的步骤2)具体为：精密称取0.3684g姜黄素加入到15mL无水二甲基亚砜中，再加入220μL丁二酰氯和348μL N,N-二异丙基乙胺，60℃搅拌使反应物完全溶解，继续反应4h以活化姜黄素的羟基，再加入1.8526g(4- 羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物，在氮气保护下继续反应48h，完成姜黄素与(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物的进一步嫁接。
进一步的，所述的步骤2)中，(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖- 姜黄素高分子前体药物的纯化方法为：待反应结束后，将反应产物置于截留分子量为1000的透析袋中，用纯水持续透析48h；收集透析袋中的混悬液，于14000 rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，采用无水乙醇溶解并除去未反应的姜黄素，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物。
本发明提供的(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物，可以用于肾缺血再灌注损伤治疗。该高分子前体药物可通过低分子量壳聚糖与肾小管上皮细胞表面特异性表达的Megalin受体结合，增加姜黄素在肾小管上皮细胞内的分布；进入细胞的高分子前体药物在线粒体靶向分子(4-羧丁基)三苯基溴化膦的介导下，进一步增加姜黄素在靶细胞线粒体中的分布，通过降低线粒体产生的ROS，有效逆转肾小管上皮细胞的氧化应激损伤，实现对肾缺血再灌注损伤的靶向治疗。
本发明的有益之处，是所提供的(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖- 姜黄素高分子前体药物可靶向肾小管上皮细胞及胞内细胞器，提高药物在肾脏病灶的药物浓集量，从而提高药物治疗效率，从逆转肾小管上皮细胞的氧化应激损伤过程入手，探寻一种安全、高效的肾缺血再灌注损伤靶向治疗新途径。
附图说明
图1.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的合成路线图
图2.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的核磁磷谱
图3.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的核磁氢谱
图4.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的体外药物释放曲线
图5.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的肾小管上皮细胞靶向分布图片
图6.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的线粒体靶向分布图片
图7.载荧光标记物吲哚菁绿的(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的体内分布图片
图8.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的药效学结果
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。
下列各实施例中，双级靶向高分子前体药物，即(4-羧丁基)三苯基溴化膦- 低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的制备方法，按照两步方法实现，其合成路线图如图1所示：首先通过(4-羧丁基)三苯基溴化膦上的羧基经二氯亚砜活化，与低分子量壳聚糖上的氨基发生酰胺反应合成(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物，其次姜黄素经由丁二酰氯与(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物上的氨基发生酰胺化反应合成(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物。下面具体对其两步合成过程进行描述：
1、(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物的合成
称取0.8866g(4-羧丁基)三苯基溴化膦加入到10mL二氯亚砜中，再加入 50μL N,N-二甲基甲酰胺，90℃搅拌使反应物完全溶解并冷凝回流，反应4h，活化(4-羧丁基)三苯基溴化膦上的羧基，旋转蒸发除去溶剂后，向圆底烧瓶中加入0.966g低分子量壳聚糖(各实施例中分别采用不同聚合度的壳聚糖，聚合度 n＝6～40)，并加入10mL无水二甲基亚砜溶液，继续反应48h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为1000的透析袋中，去离子水透析48h，收集透析袋中的混悬液，于14000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物。
2、(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的合成
精密称取0.3684g姜黄素加入到15mL无水二甲基亚砜中，再加入220μL 丁二酰氯和348μL N,N-二异丙基乙胺，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应4h 以活化姜黄素的羟基，向圆底烧瓶中加入1.8526g(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物，在氮气保护下继续反应48h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为1000的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于14000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，采用无水乙醇溶解并除去未反应的姜黄素，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物。
下面通过各实施例展示本发明的具体技术效果，以便于本领域技术人员更好地理解本发明。
实施例1
1.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物的合成
称取0.8866g(4-羧丁基)三苯基溴化膦加入到10mL二氯亚砜后，再加入50 μL N,N-二甲基甲酰胺，90℃搅拌使反应物完全溶解并冷凝回流，反应4h以活化(4-羧丁基)三苯基溴化膦的羧基，旋转蒸发除去溶剂后，向圆底烧瓶中加入 6.448g低分子量壳聚糖(聚合度为40)，并加入10mL无水二甲基亚砜溶液，继续反应48h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为1000的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于14000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物。利用核磁共振仪对(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物的结构进行确证。
第二步合成4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物，称取0.3684g姜黄素加入15mL无水二甲基亚砜，再加入220μL丁二酰氯和348μL N，N-二异丙基乙胺，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应4h以活化姜黄素的羟基，向圆底烧瓶中加入精密称量的7.3346g(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物，在氮气保护下继续反应48h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为1000的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于14000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，采用无水乙醇溶解并除去未反应的姜黄素，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物。利用核磁共振仪对(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的结构进行确证。
实施例2
1.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物的合成
称取0.8866g(4-羧丁基)三苯基溴化膦加入到10mL二氯亚砜后，再加入50 μL N,N-二甲基甲酰胺，90℃搅拌使反应物完全溶解并冷凝回流，反应4h以活化(4-羧丁基)三苯基溴化膦的羧基，旋转蒸发除去溶剂后，向圆底烧瓶中加入4.836g低分子量壳聚糖(聚合度为30)，并加入10mL无水二甲基亚砜溶液，继续反应48h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为1000的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于14000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物。利用核磁共振仪对(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物的结构进行确证。
第二步合成(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物，称取0.3684g姜黄素加入15mL无水二甲基亚砜，再加入220μL丁二酰氯和348μL N，N-二异丙基乙胺，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应4h以活化姜黄素的羟基，向圆底烧瓶中加入精密称量的5.7226g(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物，在氮气保护下继续反应48h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为1000的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于14000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，采用无水乙醇溶解并除去未反应的姜黄素，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物。利用核磁共振仪对(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的结构进行确证。
实施例3
1.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物的合成
称取0.8866g(4-羧丁基)三苯基溴化膦加入到10mL二氯亚砜后，再加入50 μL N,N-二甲基甲酰胺，90℃搅拌使反应物完全溶解并冷凝回流，反应4h以活化(4-羧丁基)三苯基溴化膦的羧基，旋转蒸发除去溶剂后，向圆底烧瓶中加入 3.224g低分子量壳聚糖(聚合度为20)，并加入10mL无水二甲基亚砜溶液，继续反应48h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为1000的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于14000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物。利用核磁共振仪对(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物的结构进行确证。
第二步合成(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物，称取0.3684g姜黄素加入15mL无水二甲基亚砜，再加入220μL丁二酰氯和348μL N，N-二异丙基乙胺，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应4h以活化姜黄素的羟基，向圆底烧瓶中加入精密称量的4.1106g(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物，在氮气保护下继续反应48h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为1000的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于14000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，采用无水乙醇溶解并除去未反应的姜黄素，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物。利用核磁共振仪对(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的结构进行确证。
实施例4
1.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物的合成
称取0.8866g(4-羧丁基)三苯基溴化膦加入到10mL二氯亚砜后，再加入50 μL N,N-二甲基甲酰胺，90℃搅拌使反应物完全溶解并冷凝回流，反应4h以活化(4-羧丁基)三苯基溴化膦的羧基，旋转蒸发除去溶剂后，向圆底烧瓶中加入 1.612g低分子量壳聚糖(聚合度为10)，并加入10mL无水二甲基亚砜溶液，继续反应48h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为1000的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于14000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物。利用核磁共振仪对(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物的结构进行确证。
第二步合成(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物，称取0.3684g姜黄素加入15mL无水二甲基亚砜，再加入220μL丁二酰氯和348μL N，N-二异丙基乙胺，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应4h以活化姜黄素的羟基，向圆底烧瓶中加入精密称量的2.4986g(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物，在氮气保护下继续反应48h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为1000的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于14000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，采用无水乙醇溶解并除去未反应的姜黄素，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物。利用核磁共振仪对(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的结构进行确证。
实施例5
1.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物的合成
称取0.8866g(4-羧丁基)三苯基溴化膦加入到10mL二氯亚砜后，再加入50 μL N,N-二甲基甲酰胺，90℃搅拌使反应物完全溶解并冷凝回流，反应4h以活化(4-羧丁基)三苯基溴化膦的羧基，旋转蒸发除去溶剂后，向圆底烧瓶中加入 0.966g低分子量壳聚糖(聚合度为6)，并加入10mL无水二甲基亚砜溶液，继续反应48h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为1000的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于14000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物。利用核磁共振仪对(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物的结构进行确证。取(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物10mg溶于0.5mL氘代水中，使其最终浓度为20mg/mL，用核磁共振仪记录核磁共振磷谱。结果如图2所示， (4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物的核磁磷谱中可见(4-羧丁基)三苯基溴化膦特征峰。
第二步合成(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物，称取0.3684g姜黄素加入15mL无水二甲基亚砜，再加入220μL丁二酰氯和348μL N，N-二异丙基乙胺，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应4h以活化姜黄素的羟基，向圆底烧瓶中加入精密称量的1.8526g(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物，在氮气保护下继续反应48h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为1000的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于14000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，采用无水乙醇溶解并除去未反应的姜黄素，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物。利用核磁共振仪对(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的结构进行确证。取(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物10mg溶于0.5mL氘代水中，使其最终浓度为20mg/mL，用核磁共振仪记录核磁共振氢谱。结果如图3所示，(4-羧丁基)三苯基溴化膦- 低分子量壳聚糖-姜黄素嫁接物的核磁磷谱中可见姜黄素特征峰(黑框标注)。
2.采用荧光分光光度法考察(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体和游离姜黄素在pH 7.4磷酸盐缓冲液中的溶解度：精密称取姜黄素含量为10mg的(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体 (低分子量壳聚糖的聚合物为6)和游离姜黄素，分散于10mL pH 7.4磷酸盐缓冲液中。分散液于37℃、60rpm条件下恒温震荡2天后，15000rpm离心10分钟。荧光分光光度法(Ex＝442nm，Em＝475nm，狭缝＝5.0nm，工作电压＝ 700V)分别测定离心后上清液中的(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体和游离姜黄素浓度，根据标准曲线计算pH 7.4磷酸盐缓冲液中(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物和游离姜黄素的饱和溶解度。经测定，(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的溶解度为192mg/mL，相当于该前体药物中姜黄素的溶解度为2496 μg/mL，这比游离姜黄素的溶解度(0.089μg/mL)提高了近28000倍。
3.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的体外药物释放行为：采用pH 7.4磷酸盐缓冲液(含1％Tween-80)为释放介质，取1 mL相同姜黄素浓度(100μg/mL)的(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖- 姜黄素高分子前体药物和游离姜黄素，分别置于已预处理的透析袋(截留分子量 3500)中。将透析袋放入含40mL释放介质的离心管中，于(37±0.5)℃恒温水浴振荡(60r/min)，定时取样1mL，并替换同温等量释放介质。样品经0.22μm 微孔滤膜过滤后用荧光分光光度法测定姜黄素浓度，计算姜黄素的累积释放量，同法平行测量三组。经测定，(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的释放行为如图4所示，相比于游离姜黄素，(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物中的姜黄素具有明显的缓释作用。
4.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的细胞靶向性：将人肾小管上皮细胞以5.0×104个细胞/孔的密度接种到24孔板中，孵育24小时后，分别加入(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物和游离姜黄素，分别孵育0.5和2h。用pH 7.4磷酸盐缓冲液洗涤细胞 3次后，在荧光显微镜下拍摄人肾小管上皮细胞的荧光照片。结果如图5所示， (4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的细胞荧光信号明显高于游离姜黄素组。
5.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的细胞内线粒体靶向性：将人肾小管上皮细胞以5.0×104个细胞/孔的密度接种到24孔板中，孵育24小时后，分别加入(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物和游离姜黄素，孵育2h后，加入线粒体荧光探针溶液，染色30min，荧光倒置显微镜下观察高分子前体药物于线粒体共定位情况。结果如图 6所示，相比于游离姜黄素，(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物于线粒体的共定位黄色比例更高，线粒体靶向性更好。
6.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的体内分布
采用吲哚菁绿作为荧光标记物考察(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的体内分布情况。采用脂多糖诱导来小鼠急性肾损伤模型，尾静脉注射载荧光标记物吲哚菁绿的(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物溶液0.2mL，注射后1h处死动物，取各组织脏器于小动物活体成像仪下观察吲哚菁绿标记的高分子前体药物在各组织脏器的荧光信号分布情况。结果如图7所示，高分子前体药物主要分布于肾脏和肝脏组织，且肾脏的分布量要远高于肝脏组织，其他脏器中几乎不见分布。
7.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物对急性肾损伤的治疗作用
采用脂多糖诱导构建小鼠急性肾损伤模型后，尾静脉给予(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物，并评价其体内抗炎效果。将 C57BL/6小鼠随机分为对照组、急性肾损伤组、急性肾损伤+游离姜黄素组和急性肾损伤+(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物组，在给药12h后测定动物肾功能指标(血肌酐、尿素氮)、炎症因子(肿瘤坏死因子-α和白介素-6)和氧化应激(超氧化歧化酶和丙二醛)水平。结果如图8所示，相比于游离姜黄素，(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物可显著改善急性肾损伤模型动物的肾功能(血肌酐、尿素氮)，降低肾脏组织的炎症因子(肿瘤坏死因子-α和白介素-6)和氧化应激超氧化歧化酶和丙二醛)水平。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种治疗急性肾损伤的双级靶向高分子前体药物，其特征在于，由(4-羧丁基)三苯基溴化膦、姜黄素和壳聚糖嫁接而成，高分子前体药物的化学结构式如下：
Figure 133038DEST_PATH_IMAGE001
其中，n为正整数，取值范围为6~40。
2.一种如权利要求1所述双级靶向高分子前体药物的制备方法，其特征在于，步骤如下：
1）将 (4-羧丁基)三苯基溴化膦加入到二氯亚砜中，再加入N,N-二甲基甲酰胺，加热搅拌使反应物完全溶解并冷凝回流，使(4-羧丁基)三苯基溴化膦上的羧基活化，再通过旋转蒸发除去溶剂，并加入低分子量壳聚糖和无水二甲基亚砜溶液，继续反应使(4-羧丁基)三苯基溴化膦与低分子量壳聚糖嫁接；反应结束后，纯化得到(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物；
2）将姜黄素加入无水二甲基亚砜中，再加入丁二酰氯和N,N-二异丙基乙胺，加热搅拌使反应物完全溶解，继续反应使姜黄素上的羟基活化，再加入所述的(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物，在氮气保护下继续反应使姜黄素与(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物进一步嫁接；反应结束后，纯化得到(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物。
3.如权利要求2所述的双级靶向高分子前体药物的制备方法，其特征在于，所述的步骤1）中，取0.8866g (4-羧丁基)三苯基溴化膦加入到10 mL二氯亚砜中，再加入50μLN,N-二甲基甲酰胺，90 ℃搅拌使反应物完全溶解并冷凝回流，反应4 h，活化(4-羧丁基)三苯基溴化膦上的羧基，旋转蒸发除去溶剂后，再加入0.966g低分子量壳聚糖，并加入10 mL无水二甲基亚砜溶液，继续反应48 h，完成(4-羧丁基)三苯基溴化膦与低分子量壳聚糖的嫁接。
4.如权利要求3所述的双级靶向高分子前体药物的制备方法，其特征在于，所述的步骤1）中，(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物的纯化方法为：待反应结束后，将反应产物置于截留分子量为1000的透析袋中，去离子水透析48 h，收集透析袋中的混悬液，于14000 rpm离心10 min，取其上清液进行冷冻干燥，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物。
5.如权利要求2所述的双级靶向高分子前体药物的制备方法，其特征在于，所述的步骤2）具体为：精密称取0.3684g姜黄素加入到15 mL无水二甲基亚砜中，再加入220 μL丁二酰氯和348 μL N,N-二异丙基乙胺，60 ℃搅拌使反应物完全溶解，继续反应4 h以活化姜黄素的羟基，再加入1.8526g (4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物，在氮气保护下继续反应48 h，完成姜黄素与(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖嫁接物的进一步嫁接。
6.如权利要求5所述的双级靶向高分子前体药物的制备方法，其特征在于，所述的步骤2）中，(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物的纯化方法为：待反应结束后，将反应产物置于截留分子量为1000的透析袋中，用纯水持续透析48 h；收集透析袋中的混悬液，于14000 rpm离心10 min，取其上清液进行冷冻干燥，采用无水乙醇溶解并除去未反应的姜黄素，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-低分子量壳聚糖-姜黄素高分子前体药物。
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